使用线性琼脂糖通道研究 Drosophila 幼虫爬行行为

本实验的总体目标是观察幼虫期果蝇在直线型琼脂糖通道中的爬行行为，以研究神经回路的发育过程。该方法有助于回答神经行为学和发育生物学领域中的关键科学问题，例如解析产生运动模式的神经编码机制，以及鉴定调控运动控制相关神经回路形成的关键遗传与细胞过程。该技术的主要优势在于能够限制幼虫的行为谱，从而使研究人员可以对单一的多模式运动行为进行深入细致的研究。

演示该实验操作的是来自我实验室的技术员Zarion Marshall。首先，必须评估幼虫的健康状况。在记录前3至4天，更换成虫饲养笼的收集板。

每天在同一时间进行此项操作。统计培养皿中的卵和新孵化的幼虫数量。预期的卵数在500到2,000之间。

根据需要调整笼中的成虫数量。24小时后检查培养板，以确定幼虫是否健康。大多数卵应已孵化为幼虫，且幼虫应已爬入酵母糊中。

健康状况不佳的表现包括大量未孵化的卵、远离酵母糊的死亡幼虫体，以及腹部出现异常深色斑块的幼虫，后者是免疫反应的指征。若幼虫表现不健康，应更换饲养笼并使用新配制的培养板，并检查成虫的基因型。实验时应从1至2日龄的培养板中收集新孵化的二龄幼虫。

所有这些阶段均可用于分析。本方案中，使用线性通道的PDMS浇铸模具。用异丙醇清洗浇铸模具。

干燥后，将模具放入一个直径十厘米的培养皿盖或类似的容器中。然后向模具中加入已冷却至55摄氏度的3%琼脂糖。倾倒琼脂糖时需小心，避免在模具中混入气泡。

琼脂糖应刚好覆盖模具。待其凝固后，将琼脂糖通道从模具中取出。修整圆盘状通道的边缘，然后将通道浸入水中。

它们可在 4°C 的水中保存长达七天。使用通道前，需使其恢复至室温。选择与幼虫宽度相匹配的通道。

通道的宽度范围为100至300微米，深度均为150微米。然后使用干净的刀片从制备好的圆盘上切下一条通道。用镊子将通道转移至适当尺寸的玻璃盖玻片或载玻片上，确保沟槽面朝上。

接下来，使用精细镊子轻轻夹取幼虫，避免挤压。使用尖端精细的画笔也可取得良好效果。若幼虫受到挤压，其疼痛反射（如翻滚或蜷缩）可能会主导其在通道中的行为。

现在将幼虫短暂浸入水中清洗，然后轻轻将其放入切开的通道中，并小心调整至合适位置。幼虫进入通道后，调整其方向，以便于对目标结构进行成像。随后在通道两端各加入一到两滴水，使通道内充满水。

如果有气泡被困住，可轻轻抬起通道的两侧以去除气泡。如需进一步调整幼虫的方向，可轻推通道使其缓慢滚动幼虫。此时幼虫已准备好进行成像。

幼虫在直线通道中进行持续的节律性爬行。荧光探针易于观察。例如，利用GAL4驱动子在神经元中表达GFP的幼虫，在爬行周期中其神经索发出的荧光强度会呈现动态变化。

当肌肉收缩波沿身体纵轴传递时，中枢神经系统（CNS）几乎与幼虫头部和尾部同时向前移动，导致CNS进出焦平面，从而引起神经索荧光信号的变化。从三只幼虫的三次爬行步态中量化了荧光变化。神经索荧光在步态周期中的动态变化呈现出可重复的模式，可用于表型分析。

观看本视频后，您应了解如何收集用于行为学实验的幼虫、制备琼脂糖通道，以及将幼虫装载到通道中以观察其直线爬行行为。在进行该操作时，务必记住要轻柔地处理幼虫。