Name: 使用荧光素二乙酸酯 - 碘化丙啶双重染色在小脑颗粒神经元培养中评估神经元活力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习使用荧光素二乙酸酯和碘化丙啶双重染色技术评估小脑颗粒神经元培养中的细胞活力。该方法可区分神经元与胶质细胞，为神经科学和神经药理学研究提供可靠的细胞活力检测方案。

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本工作得到了浙江省自然科学基金（LY15H310007）、浙江省公益性技术应用研究项目（2016C37110）、国家自然科学基金（U1503223，81673407）、宁波市国际科技合作项目（2014D10019）、宁波市生命科学与健康创新团队项目（2015C110026）、广东省科技计划国际合作项目（No. 2013B051000038）、深圳市基础研究计划（JCYJ20160331141459373）、粤港科技合作资助计划（GHP/012/16GD）、香港研究资助局（15101014）、香港理工大学（G-YBGQ）以及宁波大学“王宽诚”基金的资助。

所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版），并经宁波大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（SYXK-2008-0110）。
1. 溶液与培养基的制备
注意：试剂和储备液需在无菌条件下配制。使用孔径为 0.22 µm 的滤器过滤除菌。
<ol>
	<li>通过加入 5 mg 的聚-L-赖氨酸（PLL）制备 PLL 储存液 &#160;至10 mL的双蒸水（ddH₂O）2O). 过滤除菌。分装后于 -20 ℃ 保存 PLL 储存液 &#176;可保存数月。</li>
	<li>通过加入 7.25 g NaCl、0.4 g KCl、0.14 g NaH₂PO₄、0.37 g MgSO₄·7H₂O、0.294 g CaCl₂、2.1 g NaHCO₃ 和 1.7 g 葡萄糖，用去离子水定容至 1 L，配制 Krebs 缓冲液。2PO4，2.6 g D-葡萄糖和5.94 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸加入100 mL ddH2O. 过滤除菌。将 Krebs 缓冲液于 4 ℃ 保存 &#176;C，最长可达一个月。</li>
	<li>制备 3.82% Mg2SO4 通过加入 3.82 g Mg 溶液2SO4 至 100 mL 的 ddH2O. 过滤除菌。储存 Mg2SO4 4 ℃ 的溶液 &#176;可保存数月。</li>
	<li>制备 1.2% CaCl₂ 溶液2 通过加入 1.2 g CaCl₂ 制备溶液2 至 100 mL 的 ddH2O. 过滤除菌。将 CaCl₂ 储存于2 4 ℃ 的溶液 &#176;可保存数月。</li>
	<li>将15 g KCl加入100 mL ddH₂O中，配制2 M KCl溶液。2O. 过滤除菌。将 KCl 溶液在 4 ℃ 保存 &#176;可保存数月。</li>
	<li>将1.8 g D-葡萄糖加入100 mL ddH₂O中，配制D-葡萄糖储存液。2O. 过滤除菌。分装后于 4 ℃ 保存 D-葡萄糖溶液 &#176;C 下最多可保存一个月。</li>
	<li>制备胞嘧啶 &#946;将 0.24 g 的阿糖胞苷（Ara-C）加入 10 mL 去离子水（ddH₂O）中，配制 Ara-C 储存液2O. 过滤除菌。分装后于 4 ℃ 保存阿糖胞苷（Ara-C）储备液 &#176;数月</li>
	<li>使用25 mL胎牛血清（FBS）、2.5 mL 100倍谷氨酰胺、2.78 mL 2 M KCl溶液和2.5 mL 100倍抗生素，在基础伊格尔培养基（BME）中配制250 mL培养基（适用于25–30只新生鼠）。加水至终体积250 mL，并通过过滤除菌。</li>
	<li>在 BME 中加入 2.5 mL 100× 谷氨酰胺、2.78 mL 2 M KCl 溶液和 2.5 mL 100× 抗生素，配制 25K 培养基。定容至 250 mL，过滤除菌。</li>
	<li>在BME中加入2.5 mL 100倍谷氨酰胺和2.5 mL 100倍抗生素配制5K培养基。加水定容至250 mL，过滤除菌。 
	注意：培养基、25K 培养基和 5K 培养基需新鲜配制</li>
	<li>将 5 mg FDA 溶于 1 mL 丙酮中，配制 FDA 储存液。将 FDA 储存液于 4 ℃ 保存。 &#176;C 用于长期保存。</li>
	<li>将 1 mg PI 加入 1 mL ddH₂O 中，配制 PI 储存液。2O. 将 PI 储存液在 4 ℃ 保存 &#176;数月</li>
	<li>将 5 mg Hoechst 33342 加入 1 mL ddH₂O 中，配制 Hoechst 储存液。2O. 将Hoechst储存液于4℃保存 &#176;可保存数月。</li>
</ol>
2. 解剖溶液的制备
注意：在解剖前 1 天进行此操作。
<ol>
	<li>通过将15 mL Krebs缓冲液、1.2 mL 3.82% Mg2SO4溶液和0.45 g牛血清白蛋白（BSA）&#160;加入150 mL ddH2O中来配制解离溶液。用NaOH调节pH至7.4。</li>
	<li>将5个50 mL离心管分别标记为：1、2、3、4和5。</li>
	<li>将40 mL解离溶液装入带滤器的50 mL注射器中。将30 mL解离溶液过滤至1号管中，再将2 mL分别加入若干个35 mm细胞培养皿中，用于组织处理。</li>
	<li>向2号管中加入12.5 mg胰蛋白酶和50 mL解离溶液。充分涡旋混匀。通过过滤灭菌。</li>
	<li>向3号管中加入1.2 mg DNA酶I、7.8 mg大豆胰蛋白酶抑制剂以及15 mL解离溶液中的150 µL 3.82% Mg2SO4溶液。充分涡旋混匀。通过过滤灭菌。</li>
	<li>向4号管中加入3号管溶液5 mL，并加入10.5 mL解离溶液。通过过滤灭菌。</li>
	<li>向5号管中加入12.5 mL解离溶液中的100 µL 3.82% Mg2SO4溶液和15 µL 1.2% CaCl2溶液。充分涡旋混匀。通过过滤灭菌。</li>
	<li>所有离心管于使用前保存在4 °C。</li>
</ol>
3. 包被细胞培养板
注意：在解剖前 1 天进行此操作。
<ol>
	<li>将1 mL PLL储存液加入100 mL ddH2O中（终浓度：5 µg/mL）。向塑料6孔或12孔细胞培养板中加入5 µg/mL的聚-L-赖氨酸溶液进行包被（6孔板每孔2 mL，12孔板每孔1 mL）。</li>
	<li>室温孵育1天（或37 °C孵育2 h）。在解剖前1-2 h，用移液器吸除溶液，用ddH2O洗涤一次，并在细胞培养超净台中干燥。</li>
</ol>
4. 处理8日龄Sprague-Dawley大鼠的组织。
<ol>
	<li>将一个100 mm培养皿置于冰上。使用已灭菌的剪刀将新生大鼠幼崽断头并放入培养皿中。</li>
	<li>将剪刀插入枕骨大孔，从耳部向眼部方向剪开颅骨两侧。用镊子提起颅骨，确保整个脑组织保留在颅骨内。用镊子分离小脑，并将其放入上述35 mm培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下操作，使用两把镊子去除脑膜和血管。</li>
	<li>用刀片将组织切碎，将切碎的组织放入1号管中。在室温下以1,500 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留沉淀。</li>
	<li>向沉淀中加入2号管中的溶液，轻轻振荡重悬。</li>
	<li>将试管置于37 °C水浴中孵育15分钟，每3分钟轻轻振荡一次。</li>
	<li>向该溶液中加入4号管中的溶液，振荡混匀后在室温下以1,500 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留沉淀。</li>
	<li>加入3号管中的溶液以重悬沉淀。</li>
	<li>准备两个15 mL离心管，将细胞均分为两份，分别加入两个管中。使用带棉塞的巴斯德移液管反复吹打60–70次，以均质化细胞悬液。</li>
	<li>向每个15 mL管中加入3 mL 5号管中的溶液，在室温下静置10分钟后，用带棉塞的巴斯德移液管小心吸出上清液，将上清液转移至新的15 mL管中，并在室温下以1,500 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留沉淀。</li>
	<li>向沉淀中加入培养基，调整细胞密度至约1.5 × 106 个细胞/mL（每10只幼鼠约需100 mL）。</li>
	<li>将细胞接种至培养板中，置于37 °C、5% CO2的培养箱中进行培养。</li>
</ol>
5. 培养过程中添加Ara-C和D-葡萄糖
<ol>
	<li>24 小时后，加入阿糖胞苷（Ara-C）储备液（12 孔细胞培养板每孔 10 µL，6 孔细胞培养板每孔 20 µL；终浓度：1 mM），以抑制胶质细胞的生长。</li>
	<li>第 7 天，向 12 孔细胞培养板每孔加入 50 µL D-葡萄糖储备液，或向 6 孔细胞培养板每孔加入 100 µL，使终浓度为 1 mM。</li>
</ol>
6. CGN 培养中的 FDA-PI 双重染色与 FDA-PI-Hoechst 三重染色
<ol>
	<li>在10 mL PBS中加入20 µL FDA储备液（终浓度：10 µg/mL）和50 µL PI储备液（终浓度：50 µg/mL），配制FDA-PI工作液。涡旋混匀后置于冰上。
	<ol>
		<li>对于FDA-PI-Hoechst工作液，在10 mL PBS中加入20 µL FDA储备液（终浓度：10 µg/mL）、50 µL PI储备液（终浓度：50 µg/mL）和10 µL Hoechst储备液（终浓度：5 µg/mL）。涡旋混匀后置于冰上。 
		注意：FDA-PI工作液和FDA-PI-Hoechst工作液需在使用前新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞培养板从培养箱中取出，放置在冰上。</li>
	<li>吸除培养基，更换为冷PBS。 
	注意：更换溶液时操作应缓慢且小心，避免移液枪头接触细胞。</li>
	<li>吸除冷PBS，加入冷的FDA-PI或FDA-PI-Hoechst工作液（12孔板每孔500 µL，6孔板每孔1 mL），冰上孵育5分钟。</li>
	<li>吸除FDA-PI或FDA-PI-Hoechst工作液，加入冷PBS（12孔板每孔100 µL，6孔板每孔50 µL）。 
	注意：成像过程中细胞不得干燥。</li>
	<li>使用荧光显微镜拍摄图像。激发滤光片通带为450 - 490 nm，分别在520 nm、620 nm和460 nm检测FDA、PI和Hoechst的荧光发射信号。在相同条件下，使用荧光显微镜的相差模式在明场下拍摄一张图像。 
	注意：FDA-PI或FDA-PI-Hoechst染色后应在15分钟内完成成像。曝光时间为100–300 ms，模拟增益为2.8倍。</li>
</ol>
7. 神经元活力的评估
<ol>
	<li>进行 FDA-PI 双染色时，在图形编辑软件中通过将 FDA 阳性层叠加到 PI 阳性层上，对使用不同荧光滤光片检测到的细胞图像进行叠加。
	<ol>
		<li>通过输入调整 FDA 阳性层的不透明度 &#34;50%&#34; 在 &#34;不透明度&#34; 视野的 &#34;层&#34; 面板。通过单击合并两个图层 &#34;合并可见&#34; 按钮中的 &#34;层&#34; 菜单。通过输入调整叠加图像的对比度 &#34;50&#34; 在 &#34;对比&#34; 视野下 &#34;图像&#34;| &#34;优化方案&#34; | &#34;亮度/对比度&#34; 确保在叠加图像中不存在荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双阳性细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 FDA-PI-Hoechst 三重染色，通过在图像编辑软件中将 FDA 阳性层拖动至 PI 阳性层上，叠加经不同荧光滤光片检测的细胞图像。通过输入数值调整 FDA 阳性层的不透明度 &#34;50%&#34; 在 &#34;不透明度&#34; 视野的 &#34;层&#34; 面板。
	<ol>
		<li>通过点击合并两个图层 &#34;合并可见&#34; 按钮在 &#34;层&#34; 菜单。将Hoechst阳性层拖动至合并层上。通过输入数值调整Hoechst阳性层的不透明度 &#34;50%&#34; 在 &#34;不透明度&#34; 视野的 &#34;层&#34; 面板。通过点击合并两个图层 &#34;合并可见图像&#34; 按钮在 &#34;层&#34; 菜单</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过比较荧光模式与相差模式下拍摄的图像，从形态上区分体积较大且不规则的胶质细胞与小脑颗粒神经元—直径为CGNs三倍以上的细胞被视为胶质细胞，应予以排除。</li>
	<li>分别使用图像处理程序中的细胞计数插件对活神经元和死神经元的数量进行计数例如， ImageJ4.
	<ol>
		<li>对于 FDA-PI 双重染色，手动标记呈 FDA 阳性的小细胞为存活神经元，手动标记呈 PI 阳性的细胞为死亡神经元。对于 FDA-PI-Hoechst 三重染色，手动标记同时呈 FDA 阳性和 Hoechst 阳性的小细胞为存活神经元，手动标记同时呈 PI 阳性和 Hoechst 阳性的细胞为死亡神经元。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下公式计算神经元存活率百分比：%神经元存活率 = [存活神经元数量 / (死亡神经元数量 + 存活神经元数量)] × 100%。对每个孔选取五个随机视野，计算神经元存活率百分比的平均值。</li>
</ol>

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<li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案经修改自先前已描述过的方法6,7研究人员花费了大量时间，通过优化原代神经元培养条件来减少非神经元细胞的生长。 体外8然而，即使在培养条件得到改善的情况下，仍会残留一些胶质细胞。此外，在原代神经元培养中，非神经元细胞是必需的，因为它们有助于神经元的生长和成熟。9在本研究中，使用阿糖胞苷（Ara-C）以抑制胶质细胞的生长，尽管在小脑颗粒神经元（CGN）培养中仍存在约1–5%的胶质细胞。该问题同样存在于其他研究团队的研究中。10在CGN培养中，胶质细胞的大小和形态与神经元存在显著差异。CGN的直径约为10 µm，成熟的CGN具有丰富的突起，用于连接其他神经元。然而，培养中的胶质细胞直径相对较大，约为30–100 µm，因此在图像中易于将胶质细胞与神经元区分开来。因此，FDA-PI和FDA-PI-Hoechst染色的一个优势在于，能够在未通过培养技术抑制非神经元细...

比色法细胞毒性检测（如3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四氮唑溴盐（MTT）检测）常用于体外测定细胞活力。in vitro培养的大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）对多种神经毒素敏感，包括1-甲基-4-苯基吡啶离子、过氧化氢和谷氨酸1,2。因此，CGN培养物可作为神经科学领域的体外模型。in vitro培养的CGN可能包含多种细胞类型，包括神经元和胶质细胞，其中胶质细胞约占CGN培养物总细胞数的1%。然而，胶质细胞对神经毒素的反应与神经元不同，这会导致比色法检测所测得的神经元活力出现偏差3。
在活细胞中，荧光素二乙酸酯（FDA）可被酯酶转化为荧光素。碘化丙啶（PI）能够穿透死细胞并与DNA结合，可用于指示培养物中的细胞凋亡。因此，FDA-PI双染色可同时评估活细胞与死细胞，表明结合两种比色方法可更准确地测量细胞活力。此外，通过加入用于细胞核染色的蓝色荧光染料Hoechst，可进一步提高细胞活力检测的准确性。本文所述方案介绍了FDA-PI双染色及FDA-PI-Hoechst三重染色方法，可用于准确分析原代培养颗粒神经元（CGNs）的细胞活力。
本实验方案利用颗粒神经元（CGNs）和胶质细胞在大小和形态上的差异，通过显微观察进行识别和区分。染色后，通过荧光显微镜拍摄代表性图像，并据此计数活神经元和死神经元的数量。通过比较荧光模式下与相差模式下拍摄的典型CGNs图像，可排除大尺寸的胶质细胞。该类似策略也可用于检测含有神经元和胶质细胞的混合细胞培养体系中的神经元存活率，例如原代皮层神经元培养和海马神经元培养。

<table><tbody><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>胞嘧啶 &amp;beta;-D-阿拉伯呋喃糖苷</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>高质量FBS对培养至关重要</td></tr><tr><td>100倍谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100倍抗生素</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>基础伊格尔培养基（BME）</td><td>Gibco</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>荧光素二乙酸酯（FDA）</td><td>Sigma</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Yesen</td><td>40731ES10</td><td></td></tr><tr><td>兔抗GAP43抗体</td><td>Abcam</td><td>ab75810</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗GFAP抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sangon Biotech</td><td>A602440</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Volac</td><td>Z310727</td><td>使用前将尖端烧圆</td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>TPP</td><td>Z707783</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>TPP</td><td>Z707759</td><td>高质量的细胞培养板对于培养至关重要</td></tr><tr><td>过滤</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>移液5 mL</td><td>Excell Bio</td><td>CS017-0003</td><td></td></tr><tr><td>移液10 mL</td><td>Excell Bio</td><td>CS017-0004</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>上海凯康</td><td>XTL2400</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>TI-S</td><td></td></tr><tr><td>荧光滤光片和发射立方体</td><td>尼康</td><td>B-2A，G-2A，UV-2A</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>尼康</td><td>NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>图形编辑软件</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

采用荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双染法评估小脑颗粒神经元培养物中的神经元存活率

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

原代培养的小脑颗粒神经元（CGNs）已被广泛用作一种 体外 在神经科学和神经药理学研究中，CGN 培养模型具有重要意义。然而，CGN 培养物中胶质细胞与神经元的共存可能导致神经元活力评估结果出现偏差。荧光素二乙酸酯（FDA）与碘化丙啶（PI）双染法可通过同时检测活细胞与死细胞来测定细胞活力。我们采用 FDA-PI 双染法以提高比色法检测的灵敏度，并用于评估 CGN 中的神经元活力。此外，我们还加入了蓝色荧光 DNA 染料（例如， Hoechst）以提高准确性。本方案描述了在小脑颗粒神经元（CGN）培养中利用这些方法提高神经元存活率评估准确性的操作步骤。通过本方案，可借助荧光显微镜排除胶质细胞的数量干扰。类似的策略也可应用于区分多种混合细胞培养体系中的非目标胶质细胞与神经元，例如原代皮层神经元培养和海马神经元培养。

通过GAP43（红色）和GFAP（绿色）的双重免疫染色，分别分析神经元和胶质细胞的形态2,5。小脑颗粒神经元（CGN）培养物中同时存在神经元和胶质细胞。GFAP阳性的胶质细胞体积较大，形态不规则，如图中箭头所示（图1）。传统的细胞活力检测方法在测定神经元存活率时，无法区分胶质细胞与神经元。因此，FDA-PI染色及FDA-PI-Hoechst染色因能够区分胶质细胞与神经元，更有利于对CGN培养体系中神经元存活率进行准确评估。
采用低钾刺激诱导小脑颗粒神经元（CGN）培养物中的神经元死亡。代表性图像显示了经FDA-PI双染色法分析的CGN培养物在低钾培养基（5K）、正常培养基（25K）或原始培养基处理下的情况（图2A），以及经FDA-PI-Hoechst三染色法分析的结果（...

本方案描述了如何利用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法，在培养的小脑颗粒神经元（一种常用的原代神经元培养模型）中准确测定神经元存活率。 体外 神经科学和神经药理学研究中的模型

原代培养的小脑颗粒神经元（CGNs）在神经科学和神经药理学研究中被广泛用作体外模型。然而，……

本实验的总体目标是准确测定小脑颗粒神经元培养物中的细胞活力。该方法有助于回答神经科学和神经药理学领域的一些关键问题。该技术的主要优势在于，我们能够在MISTA细胞培养中区分出不需要的胶质细胞与神经元。演示实验操作的是我实验室的三名本科生：Lin Jiajia、Wang Jialing 和 Xu Dilin。首先从八日龄大鼠幼崽的枕骨大孔插入剪刀，沿耳至眼方向剪开颅骨两侧，开始解剖其头部。然后用镊子抬起颅骨。使用镊子分离小脑，并将其放入含有解剖液的35毫米培养皿中。将培养皿置于解剖显微镜载物台上，用两对镊子去除软脑膜和血管。用刀片切碎组织，然后将组织转移至含有30毫升解剖液的离心管中。在室温下以 1,500 × g 离心五分钟。离心后，吸去上清液，保留沉淀。随后，向沉淀中加入胰蛋白酶溶液，轻轻振荡重悬。然后将试管置于37摄氏度水浴中15分钟。15分钟后，加入DNase I、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁的溶液，并振荡混匀。随后在室温下以1,500 × g离心5分钟。吸去上清液后，将沉淀重悬于浓度较高的DNase One、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁溶液中。接着，准备两个15毫升离心管，将细胞均分为两份放入管中，使用带有棉塞的巴斯德移液管上下吹打60至70次，以充分均质化细胞。匀浆后，向每个15毫升离心管中加入3毫升硫酸镁和氯化钙溶液。将离心管在室温下静置10分钟。时间结束后，用带有棉塞的巴斯德移液管小心吸除上清液，并转移至新的15毫升离心管中。在室温下以1,500 × g离心五分钟。向沉淀中加入培养基，将细胞密度稀释至约1.5 × 10⁶ 个细胞/毫升。用移液器将细胞悬液加入6孔板中，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。24小时后，向培养孔中加入AraC储备液，使其终浓度为1毫摩尔，以抑制胶质细胞的生长，然后将培养板放回培养箱。随后在第7天，加入50微升D-葡萄糖储备液，使其终浓度为1毫摩尔。开始染色时，将荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate）配制成终浓度为10微克/毫升，碘化丙啶（propidium iodide）配制成终浓度为50微克/毫升，并加入10毫升PBS。将FDA/PI溶液涡旋混匀后置于冰上。将培养板置于冰上。小心吸除培养基，注意移液枪头勿接触细胞，然后缓慢加入预冷的PBS。吸去 PBS，然后每孔加入冷的 FDA/PI 或 FDA/PI/Hoechst 工作液。将培养板置于冰上孵育 5 分钟。随后吸去 FDA/PI 或 FDA/PI/Hoechst 工作液，每孔加入冷 PBS。确保荧光显微镜正确设置。使用100至300毫秒的曝光时间和2.8 ×的模拟增益，分别在520、620和460纳米处检测FDA、PI和Hoechst的荧光发射。采集荧光图像后，使用相差模式在普通光下拍摄一张图像。进行 FDA/PI 双重染色时，在图像编辑软件中通过将 FDA 阳性图层拖动到 PI 阳性图层上方来叠加细胞图像。在“图层”面板的“不透明度”字段中输入 50%，以调整 FDA 阳性图层的不透明度。打开“图层”菜单，点击“合并可见图层”按钮，将两个图层合并。在“图像”、“调整”、“亮度/对比度”下的“对比度”字段中输入 50，以设置叠加图像的对比度。检查叠加图像中是否存在 FDA 和 PI 双阳性细胞。对于 FDA/PI/Hoechst 三重染色，再次将 FDA 阳性层拖动到 PI 阳性层上，调整 FDA 阳性层的不透明度，并按之前方法合并图像。然后将Hoechst阳性层拖至合并层上。在“图层”面板的“不透明度”字段中输入50%，调整Hoechst阳性层的不透明度，随后打开“图层”菜单，点击“合并可见图层”按钮以合并两个图层。通过比较荧光模式与相差模式下采集的图像，直观区分体积较大、形态不规则的胶质细胞与小脑颗粒神经元。以下图像显示，在小脑颗粒神经元（CGN）培养物中同时存在小型神经元和大型、不规则的胶质细胞。该图像显示了体外培养八天的小脑颗粒神经元（CGN）培养物中GAP-43氨基酸染色结果。蓝色箭头指示神经元。此处显示的是胶质细胞的 GFAP 氨基染色。白色箭头指示一个胶质细胞。该相差显微图像显示了细胞的形态。FDA/PI 染色法能够区分胶质细胞与神经元，有利于在小脑颗粒神经元（CGN）培养中准确评估神经元的存活率。该图像为在正常生长培养基中培养的三重染色细胞的合并图像。箭头所示为典型的胶质细胞。此处，类似的培养物经含低钾培养基处理，箭头再次指示一个典型的胶质细胞。同时注意红色碘化丙啶染色的出现。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。类似的策略也可应用于其他混合细胞培养物，例如原代皮层培养物和原代海马培养物，以准确分析神经元的存活能力。

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使用荧光素二乙酸酯 - 碘化丙啶双重染色在小脑颗粒神经元培养中评估神经元活力

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介绍了一种活体荧光成像技术，用于定量中枢神经末梢中特定突触小泡（SV）池的补充与动员过程。在同一神经末梢中监测两轮SV循环，以提供内部对照。...

使用FM染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

本视频展示了评估鼻周皮层-海马体器官型脑片中神经元死亡的技术。神经元死亡发生 通过 进展性癫痫发作——类似 体内...

用于评估离体癫痫模型中细胞死亡的神经元死亡检测法

本视频演示了在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元损伤模型的方法。该方法概述了使用NMDA（一种兴奋性神经递质受体激动剂）和甘氨酸（一种共激动剂）诱导神经元损伤的步骤。NMDA和甘氨酸结合于特定的神经元受体，导致受体过度激活，从而引起大量细胞内钙离子内流，最终导致神经元损伤和死亡。...

建立小鼠原代小脑颗粒神经元损伤模型

本视频展示了使用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法，从混合培养的小脑颗粒神经元和胶质细胞中鉴定神经元的方法，其中活神经元呈绿色，死神经元呈红色。...

通过双染色法评估小脑神经元培养物中的神经元活力

来源：Bénard, M., 等 利用共聚焦宏观成像技术对出生后小脑颗粒细胞迁移进行离体成像。J. Vis. Exp. (2015)本视频展示了一种共聚焦宏观方法，用于追踪 离体...

利用共聚焦宏观成像技术对出生后小脑颗粒细胞迁移进行离体成像

在出生后小脑发育过程中，起源于生发区的未成熟颗粒细胞表现出不同的迁移模式，以到达其最终位置并建立神经元网络。本方案描述了小脑切片的制备方法以及利用共聚焦宏观成像技术研究调控神经元迁移因素的实验方法。...

Ex Vivo 利用共聚焦宏观成像技术观察出生后小脑颗粒细胞迁移

小胶质细胞可通过多种非细胞自主机制影响培养中的神经元及其他胶细胞。本文介绍一种选择性清除原代神经元培养物中小胶质细胞的实验方案。该方法有望阐明小胶质细胞与神经元相互作用的功能，对神经炎症为特征性表现的神经退行性疾病具有重要意义。...

利用L-亮氨酸甲酯选择性耗竭小脑颗粒细胞培养物中的小胶质细胞

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建立小鼠原代小脑颗粒神经元的神经元死亡与变性模型

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

学习使用荧光素二乙酸酯和碘化丙啶双重染色技术评估小脑颗粒神经元培养中的细胞活力。该方法可区分神经元与胶质细胞，为神经科学和神经药理学研究提供可靠的细胞活力检测方案。

采用荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双染法评估小脑颗粒神经元培养物中的神经元存活率

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