使用荧光素二乙酸酯 - 碘化丙啶双重染色在小脑颗粒神经元培养中评估神经元活力
2017年5月10日
该协议描述了如何使用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双重染色在培养的小脑颗粒神经元中准确测量神经元活力，这是一种初级神经元培养物，用作神经科学和神经药理学研究中的体外模型。
该程序的总体目标是准确测量小脑颗粒神经元培养物中的细胞活力。这种方法可以帮助回答神经科学和神经药理学领域的关键问题。该技术的主要优点是我们可以区分 MISTA 细胞培养物中不需要的神经胶质细胞和神经元。
演示这些程序的是 Lin Jiajia、Wang Jiling、Xu Dilin，以及我实验室的三名本科生。首先将剪刀插入枕骨大孔，然后从耳朵到眼睛剪掉头骨的两侧，开始解剖八天大大鼠幼崽的头部。然后，用镊子提起颅骨。
使用镊子分离小脑，并将其放入含有解剖液的 35 毫米培养皿中。将板转移到解剖显微镜的载物台上，并使用两对镊子去除脑膜和血管。用刀片切碎组织，然后将组织转移到装有 30 毫升解剖液的离心管中。
在室温下以 1， 500 x g 的离心力离心 5 分钟。离心后，吸出上清液并保存沉淀。接下来，将胰蛋白酶溶液添加到沉淀中，轻轻摇晃重悬。
然后将试管放入 37 摄氏度的水浴中 15 分钟。15 分钟后，加入 DNase One、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁溶液，摇匀。然后在室温下以 1， 500 x g 的离心力离心 5 分钟。
吸出上清液后，将沉淀重悬于稀释度较低的 DNase One、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁溶液中。接下来，准备两支 15 毫升的试管。将一半的细胞放入每个管中，并使用棉塞巴斯德移液管上下移液 60 至 70 次以使细胞匀浆。
均质后，向每个 15 mL 试管中加入 3 mL 硫酸镁和氯化钙溶液。让试管在室温下静置 10 分钟。时间过后，用棉塞巴斯德移液管小心地去除上清液，然后转移到新的 15 毫升试管中。
在室温下以 1， 500 x g 的离心力离心 5 分钟。向沉淀中加入培养基，稀释至细胞密度约为 1.5 x 10 至每毫升第六个细胞。将细胞移液到 6 孔板中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中培养。
24 小时后，添加 AraC 储备溶液至终浓度为 1 毫摩尔，以抑制神经胶质细胞的生长，然后将板放回培养箱中。然后，在第 7 天，向 D-葡萄糖储备溶液中加入 50 微升，最终浓度为 1 毫摩尔。通过将荧光素二乙酸酯混合至终浓度为 10 μg/mL，将碘化丙啶混合至终浓度为 50 μg/mL 和 10 mLl PBS 来开始染色。
通过涡旋混合 FDA/PI 溶液并置于冰上。将培养板放在冰上。小心吸出培养基，不要用移液器吸头接触细胞，然后慢慢加入冷 PBS。
吸出 PBS，然后加入冷 FDA/PI 或 FDA/PI Hoechst 工作溶液。将盘子放在冰上 5 分钟。接下来，吸出 FDA/PI 或 FDA/PI/Hoechst 工作溶液后，向每个孔中加入冷 PBS。
确保荧光显微镜设置正确。使用 100 到 300 毫秒的曝光时间和 2.8 倍的模拟增益，分别在 520、620 和 460 纳米处检测 FDA、PI 和 Hoechst 的荧光发射。收集荧光图像后，使用相差模式在正常光线下拍摄图像。
对于 FDA/PI 双重染色，通过在图形编辑软件中将 FDA 阳性层拖动到 PI 阳性层的顶部来叠加细胞图像。通过在 Layers 面板的 Opacity 字段中输入 50% 来调整 FDA 正图层的不透明度。通过打开 图层 菜单并单击 合并可见 按钮来合并两个图层。
通过在 对比度 字段 图像、调整、亮度/对比度 中设置叠加图像的对比度。检查叠加图像中没有 FDA 和 PI 双阳性细胞。对于 FDA/PI/Hoechst 三重染色，通过再次在 PI 阳性层上拖动 FDA 阳性层、调整 FDA 阳性层的不透明度并像以前一样合并图像来叠加细胞图像。
然后将 Hoechst 正图层拖动到合并的图层上。通过在"图层"面板的"不透明度"字段中输入 50% 来调整 Hoechst 正图层的不透明度，然后通过打开"图层"菜单并单击"合并可见"按钮来合并两个图层。通过在荧光模式下拍摄的图像与在相差模式下拍摄的图像进行比较，在视觉上区分大的、不规则的神经胶质细胞和小脑颗粒神经元。
下图显示 CGN 培养物中同时存在小神经元和大的不规则神经胶质细胞。该图像显示了体外 8 天时 CGN 培养物的 GAP-43 氨基染色。蓝色箭头表示神经元。
这里显示了神经胶质细胞的 GFAP 氨基染色。白色箭头表示神经胶质细胞。该相差图像显示了细胞的形态。
可以区分神经胶质细胞和神经元的 FDA/PI 钩染色有利于准确评估 CGN 培养中神经元活力。这是在正常生长培养基中生长的三重染色细胞的合并图像。箭头显示了典型的神经胶质细胞。
在这里，用含有低钾的培养基处理了类似的培养物，箭头再次表示典型的神经胶质细胞。此外，请注意红色碘化丙啶染色的外观。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。
类似的策略可应用于其他混合细胞培养物，例如原代皮质培养物和原代海马培养物，以准确分析神经元活力。
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概述
该协议描述了一种使用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双重染色来准确测量培养的小脑颗粒神经元活力的方法。这种技术对于在MISTA细胞培养中区分神经元和胶质细胞至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经药理学
- 细胞生物学
背景
- 小脑颗粒神经元是研究中使用的主要神经元培养。
- 准确测量细胞活力对神经科学研究至关重要。
- 荧光素二乙酸酯和碘化丙啶是常见的活力染色。
- 该方法允许区分神经元和胶质细胞。
研究目的
- 提供一个可靠的测量神经元活力的协议。
- 促进神经药理学和神经科学的研究。
- 提高对实验环境中细胞培养的理解。
使用的方法
- 解剖八天大的大鼠幼崽以获得小脑颗粒神经元。
- 应用荧光素二乙酸酯（FDA）进行活细胞染色。
- 使用碘化丙啶（PI）染色死细胞。
- 分析染色细胞以评估活力。
主要结果
- 成功区分活力神经元和死细胞。
- 本科生对该协议进行了演示。
- 该方法的验证可用于各种神经科学应用。
- 增强了对培养神经元活力的理解。
结论
- FDA和PI染色方法有效用于评估神经元活力。
- 该协议可以帮助未来的神经科学和神经药理学研究。
- 准确的活力评估对实验完整性至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of neuronal viability in mixed glial-neuronal cultures is critical for reliable neuropharmacology screening and target validation. This method improves predictive confidence by enabling specific neuronal readouts, reducing false signals from glial contamination. It supports early discovery decisions by providing a scalable, reproducible viability metric for compound screening in cerebellar and related neuronal models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuronal viability signals from glial interference.
- Operational Value: Provides a standardized fluorescence-based readout for live/dead neuronal discrimination in primary cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viability data compatible with high-content imaging workflows for compound screening.
- Operational Value: Supports assay reproducibility through defined staining protocols and fluorescence microscopy settings.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease-relevant system fidelity by ensuring neuronal-specific viability measurements in mixed cultures.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation via transferable viability assessment across cortical, hippocampal, and cerebellar models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early neuronal model preparation to compound-induced viability assessment, supporting lead identification and preclinical triage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating neuronal responses in mixed glial-neuronal cultures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible viability outputs for evaluating compound effects on neuronal survival.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence readouts (FDA, PI, Hoechst) enabling quantitative comparison of viability across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by ensuring viability assessments reflect neuronal, not glial, biology in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viability platform applicable to multiple primary neuronal culture systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity from glial contamination in viability assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined cell preparation, staining, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing neuronal-specific viability data, reducing late-stage attrition from false neurotoxicity signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on accurate neuronal viability profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture dissection and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to fluorescence microscopy with appropriate filter sets for FDA (520 nm), PI (620 nm), and Hoechst (460 nm).
- Necessitates cross-team standardization of staining timing, antibody handling, and image analysis protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to other neuronal culture types beyond cerebellar granule neurons.
- Practical limitations include the need for careful optimization of staining duration and concentration to avoid toxicity or signal saturation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
8:19
Conclusion
7:08
Results: Double and Triple Stainings in CGN Culture
0:46
Tissue Harvest from 8 Day Old Sprague-Dawley Rats
3:51
FDA-PI Double Staining and FDA-PI-Hoechst Triple Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture
5:30
Assessment of Neuronal Viability
