小鼠骨髓破骨细胞的推导
2014年11月6日
破骨细胞是体内的主要骨吸收细胞。一个分离的破骨细胞中大量的能力已经导致破骨细胞生物学的理解显著进步。在这个协议中，我们描述了一种用于分离，培养和定量破骨细胞的体外活性。
该程序的总体目标是从小鼠骨髓中大量分离破骨细胞。这是通过首先从安乐死的小鼠身上收集骨头来实现的。接下来，通过使用研钵和研杵在事实缓冲区中压碎骨骼，将细胞从骨髓中释放出来。
然后将骨髓溶液分层到密度梯度细胞分离培养基上，进行密度梯度细胞分离。最后，吸出含有感兴趣细胞的层，并将细胞置于骨髓微噬细胞诱导培养基中。最终，陷阱染色用于显示大量破骨细胞的存在。
该技术的影响延伸到与破骨细胞功能改变相关的疾病，其严重程度从由于未能形成造血骨髓空间而导致的致命新生儿疾病到更常见的病理，例如骨质疏松症，因为它产生了一种从小鼠骨髓中分离大量破骨细胞的可靠方法。首先，将 10 mL 市售的密度梯度池分离液放入 50 mL 锥形管中，中等至室温。在室温下放置 50 mL 等分试样的传真缓冲液，与密度梯度细胞分离培养基一起使用。
在准备额外的培养基并对 C 57 black six 小鼠实施安乐死后，根据文本方案，将鼠标放在解剖板上并使用 70% 乙醇。要喷洒它，请收获 fera tibia hum eye and spine。然后将骨头放在冰上的事实缓冲区中。
接下来，使用干净的纸巾从骨骼上去除肌肉和软组织。将骨头放入研钵和研杵中，加入 3 毫升事实缓冲液，然后轻轻压碎。然后吸出带血的液体，并通过 70 微米的过滤器进入 50 毫升的锥形管中。
在压碎的骨头中再加入 5 毫升效果缓冲液并进一步压碎，然后将液体通过过滤器转移到 50 毫升试管中。继续此过程，直到液体不再染成红色，然后在 4 摄氏度下以 200 Gs 的浓度沉淀骨髓 5 分钟。要进行梯度分离，请从细胞沉淀中吸出上清液，并使用 10 毫升传真缓冲液进行复苏。
悬浮沉淀，将室温密度梯度细胞分离培养基的锥形管倾斜至约 30 度，并使用电动移液器，移液器尖端靠在管的内顶面上。使用室温离心机将骨髓溶液缓慢分层到培养基上，不要加速或减速。以 200 Gs 离心梯度 15 分钟。
然后吸出包含目标细胞的混浊中间层，并将它们转移到新的锥形管中。加入 20 毫升冰冷的传真缓冲液以洗涤细胞。然后在细胞计数后使用 1 毫升骨髓微噬细胞刺激培养基重悬最终细胞沉淀。
将 2 mL 微噬细胞刺激培养基放入 24 孔板的每个孔中。然后向每个孔中加入 200， 000 个细胞，该细胞密度将确保足够的体外破骨细胞培养。轻轻搅拌板并在 37 摄氏度下孵育三天，不要更换培养基。
第 3 天后，将培养基更换为骨髓破骨细胞诱导培养基，并开始每天更换，持续 5 至 7 天。此时应可见大型多核破骨细胞。请参阅文本方案进行染色和再吸收测定，如下所示。
使用酒石酸盐抗性测定法可以确认大量破骨细胞。使用本视频中演示的方案，磷酸盐染色破骨细胞可视化为具有多个细胞核的大紫色细胞。分离出每个细胞多达 30 个细胞核的破骨细胞是很常见的。
使用矿化表面被认为是在体外评估破骨细胞再吸收活性的金标准方法。在该图中，10 倍放大倍率的明场显微镜显示了形成黑色轮廓的矿化表面或再吸收坑的百分比，这允许确定破骨细胞的再吸收能力。观看此视频后，您应该对如何从小鼠骨髓中可靠地分离大量破骨细胞有了很好的了解。
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概述
本协议概述了从小鼠骨髓中大量分离破骨细胞的方法。该过程包括采集骨骼、释放细胞以及使用密度梯度分离法获得破骨细胞以进行进一步研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 骨生物学
- 细胞分离技术
- 破骨细胞活性定量
背景
- 破骨细胞对于骨吸收至关重要。
- 了解破骨细胞生物学对于洞察骨骼疾病至关重要。
- 分离技术推进了这些细胞的研究。
- 本协议旨在提高破骨细胞的研究产量。
研究目的
- 从小鼠骨髓中分离破骨细胞。
- 在体外培养破骨细胞以进行实验分析。
- 使用特定的染色方法定量破骨细胞活性。
使用的方法
- 从实验小鼠中采集骨骼。
- 在facts缓冲液中压碎骨骼以释放细胞。
- 进行密度梯度细胞分离。
- 使用骨髓巨噬细胞诱导培养基进行细胞培养。
主要结果
- 成功大量分离破骨细胞。
- 有效的体外培养破骨细胞。
- 通过trap染色显示破骨细胞的存在。
- 实现了破骨细胞活性的定量。
结论
- 该协议提供了一种可靠的破骨细胞分离方法。
- 它促进了对破骨细胞生物学的进一步研究。
- 在研究骨相关疾病方面的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable in vitro derivation of osteoclasts from mouse bone marrow enables high-confidence interrogation of bone resorption mechanisms and disease-relevant cellular phenotypes. This capability is critical for target validation and mechanistic de-risking in early-stage bone disease drug discovery. The method supports portfolio decisions by providing scalable access to functional osteoclasts for quantitative assessment of therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of bone resorption hypotheses in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating osteoclast-specific effects.
- Facilitates functional target validation for bone disease pathways.
- Provides a platform for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Generates validated osteoclast populations for downstream resorption assays.
- Enables standardization of quantitative TRAP staining and resorption pit assays.
- Supports reproducible, scalable workflows for compound screening.
- Allows for robust evaluation of osteoclast-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro osteoclast function with disease-relevant bone remodeling endpoints.
- Provides continuity from cellular mechanism to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of bone-targeted therapeutic candidates.
- Supports translational biomarker development for bone resorption activity.
Pipeline & Workflow Integration
This osteoclast derivation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational studies in bone biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of osteoclast-mediated bone resorption mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for compound or genetic screening.
- Analytics: Enables measurement of multinucleation, TRAP positivity, and resorptive capacity for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo bone remodeling and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for osteoclast isolation across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bone resorption target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible osteoclast cultures at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality for bone disease programs by reducing biological ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of osteoclast-targeted therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and bone marrow handling.
- Needs access to density gradient separation and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of TRAP staining and resorption assays.
- May require adaptation for different mouse strains or disease models.
- Dependent on careful quantification and validation of osteoclast identity and function.
