血管平滑肌细胞钙化及主动脉钙化与炎症成像

本实验的总体目标是体外可视化主动脉血管钙化，并利用培养的原代小鼠主动脉平滑肌细胞建立体内血管钙化模型。该方法可通过提供一种体外模型来研究血管钙化的分子机制，并实现对体内血管钙化及巨噬细胞炎症的评估，从而有助于回答血管疾病生物学领域的关键问题。该技术的主要优势在于，即使在疾病早期阶段，也能对动脉粥样硬化病变中巨噬细胞活性与钙沉积进行高灵敏度的定量分析及共定位检测。

除 Caitlin 和我之外，我们实验室的技术员 Robert Tainsh 也将演示此操作。开始操作时，用酒精棉片对小鼠尾部进行消毒，并在尾部侧面定位尾静脉。接着，在无阻力的情况下，将30号针头插入尾部，同时对注射器施加轻微的向前压力。

然后以恒定速率注射100微升钙NIR和/或100微升组织蛋白酶NIR。注射后五秒拔出针头，并在注射后3至24小时采集主动脉。在解剖显微镜下，去除腹膜以暴露腹腔器官。

随后，移除胃肠道器官时需注意不要切断主动脉。接着，在膈肌前部做一侧向切口，并沿腹部延续该切口。使用解剖剪剪断肋骨两侧，游离附着于胸骨上部的软组织，从而松解肋骨 cage。

然后移除肋骨笼并暴露肺部。小心地取出肺脏。接下来仔细移除气管和食管，确保主动脉保持完整。

随后，从髂动脉分叉处至主动脉弓，逐步清除主动脉周围的软组织。在去除主动脉周围脂肪时需格外小心。之后，清除胸主动脉及主动脉弓主要分支周围残留的脂肪和软组织。

接下来，取出胸腺。然后小心分离近端主动脉，将心脏从胸腔中取出。接着在髂动脉分叉处横断远端主动脉。

使用胰岛素针头，从主动脉弓向主动脉内注入生理盐水，以冲洗残留的血细胞。沿主动脉弓血管分离主动脉，并将其完整地从体内取出。将主动脉置于冰上盛有生理盐水溶液的容器中，待成像前保存。

在此步骤中，将主动脉置于冷的HBSS中，直至解剖完成。在无菌组织培养罩内，将主动脉转移至35 × 10毫米组织培养皿中的主动脉消化液中，然后于37°C孵育30分钟，并轻轻间歇性摇动。

消化后，主动脉应呈现拉伸或松散的外观。在解剖显微镜下，去除主动脉的外层外膜，同时保持中膜层完整。操作时，从主动脉一端开始剥离外层，并像脱袜子一样将其从下方完整的中膜层上完全移除。

去除外膜层后，将剩余的主动脉置于新的培养皿中，加入细胞培养基，在37摄氏度下孵育2至4小时。随后，将主动脉切成1至2毫米宽的环状片段。将这些组织环转移至新的组织培养皿中，加入主动脉消化液，在37摄氏度下轻轻间歇摇动孵育120分钟。

孵育期间，用移液器将溶液上下吹打数次以重悬细胞。随后，向消化液中加入5毫升预热的细胞培养基，并转移至15毫升锥形离心管中。在200 ×g条件下离心5分钟，然后吸去上清液，将细胞重悬于所需体积的细胞培养基中。

为诱导血管平滑肌细胞钙化，将细胞接种至六孔培养板中，使其贴壁。随后用钙化培养基更换培养液。于37摄氏度孵育至少七天。

随后，吸除细胞培养板中的培养基，用去离子水洗涤细胞一次。将细胞置于1毫升10%甲醛溶液中，室温固定20分钟。

然后去除甲醛溶液，用蒸馏水洗涤固定后的细胞5分钟。接着将细胞置于1毫升5%硝酸银溶液中，在60至100瓦灯泡下孵育1至2小时。随后吸去硝酸银溶液，并用蒸馏水洗涤5分钟。

五分钟后，将细胞置于1毫升含5%硫代硫酸钠的蒸馏水溶液中五分钟，以去除未反应的银。随后，用蒸馏水冲洗细胞五分钟。经冯科萨染色的细胞现已准备好，可使用标准倒置光学显微镜进行成像。

在本图中，野生型MGP基因敲除小鼠和LDLR基因敲除小鼠通过尾静脉注射钙NIR和组织蛋白酶NIR，24小时后取主动脉，采用近红外荧光成像进行检测。野生型小鼠几乎无主动脉钙化或巨噬细胞浸润。LDLR基因敲除小鼠的主动脉表现出广泛的钙化，且钙化区域与巨噬细胞聚集部位共定位。

相比之下，MGP基因敲除小鼠会出现主动脉钙化，且该过程不伴随巨噬细胞浸润。本实验中，培养的主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）取自MGP基因敲除小鼠，并用表达GFP或MGP的腺病毒进行感染。取自野生型小鼠的主动脉VSMCs则转染对照用乱序siRNA或靶向MGP的siRNA。

细胞在钙化培养基A中培养七天，随后固定并用冯科萨染色法染色。通过ImageJ软件在扣除背景后对钙沉积染色进行定量分析。这些技术的建立使科学家能够对外植的动脉粥样硬化和血管钙化进行成像。

为了在体外建立血管钙化的模型，这为测试新型药物治疗对血管疾病的影响提供了可能。观看本视频后，您应能充分理解如何分离小鼠主动脉并获取原代主动脉血管平滑肌细胞，以及如何利用近红外荧光成像探针在体外对动脉粥样硬化斑块和钙化的血管平滑肌进行可视化观察。