Name: 弥漫性光学光谱治疗急性电离辐射引起的皮肤毒性的定量评价使用小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 了解如何使用漫射光学光谱技术在小鼠模型中定量评估急性电离辐射引起的皮肤毒性。该方法提供客观生物标志物，可预测放疗患者的皮肤反应风险。

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本研究得到了 Abbott CARO（加拿大放射肿瘤学家协会）泌尿肿瘤放射学奖项和 Alan E. Tiffin 基金会授予 SKL 的研究资助。EK 获得了 Frederick Banting 和 Charles Best 加拿大研究生奖学金、前列腺癌研究 Scace 研究生奖学金以及 Paul Starita 研究生奖学金的支持。

以下方法符合Sunnybrook研究机构动物护理伦理委员会的指南。
1. 漫反射光谱系统
<ol>
	<li>使用先前已描述的手持式光纤探头和便携式光谱采集系统（Kim et al. 2010）采集漫反射光谱，并在图1（及相关图注）中简要回顾该系统以确保完整性1,2。</li>
</ol>
2. 急性辐射性皮肤损伤小鼠模型的制备
<ol>
	<li>订购6周龄小鼠（最好为无毛小鼠，例如裸鼠或SKH-1），并在开始实验前让其在动物房中适应环境一周。为非照射对照组至少保留3只小鼠，为照射组保留5只小鼠。</li>
	<li>在进行基线DOS测量和照射前，使用耳标打孔或在尾巴上用永久性记号笔标记小鼠。如果小鼠有毛，需去除其 flank 皮肤上2 cm × 2 cm区域的毛发，但此操作可能引起皮肤刺激。</li>
</ol>
3. 扩散光学光谱数据采集
<ol>
	<li>打开电子设备的电源。</li>
	<li>对于小鼠皮肤，通过在采集软件中输入以下参数来设置信号参数：采集时间为 25 毫秒，信号平均次数为 25，boxcar 滤波器宽度为 1。这些参数在采集时间与信噪比之间提供了合理的平衡。</li>
	<li>使用自定义编程的采集软件，点击“采集”按钮，自动获取背景读数 Rbg（LED 关闭）以及两个源-探测器间距下的漫反射信号 Rmeas（260 μm，520 μm）。总采集时间约为 2 秒。</li>
	<li>在进行测量前，按下房间照明开关，关闭所有荧光灯。
	 
	注意：荧光灯会干扰检测信号（这些灯产生随时间变化的光强，因此难以作为背景信号扣除）。尽管可以使用白炽灯，但仍需将灯具远离 DOS 探头，以避免背景信号过高（导致信噪比差）。</li>
</ol>
4. 动物麻醉与基线 DOS 测量
<ol>
	<li>准备麻醉机，确保所有连接完好且液态异氟烷的液位充足。使用带有连接管和鼻罩的麻醉诱导舱，并将其固定在消毒过的柔软垫面上，位置应便于 DOS 探头操作。</li>
	<li>每次将一笼小鼠放入诱导舱中进行麻醉，先以 4% 异氟烷诱导 30 秒，随后将异氟烷浓度降至 2%，维持 2 分钟。通过夹捏后肢脚趾无反应来确认小鼠已进入麻醉状态。</li>
	<li>迅速将一只小鼠转移至消毒过的 DOS 检测区域，使其侧卧，将鼻部固定于鼻罩中，并打开鼻罩管路以供应麻醉气体（2% 异氟烷）。 
	注意：若操作时间超过 1–2 分钟，需在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>在获取小鼠皮肤测量数据前，使用 70% 乙醇擦拭探头进行消毒。切勿对皮肤进行消毒。</li>
	<li>轻柔地将探头置于小鼠侧腹部皮肤上，注意避免扰动局部血管结构。在整个测量过程中用手稳定持握探头。</li>
	<li>按照骰子上的五点分布模式，对约 2 cm × 2 cm 的侧腹皮肤区域（即将照射区域）进行探测，采集反射光谱数据。在所有后续测量中，保持相同的探测模式、区域、探头压力及身体侧别（左侧或右侧）一致。 
	注意：完整扫描过程约需 60 秒。探头压力应适中，足以完成扫描但不扰动局部血管。</li>
	<li>将小鼠转移至恢复笼中，随后将下一只小鼠移至 DOS 探测区域。重复步骤 4.2–4.6，直至所有小鼠完成测量。在动物恢复至能够自主维持胸卧位意识状态前，不得将其单独留置无人看管。</li>
</ol>
5. 动物照射
注意：本方案需要使用照射器，且动物准备可能需要根据照射器设备的要求进行调整。在照射过程中，仅应暴露小面积的 flank 皮肤以接受辐射束。照射器应置于无菌设施内，在将小鼠送回无菌饲养区域时，应遵循适当的笼具灭菌程序。
<ol>
	<li>准备麻醉机（如步骤 4.1 - 4.2 所述），每次将一只小鼠放入诱导室进行麻醉，然后准备进行照射。</li>
	<li>将小鼠从诱导室中取出，轻轻捏住侧腹皮肤，并在拉伸的皮肤上下方贴上胶带，形成一个皮瓣。</li>
	<li>将小鼠放置在聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）平台上，并用定制的铅制夹具覆盖其身体（一种可行的设计为底部和至少一端开口的矩形盒，另设一侧窗以便将侧腹皮肤拉出）。将皮瓣从夹具的窗口拉出，并用胶带轻轻固定在平台上。 
	注意：定制的铅制夹具应足够小以固定小鼠。如果该夹具无法完全固定小鼠，则需使用额外的固定装置和/或通过腹腔注射给予氯胺酮（80 - 100 mg/kg）和赛拉嗪（10 - 12.5 mg/kg），以确保在整个照射过程中小鼠保持不动。</li>
	<li>将带有夹具和小鼠的聚甲基丙烯酸甲酯平台放入照射仪中。设定参数（皮肤与X射线源的距离、电压、持续时间和电流），并给予所需剂量（例如，距离160 kVp X射线源11 cm，电流6.3 mA，照射2.5分钟）。 
	注意：操作X射线源时须谨慎，遵循仪器使用指南，避免造成灼伤和DNA损伤。 
	注意：裸鼠在接受35 Gy照射后约14天会出现湿性脱屑反应，而在17 Gy照射下仅出现轻微的斑片状脱屑。</li>
	<li>将装置和小鼠从照射仪中取出，移除屏蔽物，取下胶带，并将小鼠放入单独的恢复笼中。待小鼠从麻醉中恢复后，将其放回正常的共用笼具中。对所有小鼠重复步骤 5.2 - 5.4，并对对照组小鼠进行假手术操作。</li>
	<li>照射后，将动物饲养于常规环境中。若出现异常行为（例如，弓背姿势，可能提示疼痛），应咨询兽医以诊断问题。缓解疼痛的方法可包括皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，或遵兽医指导用药。若体重减轻超过正常体重的20%，应将其单独饲养于独立笼具中，并提供高营养食物。</li>
</ol>
6. 后续 DOS 测量
<ol>
	<li>使用定量 DOS 技术监测并测量皮肤反应强度。对皮肤变化的目视检查及既往研究表明，在照射后约 6 至 12 天内，DOS 参数相对于基线可能出现显著变化3,4。然而，由于明显的变化可能因模型不同而更早或更晚发生，因此其他测量时间点也可能具有研究价值。</li>
	<li>按照第 3 节所述设置 DOS 设备并进行校准。按照第 4 节所述准备麻醉机并获取 DOS 测量数据。</li>
</ol>
7. 采集后处理
注意：以下部分的所有步骤均使用高性能软件环境中编写的自定义程序完成。每个光谱采集文件均采用标准化的命名规范，以实现批量处理。所有步骤均在图2中予以说明。
<ol>
	<li>从所有测得的光谱（包括背景读数）中减去基线（噪声基底）。</li>
	<li>减去背景读数 R背景 （LED关闭），在步骤3.3中从测量光谱R获得测量. 
	注意：本文后续所有光谱均假设已扣除噪声基线和背景，并称为R相关性.</li>
	<li>转换 R相关性 绝对反射率，R绝对值，如第1节参考文献1,2中所述。
	<ol>
		<li>在 Intralipid-20% 模体（Fresenius Kabi，瑞典）中，获取随着3%等分份数增加至48%时的相对反射率测量值 Rrel，即， 3%、6%、9%、……、48%）并绘制相对电阻率（Rrel）与Intralipid浓度的关系图。</li>
		<li>生成 R 的绝对值图绝对值 与 μs使用反射率的扩散方程。14</li>
		<li>使两条曲线的峰值对齐，并调整 Rrel 的 x 轴以匹配 Rabs x轴</li>
		<li>在给定波长和源-探测器间距下，使用以下公式对 y 轴进行缩放： 
		<img alt="Equation for scale factor in experimental data analysis; formula for normalization process." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
		注意：在以下部分中，所有测量数据的拟合均指 Rabs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 光谱数据拟合
注意：以下部分概述了用于提取小鼠皮肤功能参数的理论及拟合算法。有关所采用的全部理论，请参考以下文献14-18及其引用文献。所有方程均假定在物理或工程实验室中常用的高端科学软件环境（包含预编程模块）中进行编程。
<ol>
	<li>编写一个描述吸收光谱的函数， μa(λ) 通过以下方程，将皮肤在目标光谱范围内的相关单个发色团贡献相加得到： 
	<img alt="Hemoglobin absorption equation for optical property analysis; relevant to spectroscopy studies." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
	此处， Hb 为总血红蛋白浓度（g/L），而 StO2 是无量纲的氧饱和度，取值范围为 0 到 1。</li>
	<li>获取氧， <img alt="Static coefficient formula, μa, Hb absorption, λ symbol, spectral analysis result." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1">和脱氧， <img alt="Absorption coefficient equation for deoxygenated hemoglobin, symbol representation in spectroscopy." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1">，来自Prahl在线收藏的血红蛋白光谱（以文本文件形式存储）19.</li>
	<li>编写一个描述皮肤散射光谱的函数， <img alt="Scattering coefficient equation μs'(λ)=A(λ/λo)^-k, optical properties analysis." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1">，使用幂律依赖关系，其中 A 厘米-1) 的值为 μs' 在 λ 处o = 1 nm 和 k 是一种与介质相关的功率因数16.</li>
	<li>根据参考文献14中的公式，编写一个基于漫反射前向模型的数学函数，将第8.2–8.3步中的光谱方程整合到该前向模型函数中即，R(r, μa(λ) μs(λ)) = R(r, Hb，StO2, A, k). 
	注意：尽管存在多种模型，稳态扩散理论方程仍能对组织中的光分布提供一种简单而准确的描述。</li>
	<li>编写一个函数，用于计算第8.4节中前向模拟的反射光谱与实测反射光谱之间差异的平方。</li>
	<li>迭代式改变 Hb，StO2, A，以及 k 直到8.5节中的最小二乘差值函数达到最小。可使用MatLab的lsqcurvefit函数自动执行此步骤。</li>
	<li>重复步骤 8.5 - 8.6 以获得 DOS 参数（Hb，StO2, A，以及 k) 适用于所有测得的反射率数据集。</li>
	<li>使用每只小鼠3至5个归一化探针信号点测量值的平均值，绘制DOS参数相对于相应唯一基线测量值的相对变化。这些图使用MatLab的plot命令创建。</li>
</ol>
9. 皮肤放射性皮炎视觉评分期
<ol>
	<li>照射后每 48 小时使用定性分级量表（参见 Douglas 和 Fowler 分级量表20）监测并评分皮肤反应强度（也可在照射后 3 - 24 小时观察变化）。建议由两名不知分组情况的研究人员进行评估。使用手持相机拍摄照片，并附带参照标尺（i.e., 直尺），有助于评估结果的一致性。</li>
	<li>注意：照射后每两天对皮肤进行一次评分，有助于确定该模型的最佳 DOS 测量时间点。根据具体动物模型和研究问题的不同，更频繁的评分可能提供重要数据。</li>
	<li>绘制每组在各个时间点的中位数值。比较各组在特定时间点的结果，或比较各曲线下的中位数总面积。</li>
	<li>当小鼠观察至达到预期的皮肤愈合程度（e.g.，4 周）后，采用适当的（经批准的）方法处死小鼠。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用光学生物标志物定量评估放射性皮肤毒性的DOS方法。传统的视觉皮肤毒性评分系统需要专家培训，即便如此仍容易出现观察者间差异和主观性。DOS系统及其分析软件操作简便，所需培训极少，可提供用于解读皮肤生理变化的客观功能参数。此外，DOS不仅将皮肤病变的外观描述为单一参数，还能提供光谱形状、光学特性以及功能/微结构参数等大量信息，从而在敏感性和特异性方面超越现有的定性评分方法。第1节和第7节重点介绍了获取可用于光学生物标志物定量拟合的绝对光谱数据的主要处理步骤。背景和基线校正至关重要，可使用户在常规光照条件下进行DOS测量。第8节提供了描述裸鼠在X射线照射前后生理状态所需的相关模型和方程。在此过程中，选择合适的吸收体对准确拟合实测光谱至关重要。建议用户在构建光学生物标志物拟合模型前，充分查阅文献，明确在特定研究中所用波长范围和目标组织内的主要吸收体成分。最后，第3至第5节描述了DOS测量过程中裸鼠的操作方法。为避免干扰局部血管系统，应轻柔施力，将DOS探头置于小鼠皮肤表面。
尽管与高光谱相机系统相比成本相对较低3,4，但所描述的DOS方法存在一个明显局限性，即使用点探头测量漫反射。这种反射几何结构需要探头轻柔接触皮肤，若探头与皮肤之间的压力不一致，可能因扰动血管网络而引入测量不确定性。未来的DOS探头设计可集成压力传感器，以确保测量结果的一致性。此外，尽管采用较近的光源-探测器间距（&#60; 2–3 mm）可实现针对皮肤表层的特定光学探测深度，但与二维高光谱成像相比，其空间分辨率有所降低。为尽量减少这一局限性，本研究采用了五点象限扫描法，以覆盖整体辐照区域。尽管空间分辨率有限，先前在小鼠中的研究5已表明，对稀疏区域取平均的光学生物标志物不仅能够区分辐照与非辐照皮肤，还能反映诸如Vasculotide6等皮肤保护性干预药物的作用效果。
需要注意的是，尽管整体系统设计可针对不同的皮肤模型进行修改，但其基础的光谱和散射形状可能需要优化。具体而言，氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白能够很好地描述无胸腺小鼠模型，但将同一模型应用于较深肤色时，可能需要添加黑色素以实现最佳拟合。此外，若将 DOS 的带宽扩展至更高波长（&#62; 950 nm），则需要引入水的成分，因为在更高波长范围内水的吸收占主导地位。再者，具有不同皮肤厚度的动物模型可能需要采用不同的源-探测器间距，以优化对深度的敏感性。最后，无毛特征使算法更为简化。尽管非无毛模型可能更适合某些研究问题，但在进行 DOS 测量前需去除毛发，而该过程可能引起的皮肤刺激会影响实验结果。对于需要完整免疫功能的研究，具有正常免疫功能的无毛小鼠（例如，SKH-1）因其有胸腺的特性，可能是更优的模型选择。
进行DOS探针测量时的重要考虑因素包括保持恒定的室温以及准确估算照射区域。温度波动可能影响组织中的血红蛋白（Hb）和组织氧饱和度（StO2）水平。在每次数据采集时间点测量一组3只未照射动物，可作为基线，用于校正参数值中意外的环境波动。此外，在损伤于第5天左右（40 Gy）开始出现明显视觉表现之前，若皮肤皮瓣制备不一致，照射区域可能难以准确估算。如果使用黑色永久性记号笔标记辐射暴露皮肤的边界，应避免使用过多墨水，以防墨迹模糊而影响测量读数。
该系统的另一特性是能够区分吸收特性与散射特性。尽管其他高光谱成像系统也能监测氧合血红蛋白（oxyHb）和脱氧血红蛋白（Hb）浓度，但高光谱成像的自由空间几何结构无法解析散射变化。如果由于红斑（发红）引起显著的散射变化，则这一局限性可能导致返回的oxyHb、Hb和StO2参数不准确。此外，利用扩散光学光谱（DOS）监测散射变化可能为红斑评估提供额外的光学生物标志物。如图6所示，Yohan et al.（2014）的初步结果表明，参数A和k在电离辐射后的时序变化趋势与其他替代方法（如视觉评分系统）所观察到的趋势并不相关。这表明散射变化并不以可视化的形式表现出来，实际上可能反映了一个独立的生物学过程。因此，与替代方法相比，DOS能够对表层散射变化提供高分辨率检测，为探索可能独立于常规血红蛋白相关测量的新型皮肤损伤生物标志物提供了途径。
尽管本模型采用单次大剂量辐射（而非临床环境中使用的多次小剂量分次照射），但这模拟了人类皮肤急性辐射毒性的病理生理过程21预计随着进一步优化，DOS 可能为放射性皮肤反应的自动化和标准化评分提供一种定量方法。掌握该技术后，未来应用可能包括监测不同皮肤保护治疗药物之间的差异（例如， 比较对照组与实验组在皮肤放射防护或促进伤口愈合治疗中氧合血红蛋白（oxyHb）水平的差异。尽管该DOS系统非常适合用于动物模型中的高通量药物筛选，但由于其操作简便且可在正常光照条件下进行测量，因而也具备应用于临床环境的潜力。在此情况下，探头设计可能需要进行轻微调整，例如适当增加光源与探测器之间的间距，以适应人类皮肤较厚的特点。临床用DOS系统将能够实现对干预性治疗方案的在线评估，有助于减轻患者疼痛性皮肤反应，提升患者舒适度与治疗依从性。未来，将基于DOS的定量分析拓展至慢性放射性皮肤损伤特征的研究可能具有重要意义。例如， 纤维化）

放射治疗（RT）在计划和实施方面的技术进步，如今已能够将高度适形的治疗剂量精确递送至肿瘤区域，同时最大限度地保护周围的正常组织。然而，当高剂量靶区靠近皮肤时，急性甚至有时严重的毒性反应仍难以避免。若损伤足够严重，由此导致的正常组织损害可能对放射治疗的效果及患者的生活质量产生负面影响1,2。
尽管放射性皮肤红斑具有严重的不良后果，目前对其管理仍缺乏特异性，主要依赖乳膏或软膏进行治疗，而这些方法忽视了导致损伤的根本生物学机制。这些干预措施仅以缓解症状为目标，而非针对病因。此外，由于放射性皮肤损伤评估具有定性和主观的特点，干预治疗的时机和给药方式也因此变得复杂。虽然一些公认的组织（如RTOG、EORTC）提供了视觉分级建议，但各医疗机构在首选评分系统的选择上存在差异，从而影响了正常组织毒性的比较，不利于开展荟萃分析。此外，此类分级系统较为粗略，且容易出现观察者间差异，导致在评估毒性减缓策略的研究中，难以辨别放射性损伤严重程度的差异。
与其通过视觉描述辐照皮肤红斑的程度，另一种方法是测量能够定量反映器官内部生理变化的参数。血红蛋白（Hb）、组织氧饱和度（StO2）或氧合血红蛋白（oxyHb）水平已被用作小鼠辐射诱导红斑的替代指标3-6。辐照后，总Hb水平会出现波动，而oxyHb或StO2则表现出特征性的早期急剧升高，随后下降，并出现另一个更持久的升高过程3,6。当使用刺激物诱导皮肤红斑时，血管中oxyHb水平与局部红斑和炎症的严重程度直接相关7。
扩散光学光谱（DOS）利用近红外光提供有关活体组织生化和微结构组分的功能信息。这种定量、无创的光学技术可通过血红蛋白（Hb）浓度和组织氧饱和度（StO₂）等功能性替代指标，测量红斑发生过程中由细胞因子诱导的血管舒张。2近期将DOS测量参数与受控临床评分方法进行比较的研究8-11 表明该技术在克服当前分级方法固有局限性方面的潜力 系统。
本文介绍了一种自主研发的便携式DOS系统，该系统采用功能性替代指标，在临床前小鼠模型中定量检测辐射诱导皮肤毒性的差异5。所述平台可能提供一种标准化的红斑评分方法，具有高灵敏度，可用于早期发现及对干预药物反应的细微差异进行区分。此外，经过少量改进后，该仪器未来或可应用于临床，实现床旁实时监测。

<table><tbody><tr><td>裸鼠</td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Charles River</td><td>Athymic nude Crl:NU(NCr)-Foxn1nu，或免疫活性裸鼠 Crl:SKH1-Hrhr</td><td></td></tr><tr><td>小型动物照射仪&amp;nbsp;</td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Faxitron X-Ray Corp.</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>动物麻醉设备&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>若使用带有诱导室的异氟烷蒸发器装置，则需要导管和鼻罩。</td></tr><tr><td>铅制夹具和有机玻璃平台</td><td>定制</td><td></td><td>若照射装置会使整个动物体暴露于辐射下，则必须使用铅屏蔽，仅使皮肤瓣暴露。</td></tr><tr><td>医用胶带&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>永久性标记笔/耳缘打孔器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc., Natick, MA</td><td></td><td>需配备 StatisticsToolbox&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments, Vaudreuil-Dorian, QB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOS 系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学多路复用器</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>型号 MPM-2000</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>型号 S200</td><td></td></tr><tr><td>白光光源</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>型号 LS-1</td><td></td></tr><tr><td>20% 脂肪乳（Intralipid-20%）</td><td>Kabi Pharmacia, New York, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反射率标准板</td><td>INO, Quebec City, QB</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用小鼠模型通过扩散光学光谱法对急性电离辐射诱导的皮肤毒性进行定量评估

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

电离辐射（IR）引起的急性皮肤毒性是外照射放射治疗（RT）过程中常见的副作用，会对患者的生活质量和长期生存产生负面影响。随着对正常组织毒性相关生物学通路的认识不断深入，已推动了干预性药物的开发；然而，目前的疗效评估研究受限于缺乏用于量化皮肤反应严重程度的客观指标。本文介绍一种扩散光学光谱（DOS）方法，可提供皮肤对辐射反应的定量光学生物标志物。我们描述了DOS系统的仪器设计以及用于提取光学参数的反演算法。最后，为展示其临床应用价值，我们展示了辐射诱导红斑的临床前小鼠模型中的代表性数据，并将结果与常用的视觉评分方法进行比较。所描述的DOS方法通过功能反应实现了对皮肤毒性的客观、高通量评估，具有向临床转化的潜力。

DOS 反射率技术为评估辐射诱导皮肤毒性的传统定性方法提供了一种客观的替代方案。在受到毒性剂量辐射后，皮肤外观的视觉变化表现为所测反射光谱在幅度和形状上的改变，二者均与基础细胞微结构及组织生理状态的功能性变化相关。本节将回顾 Yohan et al. 20145 之前发表研究中的代表性结果。
图3（左）显示了在40 Gy照射后第6天，于皮肤红斑的裸鼠模型中，源间距为260 μm时测得的代表性光谱（浅蓝色细线）。与照射前（图3，右图）相比，在约550–650 nm波长范围内的光谱形状出现差异，这可能是由于氧合血红蛋白增加所致。同时观察到绝对反射率有轻微升高，这与组织散射能力的增强相关。照射后第6天所观测到的光谱对应于0.75的视觉皮肤评分。
在特定波长下评估辐照后的反射率变化，并未利用完整的反射光谱，且可能存在对噪声敏感的问题。然而，通过对完整光谱进行拟合，可将整个数据集转化为直观的光学生物标志物（Hb、StO2）。图3展示了利用第4节中所述方程对测量数据（细的带噪声曲线）进行拟合的结果（绿色实线）。拟合结果与实测数据高度一致，表明所选择的基础发色团及散射模型能够充分描述小鼠皮肤模型的光学特性。
由于DOS系统具有非侵入性和自校准的特性，因此可以在不同光照条件下连续多天方便地进行测量。图4显示了经照射的小鼠群体（n=8）在不同时间点（第6、9、12天）皮肤组织氧饱和度（StO2）的相对变化，而图5则显示了相应的定性皮肤反应评分。观察到StO2呈进行性升高，与照射前值相比，在全部3个时间点均具有统计学差异（p &lt; 0.05）。这些趋势与肉眼观察到的皮肤损伤严重程度的增加相一致，损伤程度在第12天达到峰值（平均评分约为3），表明StO2可作为视觉评分替代指标的潜力（图5）。
需要注意的是，在12天的测量期间，未照射的对照组（n=3）的所有返回光学生物标志物均未观察到具有统计学意义的变化（数据未显示）。A 和 k 的变化也可随时间进行监测（图6），这些变化表明皮肤的散射特性正在响应辐射而发生改变。
<img alt="用于组织分析的漫反射光谱系统装置，包含光纤示意图和设备。" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. DOS仪器装置。（A） 漫反射测量几何结构示意图。（B） 光纤探头：光学探头由一组线性排列的芯径为200 μm的光纤组成，这些光纤被捆束成一根18 G的金属针，光纤间距为260 μm。其中两根光源光纤连接至两个宽带发光二极管，一根检测光纤则连接至光学光谱仪。通过依次开启每个光源，光谱仪可采集距离每根光源光纤260 μm和520 μm处的漫反射信号。（C） 完整的DOS系统，包括笔记本电脑、连接的光纤探头和光学盒：采用自动化数据采集程序控制光谱的顺序采集。电子元件集成于一个采集盒中，并通过SMA接头与光纤探头连接。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="瞬态吸收光谱图；不同条件下的光学激发分析。" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 光谱处理。 所有横坐标刻度单位均为 nm：(A) 原始相对光谱，基线为大约 900 - 1,000 nm 范围内的读数，且近似等于背景信号。(B) 相对背景读数。(C) 扣除背景和基线后的相对光谱。(D) 对 (C) 中所示处理后的光谱进行缩放校正后得到的绝对校准光谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有模型拟合和原始数据的反射光谱图；光学数据分析，光谱拟合。" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 照射后第6天未照射（左）和已照射（右）小鼠皮肤的典型白光反射光谱。 测量值（嘈杂的蓝色曲线）与拟合结果（实心绿色曲线）之间通常表现出极好的一致性。两组之间观察到两个关键差异：1）绝对反射率的整体增加；2）在550–600 nm范围内的光谱形状发生明显变化。经Yohan et al. 20145许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="ΔStO2 比较图表；不同小鼠在不同时间点（第6、9、12天）的 ΔStO2 与小鼠编号关系；分析40 Gy PBS处理的影响。" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 小鼠皮肤氧合分数在40 Gy照射后的变化。 两组之间（每只小鼠）经基线归一化的平均差异在第6天（方框1）、第9天（方框2）和第12天（方框3）均具有显著性。经Yohan et al. 20145许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="皮肤红斑评分与照射40 Gy后天数的关系；折线图；辐射效应分析。" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 40 Gy照射后小鼠皮肤平均定性反应评分（n=8）随时间的变化。改编自Yohan 等，20145。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>。
<img alt="比较数据值图表；ΔA，Δκ 与小鼠；辐射效应研究；40Gy PBS 处理。" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 小鼠皮肤在40 Gy照射后第6天（方框1）、第9天（方框2）和第12天（方框3）的A和k的相对变化。第6天（方框1，左侧和右侧）的A值（左侧）和k值（右侧）变化具有显著性（p &lt; 0.026）。经Yohan et al. 20145许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们介绍一种扩散光学光谱（DOS）方法，该方法可提供皮肤对辐射反应的定量光学生物标志物。本文描述了DOS仪器的设计、光学参数提取算法，以及在辐射诱导红斑的临床前小鼠模型中获取代表性数据所需的动物操作流程。

电离辐射（IR）引起的急性皮肤毒性是外照射放射治疗（RT）疗程中常见的副作用，以及……

该漫反射光谱技术的总体目标是建立一种用于描述急性辐射诱导红斑的定量生物标志物。该方法可用于放射治疗领域，作为预测性生物标志物以识别有发生重度放射性皮肤毒性风险的患者。因此，该技术的主要优势在于其能够提供一种客观且系统的量化指标，用于评估放射性皮肤毒性。我将演示漫反射光谱技术，而Loo实验室的研究人员Elina将负责处理小鼠。首先打开电子设备并等待系统启动。然后关闭房间内的所有荧光灯，并将白炽灯放置在距离测量装置一定距离的位置，以提供适当的照明。接下来，设置用于采集小鼠皮肤数据的仪器参数。将信号参数设置如下：采集时间设为25毫秒，信号平均次数设为25，盒式滤波器宽度设为1。这些参数在采集时间与信噪比之间提供了合理的平衡。接下来，使用自定义编程的采集软件，在LED关闭时自动采集背景信号。然后，在两个不同的光源-探测器间距下采集漫反射信号。在260微米处取一次测量值，520微米处取第二次测量值。总采集时间应约为两秒。麻醉小鼠后，将其转移至已灭菌的DOS探查区域。将其侧放，并用输送2%异氟烷气体的鼻罩固定其鼻部，以维持麻醉状态。现在用70%乙醇对探头进行消毒，但不要试图对皮肤进行消毒。轻轻将已消毒的探头接触侧腹皮肤。切勿用力过猛，以免探头压力破坏局部血管结构。手持探头时，在待照射的 2 厘米见方区域内采集反射率数据。按照骰子上的五点排列方式采集数据。在后续所有测量中保持相同的模式和探针压力。测量完成后，将小鼠放入恢复笼中。在小鼠恢复期间，对下一只小鼠重复该操作。该操作步骤需根据所用辐照仪的具体情况进行调整。可根据需要修改操作，以辐照皮肤的小部分区域。麻醉小鼠后，轻轻捏起其侧 flank 部分的皮肤，并用胶带将拉伸的皮肤固定，形成皮瓣。然后将小鼠放置在聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）平台上，并用定制的铅夹具覆盖其身体。使用一个两侧可打开且带有照射窗口的铅盒，将待照射的皮肤通过夹具窗口拉出，并用胶带将皮肤固定在平台上。如果小鼠未被固定装置固定，请为其注射麻醉剂。然后将带有固定装置和小鼠的载物台放入辐照仪中。计算所需的辐照剂量。例如，使用一个峰值管电压为160千伏、距离11厘米的X射线源，在6.3毫安下照射2.5分钟，可充分照射皮肤。随后，给予计算好的剂量。给药后，将动物放回恢复笼中。从麻醉中恢复后，将小鼠放回正常的合养笼中。按照所述方法对小鼠进行辐照并测量。辐照前，使用无胸腺小鼠皮肤模型，在260微米源分离条件下采集基线光谱。粗的绿色线显示了对细的蓝色线的数学拟合。与40戈瑞照射后第六天的测量结果相比，在550至600纳米之间的光谱形状差异明显，这可能是由于氧合血红蛋白增加所致。还观察到绝对反射率有轻微上升，可能与组织散射能力的增强相关。拟合后的数据可提供可量化的光学生物标志物，这些标志物可作为辐射后时间的函数进行追踪。例如，组织氧饱和度测量值在辐射后逐渐升高。该定量数据与皮肤毒性的视觉评分相关，后者在辐射后也呈进行性增加。观看本视频后，您应能充分理解如何利用漫反射光谱技术对放射性皮肤毒性进行定量评分。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到三分钟内完成。在实施该操作时，需注意轻柔按压DOS探头，以避免扰动血管网络。该技术可用于放射治疗领域，通过关联生理参数来描述正常组织对辐射的反应。

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