Name: 一般方法评估对静脉注射甲基苯丙胺的自我管理深部脑刺激的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习深部脑刺激技术用于评估静脉注射甲基苯丙胺成瘾治疗的效果。该方法通过在大鼠模型中进行操作式条件反射训练，帮助研究人员探索电刺激对药物滥用行为的干预机制及其临床应用潜力。

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由2014-2015年度神经外科研究与教育基金会（NREF）资助项目及路易斯安那州立大学什里夫波特医学院2014年科研资助奖（J.A.W.）支持。感谢S. Harold和C.M. Keller提供的宝贵技术支持与指导。

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作者对本方法学无任何竞争性财务利益。

尽管脑深部刺激的确切机制尚未完全阐明，但DBS对运动障碍和精神疾病的有效性可能源于电刺激疗法与不同时间点下多个皮层下及皮层脑区功能之间的动态相互作用6,22-26。虽然非依赖性给予啮齿类动物甲基苯丙胺的方法已有充分描述27,28，但这些方法最适合用于对药物药代动力学和神经化学效应进行独立研究27-29。通过引入对药物的动机因素，操作性静脉内药物自我给药模型非常适合研究DBS等电刺激疗法如何随时间与病理性行为发生相互作用。我们所描述的方法旨在考察在一种环境中实施的DBS对另一种环境中依赖性甲基苯丙胺使用行为的影响。
在我们的静脉注射甲基苯丙胺自我给药实验范式中，包含三个关键步骤：1）在长时间获取阶段快速建立并加剧药物摄入；2）在随后的短时间获取阶段维持稳定且高水平的药物摄入；3）形成药物摄入的前置负荷（front loading）模式。该范式可在2至3周内完成，每次实验使用10至12只大鼠，具有较高的成本效益，且特别适合用于评估深部脑刺激（DBS）的效果，因为使用精神兴奋剂的大鼠头部装置的使用寿命可能有限。与其他包含长时间获取阶段的实验范式类似19,30,31，该方法能够合理模拟某些物质使用障碍的特征；它表现出药物使用的加剧以及在实验早期出现强烈的“药物负荷”行为，这些特征反映了人类对药物的依赖性，而非娱乐性使用19,30。具有长时间静脉注射甲基苯丙胺暴露史的啮齿类动物还表现出认知功能缺陷32、对药物治疗的独特反应33、药代动力学变化34以及神经化学改变35，这些特征相较于仅经历短时间暴露的动物，更接近于患有慢性甲基苯丙胺使用障碍的人类患者。
同样，我们的深部脑刺激操作包含三个关键步骤：1）在一次或两次“模拟”疗程中，使受试者适应深部脑刺激（DBS）环境，包括头部连接装置的固定；2）使用商用系统每日进行间歇性主动刺激；3）DBS断开连接后，将受试者转运至药物使用环境。该实验范式旨在模拟经颅磁刺激（TMS）等非侵入性治疗的过程，而非传统的持续性DBS治疗。如前所述，出于多个原因，用于常见运动障碍疾病的完全植入式、可编程DBS系统3在患有精神兴奋剂依赖的患者中应用可行性较低。相比之下，无需高风险手术及术后护理的间歇性电刺激治疗策略（如TMS）可能更适用于该类患者群体。我们所描述的方法将使研究人员能够开发并优化可在限定时间段内、脱离药物环境实施的治疗策略，以调节与药物相关的行为。已有越来越多的证据表明，根据特定神经生理缺陷设计的短暂颅内电刺激23，或与全身药物治疗联合应用的电刺激36，在治疗结束后数周内仍可对精神疾病及药物相关行为产生持久的积极影响。
在高强度药物使用期间，对初始手术技术的高要求以及对多个手术部位持续护理的需求是本方法的主要局限性。如果静脉导管或深部脑刺激电极失去功能和/或发生感染，大鼠必须退出研究。在独立开展这些操作之前，最好从经验丰富的研究人员处学习严格的无菌技术下的颈静脉导管和颅内电极植入操作。
该操作适用于多种改进和未来研究方向，包括：1）替代性刺激参数（例如，刺激波形、脉冲宽度、频率、强度）；2）其他潜在的治疗性脑区靶点（例如，伏隔核核心、内侧前额叶皮层、中脑、缰核）；3）不同的深部脑刺激（DBS）递送模式（例如，每日DBS递送、每周DBS递送、在操作行为实验前不同时间间隔进行DBS、在习得阶段前进行DBS）；以及或许最具前景的第4）短时程DBS与药物制剂的联合应用，以模拟对特定通路的光遗传学刺激，并产生持久的行为改变36。

甲基苯丙胺是一种精神兴奋剂，由于其急性增加突触单胺类神经递质（尤其是多巴胺），可产生强烈而持久的欣快感。甲基苯丙胺依赖是一种全球性的公共卫生问题，全球使用者估计在2500万至3400万之间，目前尚无确证有效的治疗方法1,2。因此，迫切需要开发针对甲基苯丙胺依赖的新型治疗策略。脑深部电刺激（DBS）是一种神经外科手术，通过使用脑“起搏器”来调节某些疾病（如帕金森病、肌张力障碍和原发性震颤）中异常的神经元放电模式3。近期的人体病例报告提示，DBS也可能对酒精和药物依赖具有治疗效果，但关于精神兴奋剂（例如，可卡因、甲基苯丙胺）的临床前证据仍然有限4-8。
目前实施的持续性深部脑刺激治疗需要患者及其家庭的高度配合。必须进行细致的伤口护理和个人卫生管理，以保护埋藏于皮下的起搏器硬件；即使患者未使用静脉药物导致菌血症，该硬件仍易发生感染。由于该系统采用开环设计，还需定期对深部脑刺激装置进行随访；经验丰富的医生会在常规门诊中调整现代深部脑刺激设备的参数，以减轻目标症状3。然而，由于可卡因和甲基苯丙胺使用者常伴有复杂的心理社会问题，这种治疗模式在该人群中将受到限制。已有若干啮齿类动物研究模拟了这一不切实际的治疗模式，通过在药物使用环境中持续施加深部脑刺激，观察其在可卡因自我给药过程中的作用效果9-11。
无需植入硬件的非侵入性间歇性技术，例如经颅磁刺激（TMS），可能是治疗物质使用障碍的更优选择12。TMS通过外部头线圈非侵入性地传递，在每日间歇性治疗过程中，在特定脑区靶点产生电场。近年来出现的H线圈或“深部”TMS技术，除了皮层位点外，还可刺激更深层的脑结构，从而拓展了其潜在应用范围13,14。这两种疗法均在与主要药物使用环境不同的场所，通过一系列间歇性治疗会话进行，且在人类和啮齿类动物的药物依赖研究中均显示出一定前景13,15-17。治疗甲基苯丙胺依赖患者的时间窗口很可能是在清醒期，例如法院强制的康复阶段，而非街头滥用药物导致暴力或行为异常的暴发期18。因此，本文旨在描述一种在时间和空间上均与药物使用环境相分离的电刺激干预方法，该方法更接近于在人类中实际可行的治疗模式，用于治疗静脉注射甲基苯丙胺依赖。

<table><tbody><tr><td>啮齿类动物操作箱</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-008CT</td><td>Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478 USA 电话: (802) 527-2343</td></tr><tr><td>带数字显示控制台的 Kopf 小动物立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>型号 940</td><td>Kopf 电话: 1-877-352-3275 传真: 1-818-352-3275 邮箱: sales@kopfinstruments.net</td></tr><tr><td>Z系列 3-DSP 生物放大处理器</td><td>Tucker Davis Technologies</td><td>RZ5D</td><td>Tucker-Davis Technologies&amp;nbsp;11930 Research Circle Alachua, FL 32615&amp;nbsp;美国 电话: 386-462-9622&amp;nbsp;www.tdt.com</td></tr><tr><td>Z系列 32通道刺激器</td><td>Tucker Davis Technologies</td><td>IZ2-32</td><td>该软件附带一份手册，介绍如何使用 OpenEx 平台编程实验，可通过以下链接访问：http://www.tdt.com/files/manuals/OpenEx_User_Guide.pdf</td></tr><tr><td>用于 IZ2 刺激器的 48 伏锂离子电池组</td><td>Tucker Davis Technologies</td><td>LZ48-200</td><td></td></tr><tr><td>用于 PZ5 的 32 通道分路盒</td><td>Tucker Davis Technologies</td><td>S-BOX_PZ5</td><td></td></tr><tr><td>多通道神经记录用 OpenEx Ext 软件包</td><td>Tucker Davis Technologies</td><td>OpenEx</td><td></td></tr><tr><td>铂铱刺激电极</td><td>Plastics One Inc</td><td>MS303/8-B/SPC ELECT PT 2C TW .005&quot;</td><td>Plastics One Inc P.O.Box 21465, S.W. Roanoke, VA 24018, 电话: 540-772-7950</td></tr><tr><td>刺激器与换向器之间的 2 通道电缆</td><td>Plastics One Inc</td><td>305-441/2 W/ Spring</td><td></td></tr><tr><td>换向器与电极基座之间的 2 通道电缆</td><td>Plastics One Inc</td><td>305-305 W/ Spring</td><td></td></tr><tr><td>4 通道换向器</td><td>Plastics One Inc</td><td>SL2+2C 和 SL2+SC/SB</td><td></td></tr></tbody></table>

评估深部脑刺激对静脉内甲基苯丙胺自我给药影响的通用方法

A General Method for Evaluating Deep Brain Stimulation Effects on Intravenous Methamphetamine Self-Administration

物质使用障碍，尤其是甲基苯丙胺成瘾，是一种破坏性强、易复发的疾病，对青年人群的影响尤为严重。目前亟需开发新颖、有效且切实可行的治疗策略，并通过动物模型加以验证。神经调节技术，包括脑深部电刺激（DBS）疗法，是指利用电刺激干预病理性神经元活动，在治疗精神疾病（如药物依赖）方面已展现出潜力。临床上的DBS治疗通过植入类似起搏器的系统，由医生体外编程，持续向脑内特定结构输送电刺激以缓解症状。然而，由于甲基苯丙胺使用者常面临复杂的心理社会问题，该疗法的应用将受到限制。相比之下，能够间歇性、非侵入性实施，并可在远离药物使用环境的条件下远程施加的电刺激治疗更具可行性。本文介绍了一种在时间与空间上均与药物使用环境相分离的颅内电刺激递送方法，用于治疗静脉注射（IV）途径的甲基苯丙胺依赖。在啮齿类动物中，可通过操作性条件反射范式下的静脉自我给药模型快速建立甲基苯丙胺依赖，该模型包含一段延长的药物获取期，能够表现出用药行为的逐步升级以及强烈的觅药动机。

在放置颈静脉导管和颅内DBS电极后，经过短暂的恢复期，啮齿类动物可成功地被训练来自行给予静脉注射甲基苯丙胺。图3显示，大鼠在药物长时间可及的第2天开始即可习得并逐渐增加甲基苯丙胺的自我给药行为，到第4天每 session 平均达到 168 ± 12 次输注。
大鼠随后被调整为每天2小时的操作式训练时间表，原因有两个：1）防止因持续长时间给药导致的甲基苯丙胺毒性和严重行为改变；2）建立一个相对稳定的反应率，以便通过各种治疗干预手段进行调控。图4显示，在短时给药训练的第二周，每次训练会话中平均总输注次数为75 ± 8，且日间波动通常小于10%。图5表明，随着训练的进行，大鼠对药物的摄取动机逐渐增强，表现为第6天出现“前置给药”（front-loading）的摄取模式，与第1天相比差异明显。一旦该模式形成，其效应在后续的训练会话中基本保持稳定（数据未显示）。
图6显示，在非药物环境中进行双侧DBS干预后，与假刺激组相比，五天中有三天大鼠操作性静脉内甲基苯丙胺自我给药行为显著减少。本研究靶向伏隔核壳部，因其已知参与药物摄取行为8，所用立体定位坐标相对于前囟（AP +1.6，DV -8.5，ML ±2.4）。刺激参数和持续时间主要参考既往关于DBS治疗精神疾病的研究经验8,20,21，但可根据实验者的具体需求进行调整。误差条中等，且并非所有时间点均达到统计学显著性，表明在行为评估中可能存在反应范围的变异性，尽管治疗效应明确。增加每组实验大鼠数量有助于弥补这种自然变异。本实验最初使用了11只动物，其中1只因术后进食不良被实施安乐死，1只因出现癫痫被剔除，另1只因DBS电极故障被排除，最终共纳入8只动物（假刺激组N = 4；主动DBS组N = 4）。通常情况下，每组实验起始时纳入约10至12只大鼠，可确保实验顺利完成。
<img alt="LabVIEW 仿真框图、迭代数据控制、波形生成、信号处理流程图。" src="/files/ftp_upload/53266/53266fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1">
图1. 可视化编程语言。 研究人员使用可视化编程语言（如此处所示示例）设计程序，以在用户设定的参数下同时对多只动物进行脑刺激。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53266/53266fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经信号记录示意图；电生理装置；脉冲幅度、宽度、频率控制。" src="/files/ftp_upload/53266/53266fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图2. 可视化控制面板。在实验开始之前，研究人员在可视化控制面板的左侧设定所需的频率、脉宽和刺激强度。此处的刺激参数为：电流强度 200 μA；脉宽 61 msec；脉冲频率 130 Hz。一旦开始刺激，右侧将显示当前电流输出的波形。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53266/53266fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="输注速率图，时间与会话天数，数据趋势分析，误差线，医学研究。" src="/files/ftp_upload/53266/53266fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3">
图3. 静脉注射甲基苯丙胺自我给药的获得。 对总操作性反应（360 分钟）数据进行重复测量方差分析，以每日实验阶段作为重复测量因子。所有 p &lt;0.05 的分析结果被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。图中显示了操作性训练前四天每日6小时操作性实验阶段中的甲基苯丙胺总输注次数。+ P &lt;0.05，与第1和第2次实验阶段相比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53266/53266fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="时间与输注次数关系图；误差线；5天内的数据分析；科学实验结果。" src="/files/ftp_upload/53266/53266fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4">
图4. 静脉注射甲基苯丙胺自我给药的维持。 采用重复测量方差分析（ANOVA）对总操作性反应（120 分钟）数据进行分析，以每日实验阶段作为重复测量因子。所有分析中，p &lt;0.05 被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。在操作性训练第二周的每日2小时操作性实验阶段中，甲基苯丙胺总输注次数显示动物表现出稳定但强烈的药物摄取行为。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53266/53266fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间推移的药物输注量减少；第1天与第6天输注量的折线图比较。" src="/files/ftp_upload/53266/53266fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5">
图5. 对药物摄取动机的发展。 在操作性训练的首小时内，每15分钟统计一次操作性反应次数，数据采用重复测量方差分析法进行分析，以每个15分钟时间段作为重复测量指标。所有检验结果中，p &lt; 0.05 被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。在操作性训练第1天未见“前载式”（front-loading）模式，但在第二周时该模式逐渐出现，表明对药物摄取的动机增强。+ P &lt; 0.05，与30、45和60分钟时间点比较；++ P &lt; 0.05，与45和60分钟时间点比较；+++ P &lt; 0.05，与60分钟时间点比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53266/53266fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="输注速率比较图表；假刺激与真实DBS对比；为期8天的治疗；包含误差线。" src="/files/ftp_upload/53266/53266fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6">
图6. 深部脑刺激对静脉注射甲基苯丙胺自我给药的影响. 对操作性反应第一小时（60 min）的总反应次数数据进行混合方差分析，组间变量为处理方式（DBS vs 假刺激），组内变量为每日实验会话。所有 p &lt;0.05 的分析结果被认为具有统计学意义。数据以均值 ± 标准误表示。双侧术前操作性深部脑刺激在治疗第3、4和7天显著减少了操作性反应前60分钟内的甲基苯丙胺输注次数。+ P &lt;0.05，与假刺激组及基线反应水平相比。每日治疗结束后，反应水平恢复至基线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53266/53266fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种用于治疗静脉注射甲基苯丙胺依赖的颅内电刺激递送方法，该刺激在时间上和空间上均与药物使用环境相分离。

物质使用障碍，尤其是甲基苯丙胺使用障碍，是破坏性强且易复发的疾病，对青年人群的影响尤为严重。目前亟需……

本实验的总体目标是评估深部脑刺激对静脉注射甲基苯丙胺的啮齿类动物在时间和空间上均与药物使用环境相分离的影响。该方法有助于回答成瘾精神病学领域的一些关键问题，例如：对特定脑区的电刺激能否减少药物滥用，以及在何种情况下该疗法最为有效？该技术的主要优势在于，电刺激治疗在与药物使用环境不同的时间和环境中进行。这更接近于在人类患者中可能实现的情况。本次操作将由我们实验室的博士后研究员Vinita Batra博士和实验室主管技术员Glenn Guerin先生进行演示。本实验的准备工作已在文本方案中详细说明。首先，尽快且平稳地将大鼠放入操作箱中，以尽量减少行为学干扰因素。在实验开始前，用 0.1 毫升 0.9% 生理盐水冲洗大鼠的导管，以确保导管通畅。接着，将一根不锈钢弹簧 leash 连接到大鼠背部的导向套管上。将套管的另一端连接到操作箱上方的防漏液体旋转接头。为了使大鼠快速学会自我给药任务，每天进行六小时的训练，连续进行四到五天，且每天的训练时间应保持一致。每次按压有效杠杆时，给予一次甲基苯丙胺输注，随后进入30秒的超时阶段，在此期间按压杠杆不再产生任何反应。在第一周结束时，啮齿类动物将能够熟练地自行给予甲基苯丙胺。在第二周的训练期间，从周一到周五每天进行两小时的实验，以维持并优化其静脉注射甲基苯丙胺的自我给药行为。继续采用固定比率1的程序，并设置30秒的超时。 当连续三个实验阶段中甲基苯丙胺输注的总次数变化小于百分之十时，即达到稳定且强烈的行为反应。另一个稳定强烈反应的指标是：前30分钟内的累积输注次数大于后30分钟内的累积输注次数。当大鼠形成这种药物负荷模式时，表明其已出现成瘾行为，而不仅仅是随意使用。每次实验结束后，准备一支注射器用于冲洗导管，并将连接绳从啮齿动物背部断开。使用含有800 IU链激酶的0.1毫升0.9%生理盐水溶液冲洗大鼠导管，以防止血液凝结。冲洗后，将套管插入每根引导套管中，防止堵塞。然后将大鼠放回其饲养笼中。参见文本方案中关于测试导管通畅性的方法以及如何解决本实验中常见问题的说明。为此实验准备10至12个聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）盒子。在每个箱子上，用硬质不透明纸覆盖其中三面外侧，以防止大鼠在实验过程中相互看见。但需保持前壁透明，以便在刺激过程中观察动物。接下来，用一块硬板部分覆盖箱子的顶部，以防止大鼠逃出，同时仍保持空气流通。在上层面板上，安装用于连接啮齿类动物头帽与刺激系统的换向器。使用能够向多个动物同时提供恒定电流的刺激系统进行脑深部电刺激（DBS）实验，该系统应包含可编程接口。使用定制长度的电缆，将刺激器的通道端口连接到每个换向器的上部电子基座。然后，使用外覆不锈钢弹簧的16英寸电缆，将换向器的下部电子基座连接到大鼠颅顶植入电极基座。该电缆应允许大鼠在围栏内各个区域自由活动，同时不会对颅顶基座产生明显张力。当大鼠四肢着地时，电缆的长度通常只需能够到达其头部可活动的范围即可。在系统编程时，使用可视化编程语言来设定每个设备为实现实验终点所需执行的功能，以及将要存储和/或实时显示的数据。在实验开始之前，需在可视化控制面板中设定所需的频率、脉冲宽度和幅度。大鼠高频刺激的典型参数与临床人体深部脑刺激所用参数相似：频率为130至180赫兹，脉冲宽度为60至90毫秒，电流幅度为100至250微安。在进行脑刺激实验时，将大鼠放入箱内后，需将旋转连接器上的不锈钢弹簧电缆连接至头帽上每个电极的基座。首先，使用 5 微安电流、1000 赫兹频率持续 2 秒，测试每个电极的阻抗。如果电极的阻抗小于或等于 125 千欧姆，则继续进行实验。否则，应考虑将动物退出实验，因为电极的电阻可能导致电流降低至可能的亚治疗水平。开始进行一到两次模拟训练以使大鼠适应。在这些训练过程中不要施加任何主动治疗。每次模拟训练结束后，立即将大鼠转运至操作箱中，进行每日两小时的静脉注射甲基苯丙胺自我给药训练。实验中，将大鼠平衡分配为两组：一组为接受主动刺激的刺激组，另一组为接受假刺激的对照组，后者仅进行模拟操作。每天进行一次深部脑刺激，持续五天，每次三小时。在每次刺激过程中的部分时段仔细观察动物，记录刺激是否引起行为上的明显改变。每次深部脑刺激结束后，立即开始大鼠每日的静脉内甲基苯丙胺自我给药训练。在植入静脉颈静脉导管和颅内深部脑刺激电极后，大鼠在连续两天长时间接触甲基苯丙胺后即建立起药物自我给药行为并逐渐增加用药量。随后，将大鼠转入每日两小时的操作式训练时间表，以防止甲基苯丙胺毒性，并建立稳定的反应速率，以便通过各种治疗干预手段进行调控。在操作性训练的第六天，大鼠对摄取药物的动机增强，表现为出现药物摄入的前置负荷模式。此模式在随后的训练阶段基本保持稳定。在确立了这种稳定的药物滥用模式后，按照所述方案给予深部脑刺激。这导致操作性静脉注射甲基苯丙胺的自我给药行为显著减少。一旦掌握该技术，每组使用约十至十二只动物，可在两到四周内完成实验。由于使用甲基苯丙胺的啮齿类动物颅骨螺帽和静脉导管的使用寿命有限，该方法非常适合用于测试深部脑刺激的效果。该操作可用于研究不同的电学参数、脑区靶点以及新型给电模式，还可用于探索电刺激疗法与药物制剂的联合应用，这些组合可能引发持久的行为改变。

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