用线性琼脂糖渠道研究果蝇幼虫爬行行为

果蝇幼虫是研究行为的神经控制功能强大的模型系统。该出版物描述了使用线性琼脂糖通道引发线性爬行和方法的持续发作期间重复爬行行为量化幼虫结构的动力学。

该程序的总体目标是观察幼虫期果蝇在线性琼脂糖通道中爬行，以研究神经回路的发育。这种方法可以帮助回答神经行为学和发育生物学领域的关键问题，例如理解产生运动模式的神经密码以及识别确定范围为运动控制的神经元回路的关键遗传和细胞过程。这种技术的主要优点是它限制了幼虫的行为库，以便研究人员可以详细研究单个多模式。

演示该程序的是我实验室的技术人员 Zarion Marshall。首先，评估幼虫的健康状况很重要。记录前 3 到 4 天，更换成虫笼的收集板。

继续每天和一天中的同一时间执行此作。数盘子上的鸡蛋和新孵化的幼虫。预计鸡蛋数量在 500 到 2， 000 之间。

根据需要调整笼子中的成虫数量。24 小时后，我们检查平板以确定幼虫是否健康。大多数卵应该已经孵化成幼虫，幼虫应该已经爬进酵母糊中。

健康状况不佳的迹象包括大量未孵化的卵、远离酵母糊的死幼虫体以及腹部有异常深色斑块的幼虫，这是免疫反应的指标。如果幼虫看起来不健康，请使用新鲜制备的板更换笼子，并检查成虫基因型。对于实验，从 1 到 2 天大的板中收集新孵化的第二龄幼虫。

所有这些阶段都可以在分析中使用。对于此协议，有一个线性通道 PDMS 铸造模具。用异丙醇清洁铸模。

干燥后，将模具放入 10 厘米的盖子或类似容器中。然后在模具中加入冷却至 55 摄氏度的 3% 琼脂糖。小心地倒入琼脂糖，以避免在模具中捕获气泡。

霉菌应刚好被琼脂糖覆盖。凝固后，从模具中取出琼脂糖通道。修剪圆盘形通道的边缘，然后将通道浸入水中。

它们可以在 4 摄氏度的水中储存长达 7 天。在使用通道之前，让它们加热至室温。选择与幼虫宽度匹配的通道。

通道的宽度从 100 到 300 微米不等，深度均为 150 微米。然后使用干净的剃须刀片从准备好的光盘上切出一个通道。用镊子将通道转移到适当大小的玻璃盖玻片或载玻片上，凹槽面朝上。

接下来，使用细镊子轻轻地拾取幼虫，不要挤压它。细尖的画笔也很好用。如果受到挤压，滚动或驼背等疼痛反射可能会主导幼虫在通道中的行为。

现在将幼虫短暂浸入水中清洗幼虫，然后将其放入切割通道中，轻轻地将其梳理到位。进入通道后，调整幼虫的方向，使感兴趣的结构易于成像。然后在通道的两端滴一两滴水，使通道充满水。

如果有任何气泡被困住，请轻轻提起通道的侧面以将其去除。为了进一步调整幼虫的方向，轻轻轻推通道以滚动幼虫。幼虫现在可以进行成像了。

线性通道中的幼虫进行持续的有节奏的爬行。荧光探针很容易检查。例如，在 GAL4 驱动基因的神经元中表达 GFP 的幼虫在爬行周期中表现出神经脊髓发出的荧光强度的动态变化。

中枢神经系统与幼虫头部和尾部几乎同时向前移动，当肌肉收缩波沿体轴通过时，中枢神经系统进出焦点平面，导致神经索的荧光发生变化。从 3 只幼虫的 3 次爬行步幅中量化荧光变化。神经脊髓荧光在步幅周期中的动力学遵循可用于表型分析的可复制模式。

观看此视频后，您应该了解如何收集幼虫进行行为，准备琼脂糖通道，以及将幼虫加载到通道中以可视化线性爬行行为。在尝试此程序时，重要的是要记住轻柔地处理幼虫。