Name: 定制设计的基于激光的加热装置顺铂触发释放的热敏脂质体与磁共振成像制导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解基于激光的加热装置如何用于局部加热皮下肿瘤并触发顺铂热敏脂质体释放。该方法结合磁共振成像实时监测温度变化，为肿瘤靶向治疗提供新策略。

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本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）向 C.A. 和 D.A.J. 提供的运营资助支持。作者感谢加拿大创新基金会和玛格丽特公主癌症基金会为资助STTARR研究设施所做的贡献，该设施支持了本研究中的成像与治疗研究部分。

1. 脂质体的制备
<ol>
	<li>将脂质 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（MSPC 或 S-lyso-PC）和 N-(羰基-甲氧基聚乙二醇 2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）溶于氯仿中。例如，制备 10 ml HTLC 时，称取 314.4 mg DPPC、39.4 mg MSPC 和 83.9 mg mPEG2000-DSPE 置于棕色玻璃小瓶中，加入 2 ml 氯仿溶解，然后将小瓶置于 60 °C 水浴中加热 30 秒。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪除去氯仿。将所得脂质薄膜置于高真空条件下过夜（O/N）。</li>
	<li>对于 10 ml HTLC 的制备，用 5 ml 0.1N Tris 缓冲液（pH 7.4）水合脂质薄膜 1 小时。同时，称取 162.4 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DPPG）脂质和 100 mg CDDP 粉末，用含 30% 乙醇的 5 ml 0.1N Tris 缓冲液（pH 7.4）水合 1 小时。</li>
	<li>对于 Gd-HTLC 制剂，称取相同量的 DPPG 脂质和 10 mg CDDP 粉末，然后用 2.5 ml Gd-HP-DO3A 溶液（279.3 mg/ml）与 2.5 ml 含 30% 乙醇的 0.1N Tris 缓冲液（pH 7.4）混合水合 1 小时。水合过程中，混合物必须始终置于棕色小瓶中，并在 70 °C 加热板上持续搅拌，每 10 分钟涡旋一次。</li>
	<li>将脂质混合物与载药脂质混合物合并，再次水合 1 小时，每 15–20 分钟涡旋一次。</li>
	<li>组装 10 ml 挤出器，配备两组 200 nm 聚碳酸酯滤膜。将挤出器的热控套筒连接至 70 °C 循环水浴，并将挤出器连接至压缩氮气罐。</li>
	<li>水合完成后立即转移混合物至挤出器腔室。打开氮气流（设定压力为 200 psi），使脂质体通过滤膜挤出，收集脂质体至 50 ml 离心管中。在整个挤出过程中，始终保持离心管置于 70 °C 热水浴中。重复此过程 5 次。</li>
	<li>拆卸挤出器，更换为两组 100 nm 聚碳酸酯滤膜，重新组装挤出器并将压力调至 400 psi。重复第 5 步操作，但将脂质体挤出 10 次。将最终挤出的样品收集至 15 ml 离心管中。</li>
	<li>将脂质体冷却至室温（RT），在 1,000 × g 条件下离心 3 分钟，以沉淀不溶性 CDDP。</li>
	<li>在无菌条件下，使用截留分子量为 15,000 的透析袋，将脂质体在 0.9% 生理盐水中透析过夜（O/N）。</li>
	<li>取 10 µl 脂质体稀释于 990 µl 蒸馏水中，采用动态光散射法测定 HTLC 和 Gd-HTLC 的粒径分布。每样本进行 3 次测量，每次测量运行 10 次。</li>
	<li>取 40 µl 脂质体稀释于 3,960 µl 蒸馏水中。配制 5–6 种铂和钆的标准溶液，浓度范围为 0.1 至 20 µg/ml。使用电感耦合等离子体-原子发射光谱仪（ICP-AES）在三个不同波长下测定铂和钆的浓度。每个波长下进行 3 次测量以获得平均结果。</li>
	<li>使用差示扫描量热仪（DSC）测定 HTLC 脂质体制剂的凝胶-液晶相变温度（Tm）。将 5–10 mg HTLC 样品装入 DSC 样品盘，以空盘作为参比。升温速率为 5 °C/min，温度范围从 0 °C 升至 60 °C。</li>
	<li>用铝箔包裹脂质体以避光，并在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
2. 体外 脂质体释放
<ol>
	<li>准备离心柱。
	<ol>
		<li>将50 g凝胶过滤珠在室温下用400 ml 0.9%生理盐水孵育3–4小时。取一团玻璃棉，用0.9%生理盐水润湿后卷成筒状，放入1 ml注射器的尖端。压紧玻璃棉，使其占据注射器约0.05–0.1 ml的体积。使用玻璃移液管缓慢加入约1 ml凝胶过滤介质至注射器中。</li>
		<li>将注射器放入15 ml离心管中，以1,000 × g离心3分钟。取出离心柱，放入另一支15 ml离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将400 µl HTLC或Gd-HTLC样品分装至8个1-dram玻璃小瓶中，置于温度控制的水浴中，在37 °C或42 °C下孵育。在每个时间点取出一个玻璃小瓶（即， 5、15、30 和 60 分钟）后立即置于冰上。</li>
	<li>向已准备好的离心柱中加入 100 µl 0.9% 生理盐水，然后在孵育前（对照）或水浴孵育后，向离心柱中加入 100 µl HTLC 或 Gd-HTLC。在 1,000 × g 条件下离心 3 分钟。将注射器从收集管中移除，并将管中溶液稀释后用于 ICP-AES 分析。</li>
</ol>
3. 宫颈肿瘤皮下异种移植的植入
<ol>
	<li>所有动物实验均按照大学健康网络（University Health Network, UHN）动物护理委员会批准的动物使用方案进行。</li>
	<li>所有动物实验均应在生物安全柜（BSC）中进行。任何手术前均需对所有手术器械进行高压灭菌。每次手术后，先用70%乙醇擦拭手术器械，再使用热珠灭菌器进行二次灭菌。</li>
	<li>实施安乐死时，将动物置于隔热的CO2舱内，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>使用100%氧气进行全身麻醉时，诱导麻醉采用5%异氟烷，维持麻醉采用2%异氟烷。为确保麻醉深度，可用镊子按压足垫掌面以观察动物反应。麻醉期间应使用眼用润滑剂防止角膜干燥。</li>
	<li>对接受过手术的动物，应将其单独置于清洁笼具中，避免与其他动物同笼。需持续监测，直至其意识充分恢复。</li>
	<li>在补充有10%胎牛血清（FBS）和抗生素的α-最低必需培养基（α-MEM）中培养ME-180细胞。</li>
	<li>收集细胞，并在接种前将其保存于完全培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将ME-180细胞（人宫颈癌细胞）接种至每只供体小鼠，使其在肌肉内（i.m.）形成肿瘤。 
	注：选择肌肉内接种位点是为了确保肿瘤具有良好的血管化。从小型自繁设施购买雌性SCID小鼠（6-8周龄，体重约20 g）。
	<ol>
		<li>对雌性SCID小鼠进行麻醉，使用27 G针头将1 × 106个ME-180细胞注射至后肢腓肠肌内。</li>
		<li>使用游标卡尺测量肿瘤大小，直至肿瘤最长径达到9-12 mm。若肿瘤超过12 mm，或肿瘤体积影响动物正常行为、行走能力、摄食及饮水，则终止实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将供体小鼠的肿瘤组织块移植至受体小鼠。
	<ol>
		<li>使用5%异氟烷麻醉供体小鼠，在麻醉状态下实施颈椎脱位安乐死。取出供体小鼠的肿瘤组织，并将其切割为2-3 mm3的立方体碎片。</li>
		<li>使用5%异氟烷麻醉受体小鼠。术前皮下注射100 μl浓度为0.5 mg/ml的美洛昔康。依次使用碘伏外科擦洗液、70%乙醇和碘溶液对剃毛区域皮肤进行消毒。剃除受体小鼠左后肢的毛发，在皮肤层面做切口，通过切口将一块供体肿瘤组织皮下植入，然后使用1-2个伤口夹闭合切口。</li>
		<li>在移植后3-5天拆除伤口夹。皮下肿瘤模型是使用基于激光加热装置的前提要求。</li>
		<li>在实施加热治疗前，让肿瘤生长2-3周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 一种共形激光递送照明器的设计、组装与校准 在体 内 加热
<ol>
	<li>使用763 nm半导体激光器，通过光纤将其与贴合式照明器连接，实现组织加热。
	<ol>
		<li>照明器可为异种移植肿瘤提供均匀的浅表激光照射。它由一块尺寸为30 × 20 × 17 mm的高反射材料构成，内部包含三个相连的光积分腔球体，中间一个腔体（直径16 mm），两侧各有一个小腔体（长度16 mm，直径5 mm）。图1).</li>
		<li>为了使光线从一个腔室进入另一个腔室，在两个较小的外侧腔室与较大的中间腔室之间开设了两个直径为5 mm的小孔。激光通过一根400 µm的截断光纤导入外侧腔室，该光纤连接激光器，并经由一个直径为600 µm的孔进入腔室。</li>
		<li>由于光与腔壁的相互作用特性，进入其中一个小型腔室的光在空间上被均质化后，通过内部通路进入较大的腔室，并在其中进一步实现空间均质化。随后，光从中间腔室直径为10 mm的通口射出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用经NIST校准的50 mm积分球测量输出功率，以相对于激光功率设置校准照明光源的光输出。
	<ol>
		<li>使用基于肿瘤简化几何结构的蒙特卡罗模拟计算肿瘤内的光分布。采用商业计算软件包编写自定义算法生成蒙特卡罗代码，并以Jacques开发的多层组织中光传输蒙特卡罗建模标准代码为基础。 等14.</li>
		<li>将肿瘤建模为位于平坦皮肤表面的一个半球体，其直径与皮肤表面处的平均肿瘤尺寸一致，为7 mm，高度为5 mm。通过在整个暴露的半球面上随机发射光子并指向球心，模拟对表面的均匀照射。</li>
		<li>利用包括吸收在内的光学特性，µa = 0.025 mm-1，散射，µs = 10 mm-1，各向异性因子 g = 0.9，折射率 n = 1.4。计算中使用一百万个光子。</li>
		<li>在进行任何操作之前完成这些测量 体内 加热实验，初始校准后不再进行任何修改。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用定制设计的激光腔装置对肿瘤进行保形加热
<ol>
	<li>将激光光纤的一端连接至激光设备，另一端连接至照明器。</li>
	<li>使用 5% 异氟烷对动物进行麻醉。将 27 G 注射导管插入小鼠尾侧静脉，将 22 G 导管插入肿瘤中心。将光纤温度探针置入中空导管内，以监测温度变化。</li>
	<li>用照明器完全覆盖整个肿瘤（图 2）。首先将功率设定为 0.8–1 W。开启激光并等待温度上升，通过手动调节激光功率（0.1–0.8 W 范围内）使肿瘤温度维持在 42 °C。</li>
</ol>
6. 通过磁共振测温（MRT）评估温度分布
<ol>
	<li>利用基于激光的加热装置，结合7特斯拉临床前磁共振成像系统15上的质子共振频率偏移（PRF-shift）磁共振测温法（MRT），并结合光纤温度探针测量，测定加热肿瘤区域的温度分布。</li>
	<li>使用二维快速低角度激发（2D-FLASH）脉冲序列（回波时间4.5毫秒；重复时间156.25毫秒），在光纤温度探针所在层面的单一切片上，以平面内分辨率312 × 312 µm、层厚2 mm，每10秒采集一次测温图像。</li>
</ol>
7. 试剂释放的磁共振监测
<ol>
	<li>在注射 Gd-HTLC 前及注射后 20 分钟，进行 T1-加权成像。</li>
	<li>采用第 3 节所述方法，在一只雌性 SCID 小鼠的双侧后肢各植入一个肿瘤。在注射 Gd-HTLC 前，对左侧后肢肿瘤进行 5 分钟 42 °C 预加热，Gd-HTLC 注射剂量为 66.3 mg/kg Gd-HP-DO3A 和 1.4 mg/kg CDDP，注射后继续加热 20 分钟。在加热过程中完成注射。右侧后肢肿瘤作为未加热对照。</li>
	<li>采集动态 MR 图像（视野 36 × 20 mm，面内分辨率 200 × 200 µm，层厚 2 mm；MR 序列参数），从注射前 30 秒开始，以每 12 秒一次的频率，持续监测注射 Gd-HTLC 后 20 分钟内 Gd-HP-DO3A 的释放情况。</li>
	<li>勾画肿瘤（加热组与未加热组）及肌肉区域的体积，计算每个勾画体积内所有体素的平均 MR 信号强度。</li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突声明。

脂质体最早于20世纪60年代被开发作为药物递送载体，可将其内部水相容积中携带亲水性药物，同时将疏水性药物包载于其脂质双分子层中2。除了用于治疗用途外，当脂质体标记放射性核素或装载成像对比剂时，也已被探索用于诊断应用17。近年来，诊疗一体化（theranostics）及治疗-诊断配对策略受到关注，为影像引导下的患者分层和药物递送提供了新机遇17,18。本研究基于影像引导药物递送的概念，利用自行设计的基于激光的加热装置，在磁共振（MR）引导下评估热敏脂质体的触发式药物释放效果。
如上所述，通常使用水浴或加热导管来加热皮下肿瘤。水浴法需要将整个肢体浸入热水中，导致药物不仅在肿瘤部位释放，还会在整个肢体中非特异性释放。使用加热导管则需将一根18 G导管置入肿瘤中心，且研究表明，为达到热稳态，需要相对较长时间的加热（15分钟）11。
在本研究中，新设计的基于激光的加热装置能够以共形方式向肿瘤区域传递热量，这一点已通过基于磁共振的温度分布图评估得到证实...

实体瘤的病理生理学特性导致纳米级系统具有增强的通透性和滞留效应（EPR）。这一特性促使多种药物递送系统的开发，这些系统利用EPR效应靶向肿瘤组织，同时最大限度地减少全身性副作用1。脂质体递送技术已被广泛用于药物或成像探针的输送2。尽管与传统化疗相比，脂质体显著降低了全身毒性，但在临床疗效方面改善甚微3,4。研究表明，疗效受限的主要原因是药物无法从载体中有效释放4,5。因此，开发能够响应外部刺激而被激活并释放包载药物的脂质体已成为研究热点。多年来，热疗作为一种相对安全的治疗方式已被用于癌症患者6。因此，以热作为外部触发因素的热敏脂质体的研发成为一种合理的策略，在临床转化方面具有巨大潜力。事实上，含溶血磷脂的阿霉素热敏脂质体制剂（LTSL-DOX）目前已进入临床评估阶段7。
近期关于LTSL-DOX的临床数据显示，热疗的实施方案是影响患者治疗效果的关键因素8。在人体中，通常使用射频、微波、激光和超声换能器在肿瘤部位局部施加高温治疗9。在需要对皮下肿瘤进行加热的临床前研究中，最常采用的是加热导管10,11和水浴装置12,13。本文中，我们介绍一种使用定制激光加热装置对皮下肿瘤进行加热的新方法，该方法可实现对肿瘤体积更适形的加热。&#160;该装置采用与磁共振兼容的材料制成，体积小巧，可置于小动物磁共振成像仪的孔腔内，从而在激光加热过程中实时监测组织温度的变化。
磁共振（MR）对比剂钆特醇（Gd-HP-DO3A）与顺铂（CDDP）共同包封于一种对热敏感的顺铂脂质体制剂（HTLC）中，形成Gd-HTLC，用于实时MR成像引导下的热激活药物释放监测与评估，并验证加热方案。我们的结果表明，基于激光的加热装置能够有效激活Gd-HTLC制剂中包封药物的释放，同时可通过MR成像进行实时监测。

<table><tbody><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Heidolph Instruments GmbH &amp; Co.KG</td><td>Laborota 4000</td><td></td></tr><tr><td>高压挤出器</td><td>Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>10 ml 热压筒</td></tr><tr><td>加热循环器</td><td>VWR International LLC.</td><td>11305</td><td>连接至挤出器</td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜滤器</td><td>Whatman</td><td>110605;110606</td><td></td></tr><tr><td>差示扫描量热仪 (DSC)</td><td>TA Instruments</td><td>Q100</td><td></td></tr><tr><td>电感耦合等离子体原子发射光谱仪 (ICP-AES)</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 7300DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer 粒度电位仪</td><td>Malvern Instruments Ltd.</td><td>Nano-ZS</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-5800</td><td></td></tr><tr><td>自动夹伤口夹施加器</td><td>Becton Dickinson</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>自动夹伤口夹移除器</td><td>Becton Dickinson</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631</td><td>9 mm</td></tr><tr><td>763 nm 激光设备</td><td>Biolitec</td><td>Ceralas CD 403 激光器</td><td></td></tr><tr><td>激光探头</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>FT400EMT</td><td>带 SMA 和平切连接器</td></tr><tr><td>光谱漫反射标准板（照明器）</td><td>Labsphere Inc.</td><td>FAST-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>CSTM-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td>7 特斯拉临床前磁共振 (MR) 成像系统</td><td>Bruker Corporation</td><td>Biospec 70/30</td><td></td></tr><tr><td>光纤温度传感器</td><td>LumaSense Technologies Inc.</td><td>Luxtron FOT Lab Kit</td><td></td></tr><tr><td>积分球</td><td>Newport Corporation</td><td>819C</td><td></td></tr><tr><td>光功率计</td><td>Newport Corporation</td><td>1830-R</td><td></td></tr></tbody></table>

定制设计的基于激光的加热装置用于在磁共振成像引导下触发热敏脂质体释放顺铂

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

脂质体已被用作靶向实体瘤的药物递送系统，利用增强的渗透性和滞留效应（EPR效应），显著降低全身毒性。然而，脂质体中包封药物释放不足限制了其临床疗效。为克服肿瘤部位药物生物利用度低的问题，已开发出温度敏感型脂质体，以实现药物的靶向部位特异性释放。本实验室设计并开发了一种热激活型热敏脂质体顺铂（CDDP）制剂，称为HTLC，可在实体瘤部位触发CDDP的释放。热激活递送 体内 在小鼠模型中，使用自行设计的基于激光的加热装置实现了这一目标，该装置在肿瘤部位产生适形加热模式，经磁共振测温（MRT）证实。在整个加热过程中，采用光纤温度监测设备实时测量温度，并通过调节激光功率在线调整热量输出。在磁共振（MR）影像引导下，通过共包载MR对比剂优化药物递送即，&#160;将钆特醇（gadoteridol）与顺铂（CDDP）共同包载于热敏脂质体中，用于验证加热方案并评估药物在肿瘤部位的蓄积情况。加热方案包括在给予热敏脂质体（HTLC）前进行5分钟的预加热，以及注射后持续加热20分钟。该加热方案可有效释放包载药物，在加热的肿瘤组织中观察到相较于未加热肿瘤及肌肉组织最显著的磁共振信号变化。本研究证实了基于激光的加热装置在临床前热敏脂质体研发中的成功应用，并强调了采用磁共振成像指导加热方案验证以优化药物递送的重要性。

HTLC 脂质体采用常规方法制备，包括脂质膜形成、水化、挤出和透析。在涉及 CDDP 的操作步骤中，应特别注意避免 CDDP 接触任何铝材质，否则会因形成黑色沉淀而导致 CDDP 失活。HTLC 的示意图见图3。HTLC 的理化性质已在近期发表于《控制释放杂志》（Journal of Controlled Release）的一篇论文中进行了总结16。Gd-HTLC 制剂中钆和铂的浓度分别为 1.87±0.28 mg/ml 和 0.10±0.02 mg/ml。
基于激光加热装置的照明系统采用三个小型相连腔室，可在直径为10 mm的出口处提供均匀的光照分布（±15%）。根据激光的功率设置，使用经校准的积分球测量得到的功率范围为0.5至1.7 W/cm2。结果以肿瘤横截面图形式显示在图4中。假设总功率为1 W，则肿瘤内任意位置的最大辐照度为70 mW/cm2。与肿瘤表面下方的峰值辐照度相比，皮肤表面处的激光功率下降至原来的二分之一。</p...

已开发出一种与磁共振成像兼容的&#160;定制化基于激光的加热装置，用于对皮下肿瘤进行局部加热，从而在肿瘤区域特异性地激活热敏脂质体中药物的释放。

脂质体已被用作药物递送系统，通过利用实体瘤的增强渗透性和滞留效应（EPR效应）实现靶向治疗……

本实验的总体目标是展示一种自行研制的基于激光的加热装置的操作方法，该装置可用于局部加热皮下肿瘤，以递送热激活脂质体制剂。首先通过脂质膜形成、水合挤出和透析制备 HTLC 制剂来实现这一目标。第二步，将宫颈癌细胞接种至供体小鼠体内。经过四到五周后，将肿瘤切除并切成碎片，分别植入受体小鼠体内。最后一步是使用基于激光的加热系统将受体小鼠的肿瘤局部加热至 42 摄氏度。该基于激光的加热装置具有 MR 兼容性，可在光照过程中实时监测组织温度的变化，且设备小巧便携，便于在小型动物磁共振成像仪的孔径内对肿瘤进行简单而有效的加热。最终，可通过实时磁共振成像监测热敏性 HTLC 的热激活释放。与现有的方法（如使用水浴或加热导管）相比，本技术的主要优势在于，该方法可在启动热疗后一至两分钟内实现对肿瘤的适形加热，并允许实时调节激光功率，从而最大限度地减少治疗过程中的温度波动。我们最初是在开展 HTLC 热敏脂质体配方的体内研究时提出这一方法的设想。我们发现现有方法无法有效实现皮下肿瘤的局部加热。脂质体制备步骤将由我实验室的博士生Myung进行演示。制备脂质体时，首先将新配制的脂质混合物与新配制的脂质药物混合物混合，随后进行一小时的水合，每15至20分钟涡旋振荡一次。在脂质混合物水合的同时，组装10毫升挤出器，配备两组200纳米聚碳酸酯滤膜，将挤出器的加热筒连接至设定为70摄氏度的循环水浴，并将装置连接至压缩氮气罐。水合后立即立即将脂质转移至挤出器腔室，并打开氮气流。然后在200 PSI的压力下使脂质体通过膜进行挤出，将收集的脂质体置于50毫升圆锥管中，并将该管置于70摄氏度的水浴中。将脂质体挤出五次后，拆卸装置，并使用两叠100纳米聚碳酸酯滤膜重新组装装置。将压力设定为 400 PSI，并如前所述将脂质体挤出 10 次。收集最后一次挤出的脂质体至 15 毫升锥形管中，使脂质体冷却至室温，随后通过离心沉淀不溶性顺铂，然后在无菌条件下，使用截留分子量为 15,000 的透析袋，将脂质体在 0.9% 生理盐水中透析过夜。为植入宫颈肿瘤异种移植物，从 90% 汇合度的培养物中收获约 180 个细胞，并通过血球计数板计数存活的宫颈癌细胞数量。用细胞计数仪计数后，将细胞稀释至每100微升含1×10⁶个细胞。所有动物实验均在Star Innovation Center进行，使用游标卡尺测量，通过肌内注射将雌性skit小鼠后肢腓肠肌接种，持续监测所形成肿瘤的大小，直至肿瘤最长径达到9至12毫米。随后将肿瘤从供体小鼠中切除，并切成2至3立方毫米大小的组织碎片。现在剃除受体动物左侧后肢的毛发，并在裸露的皮肤上做一个切口。通过切口将一块供体肿瘤组织皮下植入，并在植入后三到五天使用一至两个伤口夹闭合皮肤。移除伤口夹，让肿瘤生长两到三周，以进行热疗处理。首先，将激光光纤的一端连接至激光设备，另一端连接至照明装置。接着，将27号注射导管插入麻醉后受体小鼠的尾侧静脉，随后将22号导管插入肿瘤中心部位。然后将光纤温度探针置入中空导管内以监测任何温度变化，并用照明装置完全覆盖整个肿瘤。最后。将功率设置为0.8至1瓦，然后打开激光器并等待温度上升；在整个治疗过程中，手动调节激光功率在0.1至0.8瓦之间，以使肿瘤温度维持在42摄氏度，如本图所示的热处理肿瘤横截面所示。假设总功率为1瓦，肿瘤内任意位置的最大辐照率（fluence rate）为70毫瓦每平方厘米，而在皮肤深度处的肿瘤内辐照率为最大值的50%，该数据已通过质子共振频率偏移法进行磁共振测温验证。使用基于激光的加热装置可生成相对均匀的温度分布图，如图中所示，该图记录了相对于加热前点源测量获得的绝对基线值的相对温度变化。在注射钆HTLC后，通过磁共振信号分析发现，与未加热的胫骨肌相比，加热后的肿瘤显示出最高的相对信号增强，并在整个加热期间维持该信号水平。一旦掌握，若操作得当，该技术可在15分钟内完成设置，为热敏性脂质体制剂的临床前评价提供一种有价值的工具。请勿忘记，使用四类激光器可能极其危险，在进行此操作时，应始终采取佩戴安全护目镜等预防措施。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

定制设计的基于激光的加热装置顺铂触发释放的热敏脂质体与磁共振成像制导

从一名已麻醉且颅骨暴露的人类患者开始。该患者被诊断患有颅内肿瘤。在暴露的颅骨上钻孔，形成一个开口，以建立通路。在立体定向引导下，沿预定路径插入激光散射光纤（LDF）并固定到位。将患者转移至磁共振成像仪，并将激光多普勒探头连接至激光光源。从多个角度采集 MRI 图像，以观察纤维束走行及肿瘤情况。这证实了LDF位于肿瘤附近，从而能够对激光手术过程进行实时监测。设定目标热保护点，以将加热范围限制在肿瘤边界内，并保护周围组织。启动激光消融，聚焦的热能将导致肿瘤细胞死亡。达到最大消融后，停止使用激光。进行随访 MRI...

激光间质热疗在人类患者颅内肿瘤消融中的应用

我们开发了一种新型的内在多功能纳米囊泡，称为porphysosome。该囊泡具有结构依赖性的荧光自猝灭特性和独特的光热特性，因而可作为高效的光热治疗试剂。我们采用高压挤出法制备了porphysosome，并在异种移植肿瘤模型中评估了其光热治疗效果。...

一种利用固有多功能纳米囊泡——卟啉体实现一分钟内、亚瓦功率光热消融肿瘤的方法

本方案介绍了一种利用市售材料制备金纳米颗粒整合型光响应脂质体的简单方法。同时展示了如何测量合成脂质体在脉冲激光处理下微泡空化过程的方法。...

金纳米颗粒整合型光响应脂质体的合成及其脉冲激光激发下微泡空化效应的测量

本方案介绍了利用交错人字形微混合器微流控装置制备热敏脂质体的优化参数。该方法还可实现阿霉素和吲哚菁绿的共包封，并通过光热触发释放阿霉素，从而实现可控/触发式药物释放。...

含溶血磷脂的温度敏感脂质体的微流控制备

本文介绍了一种通过自组装制备氧化铁纳米颗粒包壳微泡（NSMs）的方案，该方案将磁性、声学和光学响应性协同整合于一个纳米治疗平台中，用于磁热疗与光热联合癌症治疗。...

磁性、声学与光学三重响应型微泡用于磁热与光热联合癌症治疗

本方案介绍了利用先进的递送与监测系统，精确实施磁性纳米颗粒热疗所需的技术与方法。...

使用定制递送系统进行磁性纳米颗粒热疗的体外与体内递送

本文介绍了一种利用磁共振引导的高强度聚焦超声产生可控性高热，以在横纹肌肉瘤小鼠模型中触发温度敏感脂质体药物释放的实验方案。...

磁共振引导高强度聚焦超声产生的热疗：小鼠横纹肌肉瘤模型中的一种可行治疗方法

热等离子体穿孔法结合了共聚焦显微镜、光镊技术和金纳米颗粒，用于研究细胞和巨大单层囊泡中细胞质膜修复过程中的蛋白质响应。该技术可实现快速且局部的膜穿孔，有助于鉴定关键蛋白质及其在复杂的细胞质膜修复机制中的功能作用。...

一种用于研究活细胞和模型膜中质膜修复的热等离子体方法

胶质母细胞瘤是一种破坏性极强的原发性脑癌，而激光间质热疗正逐渐成为无法手术切除的胶质母细胞瘤的一种有前景的替代传统手术切除的治疗方法。本方案描述了一种优化的临床前小鼠模型，可用于研究治疗效果或辅助治疗与联合治疗方案。...

一种用于胶质母细胞瘤激光间质热疗的免疫活性小鼠模型

本方案介绍了在实体瘤模型中实施靶向热疗所必需的技术与方法。该方法利用瘤内注射的金纳米棒对近红外光的光热转换作用，从而在肿瘤微环境中诱导局部加热。...

通过瘤内注射金纳米棒介导近红外光的光热转换在小鼠肿瘤模型中诱导靶向性轻度高热

了解基于激光的加热装置如何用于局部加热皮下肿瘤并触发顺铂热敏脂质体释放。该方法结合磁共振成像实时监测温度变化，为肿瘤靶向治疗提供新策略。

定制设计的基于激光的加热装置用于在磁共振成像引导下触发热敏脂质体释放顺铂

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