小鼠骨髓来源的破骨细胞分化

本实验的总体目标是从小鼠骨髓中大量分离破骨细胞。首先通过采集安乐死小鼠的骨骼来实现这一目标，随后使用研钵和研杵在裂解缓冲液中研磨骨骼，从而释放骨髓中的细胞。

然后将骨髓溶液铺在密度梯度细胞分离介质上，进行密度梯度细胞分离。最后，吸出含有目的细胞的层面，并将细胞置于骨髓巨噬细胞诱导培养基中。最终通过TRAP染色显示大量破骨细胞的存在。

该技术的影响涉及与破骨细胞功能异常相关的疾病，其严重程度可从因无法形成造血所需的骨髓腔而导致的致死性新生儿疾病，到更为常见的骨质疏松症等病理状态，因为它提供了一种可靠的方法，可从鼠类骨髓中分离出大量破骨细胞。首先，将10毫升市售的密度梯度细胞分离介质加入50毫升锥形管中，恢复至室温。同时将50毫升fax缓冲液置于室温，以备与密度梯度细胞分离介质共同使用。

根据文本方案，在配制额外培养基并对 C57BL/6 小鼠实施安乐死后，将小鼠置于解剖板上，并使用 70% 乙醇进行喷洒消毒。随后采集股骨、胫骨、肱骨、眼球和脊柱，将骨骼置于冰上的 FACS 缓冲液中。

接下来，使用干净的纸巾将骨骼上的肌肉和软组织清除干净。将骨骼放入研钵中，加入3 mL裂解缓冲液，轻轻研磨破碎。然后吸取带有血迹的液体，通过70 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中。

向研磨后的骨组织中再加入 5 毫升裂解缓冲液，进一步研磨，然后将液体通过滤网转移至 50 毫升离心管中。重复此操作，直至液体不再呈现红色为止，随后在 4°C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，收集骨髓细胞沉淀。进行梯度分离时，吸除细胞沉淀上的上清液，并用 10 毫升 Fax 缓冲液重悬细胞。

将沉淀重悬，将装有室温密度梯度细胞分离介质的锥形管倾斜至约30度，并将电动移液器的吸头紧贴管内壁顶部。使用室温离心机，无加速度或减速度，缓慢将骨髓溶液铺加到介质上。以200 G离心15分钟。

然后吸除含有目标细胞的浑浊中间层，并将其转移至新的锥形管中。加入20毫升冰冻的fax缓冲液洗涤细胞。细胞计数后，用1毫升骨髓巨噬细胞刺激培养基重悬最终的细胞沉淀。

将2毫升巨噬细胞刺激培养基加入24孔板的每个孔中。然后向每孔加入200,000个细胞，该细胞密度可确保体外破骨细胞培养充分。轻轻振荡培养板，并在37°C下孵育，三天内不更换培养基。

第三天后，更换为骨髓来源的破骨细胞诱导培养基，并开始每天换液，持续五至七天。此时应可见大量多核破骨细胞。染色及骨吸收实验的具体操作请参考文本版实验方案。

可通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色实验确认大量破骨细胞的存在。按照本视频中演示的方案，破骨细胞经磷酸酶染色后呈现为具有多个细胞核的大型紫色细胞。通常可分离出每个细胞含有多达30个细胞核的破骨细胞。

使用矿化表面被认为是体外评估破骨细胞吸收活性的金标准方法。本图中，10倍放大下的明场显微镜图像显示了矿化表面或吸收陷窝所占的百分比，其中黑色轮廓标示出形成的吸收陷窝区域，从而可评估破骨细胞的吸收能力。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从鼠骨髓中可靠地分离出大量破骨细胞。