Name: 人类癫痫术后皮层组织的多电极阵列录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 了解人类癫痫术后皮层组织的多电极阵列录音技术，探索癫痫发作起始与传播的细胞机制。该方法可评估神经胶质相互作用对网络活动的影响，为研究抗癫痫药物效果提供平台。

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本研究得到了以下资助：N.R. 获得法国国家研究局（ANR，神经科学空白计划）、脑科学研究联合会（FRC）、巴黎市政府（新兴计划）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）和拉匹提耶-萨尔佩特里埃医院（转化研究合同）的资助；E.D. 获得法兰西岛神经科学研究中心（NeRF）的资助；G.H. 获得巴黎皮埃尔与玛丽·居里大学（UPMC，融合计划）和巴黎脑与脊髓研究所的资助。&#160;

注意：此处描述的实验方案遵循法国“国家伦理咨询委员会”（Comité Consultatif National d’Ethique）的指导方针，并已由法国国家健康与医学研究院（INSERM）登记为样本采集活动。
1. 人癫痫组织的切除
<ol>
	<li>患者
	<ol>
		<li>从患有难治性癫痫的患者中获取脑组织。手术前须获得书面知情同意。</li>
		<li>对所有接受手术治疗的癫痫患者，均需进行详尽的术前评估，包括神经系统检查、神经心理学评估、头皮脑电图（EEG）以及神经影像学检查（MRI，有时还包括 18FDG-PET 扫描 图1A），随后对切除组织进行术后组织学检查（图1B）。注意：当多种探查方法所定位的癫痫发作起始区基本一致，且切除该区域带来的获益超过手术风险时，可考虑手术治疗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外科手术
	<ol>
		<li>术前继续使用抗癫痫药物。在全身麻醉下进行手术：以吸入七氟烷（6% 输出浓度，100% 吸入分数）诱导麻醉，&#160;O2），静脉注射舒芬太尼（0.3 µg/kg）和阿曲库铵（0.5 mg/kg），随后以静脉输注舒芬太尼（0.5 µg/kg/hr）和吸入七氟烷（1 MAC）维持麻醉。</li>
		<li>使用神经导航系统以精确定位病变皮层图1C）。皮肤切开后，在骨头上钻一个骨孔&#160;随后使用高速磨钻进行开颅手术。轻轻抬起骨瓣，并用剪刀切开硬脑膜（图1D).</li>
		<li>使用术中超声辅助识别异常皮层，并在手术显微镜下使用显微外科器械和超声吸引器。</li>
		<li>根据需要凝固并切开软脑膜-蛛网膜平面&#160;脑沟边界。采用软脑膜下分离技术，将病灶周围区域的皮层从软脑膜松解。</li>
		<li>在异常皮层下方切断白质，进行整块“整块切除”，尽可能保留血管结构。避免对皮层造成创伤性操作。</li>
		<li>沿脑表面垂直方向，从切除的组织中切取一块厚度为1 cm的组织片，应包含脑沟底部及过渡区皮层。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于切片制备、孵育和记录的人工脑脊液（ACSF）
<ol>
	<li>用于切片制备的ACSF
	<ol>
		<li>配制1 L基于蔗糖的ACSF7,8，成分（单位为mM）：250 蔗糖、3 KCl、25 NaHCO3、10 D-葡萄糖、1 CaCl2、10 MgCl2；将这些盐溶解于去离子水中，并用碳合气（carbogen）充氧至少10分钟。</li>
		<li>取约700 ml蔗糖ACSF置于-80 °C下预冷50-60分钟（或-150 °C下15-20分钟）。其余溶液保持在冰上并持续充氧。注：用于切片制备的ACSF可在4 °C下保存；若如此，则在实验当天使用前冷却前再加入CaCl2和MgCl2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于切片孵育与记录的ACSF
	<ol>
		<li>至少配制3 L记录用ACSF7,8，成分（单位为mM）：124 NaCl、3 KCl、26 NaHCO3、10 D-葡萄糖、1.6 CaCl2、1.3 MgCl2；将这些盐溶解于去离子水中，并用碳合气（carbogen）充氧。在加入MgCl2前，预留部分ACSF用于在无Mg2+的ACSF中进行记录。注：孵育/记录用ACSF可在4 °C下保存；若如此，则在实验当天加入CaCl2和MgCl2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 切片孵育与记录设备
<ol>
	<li>用于脑片孵育的接口式孵育室
	<ol>
		<li>使用脑切片孵育室以维持切片的活性 离体 在界面模式下。注：该孵育室由下部和上部组成，下部包含加热元件、传感器元件和陶瓷鼓泡器，并装有蒸馏水；上部为孵育室中心的平坦区域，脑片置于该区域的镜头纸上。图2A-B).</li>
		<li>使用两条独立的细聚四氟乙烯（PTFE）管，使预充氧的人工脑脊液（ACSF）进入记录室。注意：PTFE管在加热的水中呈螺旋状走行，并延伸至记录室上部；随后溶液通过滤纸的毛细作用排出，并由镜头纸引导进入出口孔。</li>
		<li>将接口室的聚四氟乙烯管连接至蠕动泵，以实现用预充氧培养基对脑片进行持续灌流。</li>
		<li>通过使用碳合气（95% O₂, 5% CO₂）供氧，维持高氧张力。2 和5% CO2通过陶瓷鼓泡器输送该预热且湿润的气体混合物。注意：该预热加湿的气体混合物通过适当孔道进入孵育 chamber 上部的脑片所在区域。</li>
		<li>通过一根特殊的双头电缆将孵育室连接至温度控制器，以维持孵育室内上部的温度，该电缆一端带有孵育室加热元件的连接器和外部温度传感器。将传感器置于切片附近，以在孵育过程中持续监测温度图2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多电极阵列记录
	<ol>
		<li>使用平面多电极阵列，包含120个氮化钛电极（直径30 µm），以氮化硅绝缘，并配有内置参考电极，电极排列为12 × 12矩阵，中心间距200 µm。 
注：也可采用其他配置，电极直径和间距可不同。特别是可加宽MEA芯片，以采集更大尺寸的人体组织切片。</li>
		<li>使用 MEA2100-120 系统（配备前置放大器和滤波放大器，集成数据采集功能和模数转换器，16 位数据分辨率，输入电压范围和带宽可通过软件调节）并通过专用软件（MC_Rack）以 10 kHz 采样频率获取电信号。注意：MEA2100 头stage 配有金属板，可通过磁性固定装置连接可加热灌流元件，以便在记录期间持续灌流脑片。</li>
		<li>用自制的小型铂金锚固定组织于MEA上，以确保脑片与电极之间良好的电耦合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分离与切片用接口室及工具的准备
<ol>
	<li>界面室
	<ol>
		<li>用蒸馏水填充界面室的下部区域，确保水位完全浸没加热元件，并且距离室的上下部分交界处下方 2 至 4 mm。每天开启加热前应检查水位，以避免加热元件受损。</li>
		<li>将室连接至碳酰气（carbogen）气源，并配备二级流量调节器以精细调节气体压力。</li>
		<li>裁剪一张镜头纸，使其适配切片室的平坦区域，并将其放置在灌流液输入管附近，以便在液体到达脑片前使输入管路中的气泡得以逸出。</li>
		<li>剪取两段与镜头纸等长的绞合棉线，沿切片室平坦区域的主要两侧放置。注意：这有助于轻微抬高切片室中灌流液的液面。</li>
		<li>将蠕动泵的流速设定为 1 ml/min，并启动泵。</li>
		<li>开始对室底部的水进行氧合。</li>
		<li>将温度控制器设定为 37 °C 并开启。用一片封口膜（parafilm）覆盖界面室的上部，等待至少 30 分钟，使温度上升并稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖与切片工具
	<ol>
		<li>准备一套解剖工具，包括两把精细镊子、一把刮铲、一个小勺和一把刀片；两个玻璃培养皿、两把刷子以及氰基丙烯酸酯胶水。</li>
		<li>设定振动切片机（vibratome）参数：切片厚度 400 µm；频率 70 - 90 Hz；振幅 0.9 - 1 mm；切片速度 0.1 mm/sec。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 人脑皮层切片制备
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出基于蔗糖的 ACSF，混合至形成类似泥浆状。用碳氧混合气（carbogen）进行氧合，取约 250 ml 置于玻璃瓶中，并将其放入装有冰块的杜瓦瓶内，随后前往医院手术室获取组织。在此期间，将剩余 ACSF 保存在 -20 °C 冰箱中。 
	注意：手术过程中，神经外科医生会分离出一小块皮质组织。应立即将样本置于冰冻的蔗糖 ACSF 中，以便转运至实验室。</li>
	<li>确保从医院到实验室的转运时间最长不超过 30 分钟。在实验室中，从 -20 °C 冰箱取出已氧合的基于蔗糖的 ACSF，混合成泥浆状，倒入培养皿和振动切片机缓冲槽中，并开始用碳氧混合气对两者持续氧合。用勺子小心地将人脑组织从瓶中取出，放入培养皿中（图 2D）。</li>
	<li>使用镊子小心去除血凝块、血管和脑膜，以避免切片时产生阻力。从组织块边缘开始去除由软脑膜（pia-matter）构成的脑膜，注意不要损伤皮质表面。使用刀片切割组织一侧，以获得一个平整的表面，便于将其粘附在振动切片机的样品板上。注意：去除由软脑膜构成的脑膜时，应从组织块边缘开始操作，注意避免损伤皮质表面。</li>
	<li>如果组织块大于 MEA 腔室，应在将其粘附到样品板前，先切割成合适尺寸的组织块（图 2E）。</li>
	<li>将组织粘附固定，以便获得横切向皮质切片，放入缓冲槽中，以低速（0.1 mm/sec）切割出厚度为 400 µm 的切片（图 2F）。</li>
	<li>用与切片尺寸相同的镜头纸裁成小片；使用刮铲和毛刷将切片转移至这些镜头纸上，并在界面式孵育室中于 37 °C 下孵育至少 1 小时，之后再开始记录（图 2G–I）。在使用前，持续保持切片处于相同条件下保存。注意：将切片置于镜头纸上是关键步骤，有助于切片底部的灌流以及在记录前从界面式孵育室中顺利取出切片。
	<ol>
		<li>在将切片转移至镜头纸时，需极其小心操作，避免毛刷接触皮质层区域。</li>
		<li>每次仅准备一片切片，并立即转移至界面式孵育室中，以确保充分的氧气供应和温度控制；应尽快完成对切除组织块的全部切片操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 记录用多电极阵列装置的准备
<ol>
	<li>将灌流系统连接至蠕动泵，将MEA系统连接至计算机。对记录用人工脑脊液（ACSF）进行氧合。将一片空的MEA芯片放入放大器中。</li>
	<li>设置温度控制器，使MEA腔室中的加热套管元件达到37 °C，并以5–6 ml/min的流速开始灌流。注意：通常需要将设定温度比目标温度高3–4 °C，具体取决于室温和流速。
	<ol>
		<li>使用精密温度计检测MEA腔室内的温度，将温度计尽可能靠近腔室中心放置，但不要接触电极区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动记录软件，检查所有MEA电极是否连接良好，并确认灌流未引起噪声干扰。</li>
	<li>启动MEA_Monitor程序，检查显微镜载物台相机系统的运行状态。</li>
</ol>
7. 将切片从界面室转移至MEA芯片以进行记录
<ol>
	<li>将一些预热的记录用人工脑脊液（ACSF）倒入玻璃培养皿中；用镊子通过镜片纸夹取一片脑片，将其放入培养皿中。小心地将脑片从镜片纸上分离。如果在孵育期间精确调节界面式孵育槽中液体的液面高度，则只需将脑片浸入溶液中即可使其自动脱离镜片纸；否则，可使用小毛刷辅助分离。</li>
	<li>向MEA芯片中加入一些ACSF，并用刮勺将脑片转移至芯片内。使用塑料巴斯德吸管轻轻吸除溶液，使脑片贴附于电极区域，并用铂金固定锚将其固定。加入1 ml记录用ACSF，将MEA芯片放入放大器中，并以5–6 ml/min的速度开始灌流（图2J–L）。</li>
	<li>使用MEA_Monitor检查脑片在MEA记录区域的位置，如有必要，进行调整以确保可记录到皮层各层的信号，并拍摄图像。开始记录。</li>
</ol>

<ol><li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+pre-ictal+discharges+emerge+at+the+transition+to+seizure+in+human+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy.</a> Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).</li>
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<li>Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Approach+for+Reliably+Investigating+Hippocampal+Sharp+Wave-Ripples+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro.</a> PLoS ONE. 4 (9), (2009).</li>
<li>Hájos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
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<li>Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+alterations+in+GABA+signaling+disrupt+hippocampal+network+activity+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain.</a> The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).</li>
<li>Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+Behavior+in+the+Initiation+of+Hippocampal+Population+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts.</a> Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).</li>
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<li>Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anticonvulsant+drugs+on+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons.</a> Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).</li>
<li>Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paroxysmal+epileptiform+discharges+in+temporal+lobe+slices+after+prolonged+exposure+to+low+magnesium+are+resistant+to+clinically+used+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+research%22%5BJournal%5D)">Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants.</a> Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+-+EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
</ol>

本视频的制作及开放获取出版由Multichannel Systems提供资助。

耐药性癫痫是一种罕见病症，可通过人体组织进行研究 体外这使得研究癫痫患者的大脑皮层成为可能，该组织表现出某些特定缺陷，而这些缺陷在动物模型中仅能部分重现。本文所述方法可用于制备和记录人类术后脑组织 离体 保持细胞活性和网络结构完整，使其能够自发产生癫痫样活动。保留与记录到的活动相似的特性 体内 研究病理性活动发生机制至关重要。此外，此类方法可用于探索人体组织，避免依赖并不完善的疾病动物模型。然而，人体组织研究需要神经外科医生与实验实验室之间的密切配合。组织运输过程中需采取特殊措施，避免造成机械性损伤。此外，可用的标本数量和组织量均十分有限。最后，获取合适的对照组织是主要难题。在此制备条件下，术后组织在正常人工脑脊液（ACSF）中可自发产生类似痫样间歇期的放电活动。7,8在改良的致惊厥人工脑脊液（proconvulsive ACSF）中也可诱发类似发作的事件，从而可研究癫痫发作的启动机制以及从发作间期向发作期的转变过程。
在界面条件下，人体组织可保持活性长达10小时。当观察到多单位放电或场电位自发出现，并且通过提高细胞外钾浓度和/或降低镁浓度以增强兴奋性后可诱发出相应活动时，即认为脑片具有活性。尽管活动存在变异性，这可能反映了不同病理状态和皮层区域之间的差异，但我们仅在显示自发性发作间期放电及可诱发发作期放电的健康脑片中探讨组织的致痫特性。为了维持组织的活力和电活动，采用界面式孵育槽在36–37 °C下保存脑片，使其在使用MEA系统记录前完成恢复。事实上，多个研究团队已明确证实，与传统的烧杯式储存相比，基于界面的储存系统在维持神经网络活动（如自发的尖波-涟波或胆碱能诱导的振荡）方面具有显著优势，且温度对这些活动的保持至关重要9,10。此前已有研究利用界面储存方法记录来自人海马和下托脑片的癫痫样电活动1,11。在当前的MEA技术中，脑片经界面条件恢复后，将在浸没式条件下、以高流速（5–6 ml/min）和37 °C环境中，使用MEA系统记录其网络电活动。MEA芯片较小的直径（1.8 cm）形成一个容积较小的记录腔室（&#60;1.5 ml），结合较高的灌流速度，显著改善了脑片的供氧状况，而供氧已被证明是维持自发性和药理诱导性网络电活动的关键因素9,10。此外，循环ACSF用量的减少也有利于开展药理学测试。
然而，切片过程会对组织造成损伤12。神经元结构和氯离子稳态在组织表面（50 µm）均出现紊乱。MEA芯片记录到的电活动主要来自组织表层，无法深入采样，因此这些信号可能源于受损区域。然而，我们的数据显示，局部检测到的细胞外场电位可在大多数MEA电极上记录到，且已有研究证明这些信号是在距离记录位点100至200 µm范围内整合产生的13，这表明在本实验体系中记录到的癫痫样发作活动不太可能来源于受损区域。此外，在使用钨电极进行的可深入穿透组织的研究中，人类脑组织记录到的癫痫样活动与癫痫患者中观察到的活动相似1,7,8。
另一个局限性是 离体 组织记录的一个局限是不同脑区间连接的中断，从而限制了动态神经调节。这或许可以解释为何在此类组织中无法自发记录到类似痫性发作的事件，而需要通过离子操控或药理学刺激增强兴奋性来触发。因此，在本方案中，通过联合改变细胞外K+ 从 3 到 6 mM 以及外部 Mg 的减少2+ 从 1.3 mM 到 Mg2+-无 ACSF，以增强组织兴奋性并去除 Mg2+依赖性NMDA受体阻断。事实上，先前已有研究证实，使用Mg²⁺诱导人新皮层和海马脑片产生癫痫样活动2+-无钙人工脑脊液（ACSF）中记录到的电图性癫痫发作相似 体内14此外，已有研究表明，在长时间暴露于Mg后，从颞叶脑片中记录到的癫痫样放电会对临床常用的抗惊厥药物产生耐受性。2+无自由基 ACSF15,16从而为研究耐药性癫痫样发作事件提供了一个模型 体外.
多电极阵列（MEAs）可用于记录场电位以及由神经元动作电位组成的多单元放电活动 离体因此，与探索由神经元群体同步活动产生的场电位的脑电图（EEGs）相比，微电极阵列（MEAs）是一种更强大的电生理学工具。 体内，但无法获取单个神经元的行为信息17尽管更新型的微电极能够记录 体内 由神经元动作电位组成的多单元放电活动，具有侵入性，因此其应用主要局限于颅内记录期间的研究目的。特别是，微电极阵列（MEA）记录技术是研究癫痫事件时空模式、控制发作起始与传播的机制以及传统和新型抗癫痫药物作用的首选方法之一。值得注意的是，为了揭示癫痫样放电的细胞类型及其信号传导基础，应将尖峰分类技术与药理学检测相结合应用于MEA记录。尽管MEA能够获取单个动作电位，但其无法提供有关突触特性及生物物理特性的信息。未来，应将其他技术与MEA记录相结合，以更全面地采样细胞行为、神经网络活动及突触信号传递。例如，可将用于揭示神经元或胶质细胞行为以及离子动态变化的荧光成像技术与MEA记录相结合。此外 事后检验 组织学分析还可揭示特定细胞类型、蛋白质或受体的具体改变，从而将癫痫活动的定位与神经结构的特定重组相关联。MEA系统还可嵌入膜片钳装置中，以实现单个细胞或电导活动与群体活动之间的关联分析。未来，若能像培养器官型脑片一样实现人脑组织切片的长期培养，则可应用光遗传学工具，对特定细胞类型进行转染或感染操作。

癫痫是一种慢性疾病，其特征是癫痫发作，即在脑电图（EEG）记录中表现为持续数秒至数十秒的间歇性节律性放电，并伴有临床症状，这些发作会打断以持续数十毫秒的同步神经元放电为特征的发作间期状态，这些短暂的电活动被称为发作间期事件1。癫痫影响全球约1%的人口，尽管大多数患者的发作能够得到控制，但仍有约三分之一的癫痫患者对抗癫痫药物反应不佳2。在这种被称为药物难治性癫痫的状况中，其潜在机制尚未明确阐明，针对被确定为发作起始区的脑部特定区域进行手术切除，仍是唯一可为患者带来积极疗效的替代治疗方法。因此，手术切除的脑组织标本为在离体（ex vivo）条件下研究人类中枢神经系统中发作间期放电的发生机制、癫痫发作的产生与传播机制以及药物耐药性提供了宝贵的机会。
多电极阵列（MEA）由空间分布的微电极组成，能够同时对组织多个位点进行电生理活动的刺激与记录，从而为研究自发性和诱发性活动的时空模式提供了优良的技术手段。该技术最初用于监测神经元细胞培养活动中发育变化3，随后被改进用于急性及器官型脑片和脊髓片的记录4–6，目前已被视为一种重要的电生理学研究工具。
本方案详细介绍了如何从手术切除的人脑皮层组织制备人脑皮层切片，并利用多电极阵列（MEA）可靠地记录这些切片中离体的ex vivo 间歇期放电及类癫痫发作事件。因此，该技术为研究癫痫样活动的起始、传播机制以及抗癫痫药物在细胞和神经网络水平上的作用提供了有效手段。文中详尽描述了获取、制备、维持和记录人脑切片所涉及的全部操作步骤。

<table><tbody><tr><td>脑切片孵育室-2：界面式</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>S-BSC2</td><td>需另配独立的温度控制器</td></tr><tr><td>双通道温度控制器</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>TC02</td><td>可同时连接并使用两个界面式孵育室。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于将TC01与带外部参考PT100的S-BSC2连接的专用电缆</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>CA3</td><td>参考PT100置于切片附近&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带PT100的6针插头连接器</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>TS-PT100</td><td>CA3电缆的外部参考装置</td></tr><tr><td>用于从120通道微电极阵列记录数据的MEA工作站</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>MEA2100-120</td><td>包含MEA2100-120前置放大器和MEA2100接口板。www.multichannelsystems.com</td></tr><tr><td>适用于MEA2100-120的微电极阵列</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>120MEA200/30</td><td>电极间距：200 &amp;micro;m；电极直径：30 &amp;micro;m；玻璃环高度：6 mm。可提供不同配置（间距、直径、环）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>视频显微镜台</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>MEA-VMT-1</td><td>台下配备视频显微镜，用于对放置在台面上的放大器中的MEA电极区域成像，并将图像传输至计算机。</td></tr><tr><td>灌流套管</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>PH01</td><td>可加热灌流套管，内置温度传感器；温度可通过TC02控制器编程调节</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td></td><td>用于数据采集与记录的软件</td></tr><tr><td>磁性灌流固定架</td><td>Multichannel Systems, Germany</td><td>MPH</td><td>用于固定PH01组件的磁性灌流固定架，可将灌流系统连接至放大器接地端</td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td></td><td>数据分析软件；info@neuroexplorer.com</td></tr><tr><td>蠕动泵（驱动单元）</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>0.01 至 48 rpm</td></tr><tr><td>蠕动泵（泵头）</td><td>Gilson</td><td>F117800</td><td>R2 双通道</td></tr><tr><td>超声吸引器</td><td>Integra Life Sciences, USA</td><td>Cusa Excel +</td><td>可用于皮层的钝性软脑膜下分离</td></tr><tr><td>神经导航系统</td><td>Isis Solutions, France</td><td>Surgiscope</td><td>可在术前MRI上实时识别脑结构</td></tr><tr><td>振动切片机 HM 650 V</td><td>Microm</td><td></td><td>将组织块切片为厚度400 &amp;mu;m的切片</td></tr></tbody></table>

人脑癫痫术后皮层组织的多电极阵列记录

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

癫痫影响着约1%的人口，是一组以周期性发作、干扰正常脑功能为特征的神经系统疾病。尽管目前已有针对神经元功能的抗癫痫药物进行治疗，但仍有三分之一的癫痫患者对药物治疗无反应。在此情况下，手术切除产生癫痫发作的脑区仍是唯一的替代治疗方法。近10年来，对人类癫痫组织的研究有助于揭示新的致痫机制。事实上，这些组织能够产生自发的发作间期癫痫样放电，以及可通过药物诱导的发作期样事件，并可利用经典电生理技术进行记录。值得注意的是，多电极阵列（MEAs）是一种微加工装置，其嵌入了空间排列的多个微电极，能够同时刺激并记录来自组织不同区域的场电位以及多个神经元的动作电位。因此，MEA记录为研究自发发作间期和诱发性类发作事件的空间-时间模式，以及癫痫发作起始与传播的机制提供了极佳的方法。本文将介绍如何制备手术切除所得的人类大脑皮层脑片，并在离体条件下使用MEA记录发作间期和类发作期事件 ex vivo。

在用正常的记录用人工脑脊液（ACSF）灌流组织时，开始记录人脑皮层脑片的活动7,8。在此条件下，若组织在手术过程中以及随后从医院转运和脑片制备过程中保存良好，则可观察到自发性活动，表现为类似痫样间歇期的小型事件，由MEA电极的小簇阵列检测到。类似间歇期的放电表现为场电位，通常为双相，包括一个初始的尖锐负向偏转，幅度可达数十微伏，随后是一个持续数十毫秒的较长反向波。快速的多单位活动通常嵌入在场电位中，主要集中在初始部分。图3Aii展示了一个典型的类似间歇期活动的示例，显示了MEA电极记录的信号轨迹。
记录癫痫发作 体外 人脑皮层切片需要灌流“致癫痫性”人工脑脊液（ACSF），其中 Mg2+ 不存在且 K+ 升高至6 mM，以增强组织兴奋性1 （K的增加）+ 单独使用3至6 mM的浓度不足以诱发癫痫发作；数据未显示）。一旦用0 Mg进行灌流2+ 6 mM K+ ACSF 开始灌流后，皮层切片的活动逐渐增强，并在 15 至 20 分钟内出现首次癫痫样放电（15.4 ± 1.7 分钟， n = 10，来自5位患者； 图3 Ai）。我们诱发了类似发作的活动，如图所示 图3在75%的受试患者和66.7%的所有记录切片中。
通过MEA芯片的相邻电极记录癫痫样活动，比较场电位事件的起始动力学特征，可研究其发生部位及传播路径。图3B展示了从人脑皮层切片中使用MEA系统记录到的一次典型癫痫发作（单个MEA电极记录到的癫痫发作代表性轨迹在图3 Aiii中以更高的时间分辨率显示）。请注意，该癫痫发作几乎在MEA芯片的所有电极上均有记录，表明其能够在广泛的皮层区域中传播。此外，通过观察每个电极记录的单个轨迹，可以发现癫痫发作在组织中的逐步传播过程：发作首先起始于覆盖电极阵列右半侧的皮层区域，随后逐渐扩散至覆盖左半侧的区域（即，比较电极L6和B6的轨迹；图3B）。
<img alt="脑外科手术序列；MRI扫描、组织显微图像、手术设置和开颅手术。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：皮质发育不良及其手术切除。 术前MRI上可见左侧额叶脑沟内嵌入的Taylor型局灶性皮质发育不良（白色箭头）(A)，术后通过组织学检查进一步证实 (B)（MAP激酶标记；比例尺：200 μm），显示皮质层状结构紊乱、异常神经元以及白质下层中神经元迁移不完全的轨迹。术中根据MRI数据使用神经导航系统定位发育不良病灶 (C)。术中显示包含发育不良的脑回 (D)。
<img alt="电极制备流程，图片展示了实验装置和电极原型。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：人脑皮层切片制备的设备与操作流程。 使用界面式孵育槽在体外维持人脑皮层切片 ex vivo（A）；切片置于孵育槽上部平坦区域的镜纸片上（B），此处放置一个温度传感器（C，左），通过双头电缆与温度控制器相连（C，右，上），以在整个孵育过程中保持 37 °C 的恒温（C，右，下）。获取组织后，将切除的脑组织块放入盛有冰冻蔗糖型人工脑脊液（ACSF）的培养皿中（D），并清除血凝块、血管和脑膜，以利于后续切片。若组织块大于多电极阵列（MEA）孵育槽的尺寸，需使用刀片切取适当大小的组织块（E），并将其粘附于振动切片机的样品载板上（F）。切取厚度为 400 µm 的切片，借助刮匙（G）将其转移至镜纸片上（H），然后放入界面式孵育槽中孵育（I）。记录前，将切片浸入盛有 ACSF 的培养皿中，去除镜纸，并用刮匙将切片转移至盛有 ACSF 的 MEA 芯片上（J）。吸除液体，使切片贴附于 MEA 表面（K），并使用铂金固定锚将其固定。将 MEA 芯片放入放大器中（L），开始灌流并记录信号。
<img alt="电生理学数据；波形图；皮层表面网络中的神经活动分析。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：人脑皮层切片中癫痫发作的多电极阵列（MEA）记录。 (A) 图 i 显示了由 MEA 电极记录的人脑皮层切片活动的一个代表性轨迹。在正常人工脑脊液（ACSF）条件下，可观察到类似痫样间歇期的自发性活动（小灰色矩形框，放大显示于图 ii）；当开始灌注无镁离子（0 Mg2+）且含 6 mM 钾离子（6 mM K+）的 ACSF 后，约 15 分钟延迟后出现首次癫痫样发作，随后以每 2–3 分钟一次的频率持续发生。图 iii 展示了图 i 中大灰色矩形框内的癫痫发作事件，并采用放大时间尺度显示。蓝色轨迹表示如蓝线及箭头所指示区域的进一步放大活动。图 iv 显示了图 iii 数据经 250 Hz 高通滤波后的结果，进一步放大后（蓝色轨迹）可见多单元放电活动。(B) 在 0 Mg2+ 6 mM K+ ACSF 条件下，来自全部 MEA 电极的癫痫发作代表性记录。每个方块代表 12 × 12 MEA 阵列中的一个电极，显示 80 秒的时间窗口；虚线表示皮层表面相对于 MEA 阵列的位置。

本文详细介绍了如何对人类癫痫皮层组织进行多电极阵列记录。具体演示了癫痫组织切除、脑片制备以及间歇期和发作期事件的多电极阵列记录过程。

癫痫影响约1%的人口，是一组以周期性发作为特征的神经系统疾病，发作表现为……

本实验的总体目标是对人类癫痫皮层组织进行离体、发作间期及类发作事件的多电极阵列记录，从而在细胞和网络水平上研究癫痫活动的基本机制、发作起始与传播过程以及抗癫痫药物的作用效果。该目标的实现首先需要在手术过程中仔细切除药物难治性癫痫患者的人皮层组织；第二步是在切片前清除血凝块、血管、脑膜以及多余的白质组织。接下来，将组织块切成400微米厚的切片。最后一步是将切片置于高氧合、温度可控且缓慢灌注的界面条件下孵育。最终，采用多电极阵列技术记录类似自发性癫痫样放电活动以及诱发的类似癫痫发作事件。我们的实验室致力于研究神经胶质相互作用在脑部生理病理学中的作用，以探讨神经细胞如何在人体内产生病理性的网络活动。近期，我们与颈部护理医院和拉皮斯医院合作，建立了针对人类癫痫患者术后皮质组织的多电极阵列记录技术。今天，颈部护理医院的神经外科医生托马斯·布洛（Thomas Blo）、拉皮斯医院的癫痫学家兼研究员费尔德（Feld）以及我实验室的博士后研究员埃琳娜·DOI（Elena DOI）将向您演示如何开展并有效利用此类技术。从人类癫痫组织的采集到离体条件下的多电极阵列（MEA）记录，利用人类皮质组织进行癫痫治疗（ECT）使得研究人员能够直接探索功能保持的人类癫痫神经元和胶质细胞，这些细胞以特定的网络形式相互连接。体外研究中，人类组织可提供对单个细胞及网络活动、离子机制的深入观察，而这些机制在体内研究中无法完全阐明。对人类皮质组织进行MEA记录有助于回答癫痫研究领域中的关键问题，例如癫痫发作起源的细胞机制以及癫痫放电传播的机制。该技术对局灶性癫痫及其治疗具有重要意义，因为它有助于理解药物抵抗的机制以及抗癫痫药物对人脑皮层切片中记录的类发作事件的影响（体外实验）。与现有方法（如脑电图或体内微电极）相比，多电极阵列的主要优势在于，它能够以非侵入方式同时对组织的多个位点进行场电位和多单位活动的刺激与记录。开始实验操作时，首先用蒸馏水填充界面式孵育槽的下部，然后将孵育槽连接至碳酰气源。接着，剪取一片滤纸以适配切片槽的平坦区域。将其放置在进样管旁边，以便气泡在到达脑片前从进样管路中逸出。随后，剪取两段与镜头纸长度相同的绞合棉线，置于灌流 chamber 平面区域的两侧，并将蠕动泵的流速设置为每分钟 1 毫升。随后开启腔室底部水体的氧合。然后将温度控制器设定为37摄氏度。用一块对二甲苯薄膜覆盖接口腔室的上部，并等待至少30分钟，使温度上升并稳定。现在准备解剖工具，包括两把精细镊子、一把刮刀、一个小勺、一把刀片、两个玻璃培养皿、两把刷子以及氰基丙烯酸盐胶水。接下来，通过设置切片参数来准备振动切片机。在此步骤中，将预先配制的基于蔗糖的人工脑脊液从零下80摄氏度的冰箱中取出，并将其压碎成泥状。用碳酰气（carbogen）对其进行氧合。然后将 250 毫升 A 型人工脑脊液冰浆转移至玻璃瓶中，并将其置于装有冰块的保温瓶内，用于手术室中的组织采集。在标准全身麻醉下，使用神经导航系统精确定位大脑皮层。随后，在皮肤上做一切口，然后在颅骨上钻孔，接着进行开颅手术。接下来，轻柔抬起骨瓣，并用剪刀切开硬脑膜。随后对癫痫皮层进行整块切除，避免广泛电凝。切下一厘米厚的皮层组织块，并将其放入冰冷的、含氧的蔗糖配制人工脑脊液（A CSF）中。随后，尽快将组织连同冰冷的蔗糖配制含氧A CSF一起运回实验室，注意避免机械震动。现在，用蔗糖配制的含氧A CSF冰浆填充培养皿和振动切片机的缓冲槽，并持续用碳合气（carbogen）为A CSF冰浆供氧。然后用勺子小心地将组织从瓶中取出，并置于培养皿中。使用镊子仔细去除血凝块、血管和脑膜，以避免切片过程中产生阻力。用刀片切割组织的侧面，以获得与组织对侧尽可能平行的平整表面。然后将组织粘附到振动切片机的样品板上，以制备横断面皮层切片。随后将其放入缓冲槽中，以低速切割成400微米厚的切片。接下来，用刮勺和毛刷切取几小片镜片纸。将这些晶状体组织切片转移至界面式孵育槽中，在记录前于37摄氏度下孵育至少一小时。在此步骤中，将灌流系统连接至蠕动泵，将MEA系统连接至计算机。然后将一个空的MEA芯片放入放大器中。接着，将MEA腔室中导管元件的温度控制器设定为37摄氏度。以每分钟5至6毫升的速度开始灌注含氧人工脑脊液（aCSF）。然后，打开记录软件。确保所有MEA电极连接良好，并且灌流未引起噪声。现在将一些预热的记录用人工脑脊液倒入玻璃培养皿中。用镊子夹取镜片纸，将切片从界面室转移到培养皿中。然后通过将镜片纸浸入溶液中，小心地使切片脱离镜片纸，或使用小刷子辅助分离。接着，用一些人工脑脊液（A CSF）填充MEA芯片。使用带有塑料移液管的刮铲将脑片转移至MEA芯片上。轻轻吸去溶液，使脑片黏附于电极区域，并用铂金锚固定。随后，向MEA芯片中加入1毫升记录用人工脑脊液，并将其置于放大器中。然后以每分钟5至6毫升的速度开始灌流。接下来，检查切片在MEA记录区域中的位置，必要时通过MEA监测软件进行调整。为了记录皮层各层的信号并进行成像，开始记录。这是通过MEA电极记录的人脑皮层脑片活动的一个代表性轨迹。在正常人工脑脊液中，灌流无镁、含6毫摩尔钾的人工脑脊液15分钟后，可观察到类似发作间期的自发性活动。首次发作出现后，每隔两到三分钟相继发生其他事件。蓝色轨迹显示了放大后的活动情况。该图展示了以250赫兹高通滤波的数据，放大后可观察到多单元活动，此处为无镁条件下所有MEA电极记录到的一次典型癫痫发作的代表性记录。6 毫摩尔/升钾离子人工脑脊液。每个方格代表一个 12×12 多电极阵列（MEA）中的电极，并显示第 82 个时间窗口。虚线表示相对于 MEA 阵列的皮层表面位置。观看本视频后，您应充分了解如何安全转运人脑皮层组织、制备并保存有活性的皮质类器官，以及记录自发性和诱发性癫痫活动的MEA（多电极阵列）信号。在实施该操作过程中，医院临床团队与实验室研究人员之间的密切协作至关重要。切勿忘记，操作人体组织可能存在生物安全风险，必须始终采取防护措施，例如佩戴手套，以避免可能的传染性疾病暴露。在本操作基础上，还可结合其他技术，如荧光成像、膜片钳记录、峰电位分选及组织学分析，与MEA记录相结合，以关联突触特性、单细胞行为、离子动态变化以及细胞与分子异常与群体电活动之间的关系。对人类癫痫组织进行MEA记录可为研究人员探索病灶性癫痫提供途径，有助于阐明癫痫发生及药物抵抗的机制，以及神经元-胶质细胞相互作用在这一现象中的作用。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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