使用荧光素二乙酸酯 - 碘化丙啶双重染色在小脑颗粒神经元培养中评估神经元活力

该程序的总体目标是准确测量小脑颗粒神经元培养物中的细胞活力。这种方法可以帮助回答神经科学和神经药理学领域的关键问题。该技术的主要优点是我们可以区分 MISTA 细胞培养物中不需要的神经胶质细胞和神经元。

演示这些程序的是 Lin Jiajia、Wang Jiling、Xu Dilin，以及我实验室的三名本科生。首先将剪刀插入枕骨大孔，然后从耳朵到眼睛剪掉头骨的两侧，开始解剖八天大大鼠幼崽的头部。然后，用镊子提起颅骨。

使用镊子分离小脑，并将其放入含有解剖液的 35 毫米培养皿中。将板转移到解剖显微镜的载物台上，并使用两对镊子去除脑膜和血管。用刀片切碎组织，然后将组织转移到装有 30 毫升解剖液的离心管中。

在室温下以 1， 500 x g 的离心力离心 5 分钟。离心后，吸出上清液并保存沉淀。接下来，将胰蛋白酶溶液添加到沉淀中，轻轻摇晃重悬。

然后将试管放入 37 摄氏度的水浴中 15 分钟。15 分钟后，加入 DNase One、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁溶液，摇匀。然后在室温下以 1， 500 x g 的离心力离心 5 分钟。

吸出上清液后，将沉淀重悬于稀释度较低的 DNase One、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁溶液中。接下来，准备两支 15 毫升的试管。将一半的细胞放入每个管中，并使用棉塞巴斯德移液管上下移液 60 至 70 次以使细胞匀浆。

均质后，向每个 15 mL 试管中加入 3 mL 硫酸镁和氯化钙溶液。让试管在室温下静置 10 分钟。时间过后，用棉塞巴斯德移液管小心地去除上清液，然后转移到新的 15 毫升试管中。

在室温下以 1， 500 x g 的离心力离心 5 分钟。向沉淀中加入培养基，稀释至细胞密度约为 1.5 x 10 至每毫升第六个细胞。将细胞移液到 6 孔板中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中培养。

24 小时后，添加 AraC 储备溶液至终浓度为 1 毫摩尔，以抑制神经胶质细胞的生长，然后将板放回培养箱中。然后，在第 7 天，向 D-葡萄糖储备溶液中加入 50 微升，最终浓度为 1 毫摩尔。通过将荧光素二乙酸酯混合至终浓度为 10 μg/mL，将碘化丙啶混合至终浓度为 50 μg/mL 和 10 mLl PBS 来开始染色。

通过涡旋混合 FDA/PI 溶液并置于冰上。将培养板放在冰上。小心吸出培养基，不要用移液器吸头接触细胞，然后慢慢加入冷 PBS。

吸出 PBS，然后加入冷 FDA/PI 或 FDA/PI Hoechst 工作溶液。将盘子放在冰上 5 分钟。接下来，吸出 FDA/PI 或 FDA/PI/Hoechst 工作溶液后，向每个孔中加入冷 PBS。

确保荧光显微镜设置正确。使用 100 到 300 毫秒的曝光时间和 2.8 倍的模拟增益，分别在 520、620 和 460 纳米处检测 FDA、PI 和 Hoechst 的荧光发射。收集荧光图像后，使用相差模式在正常光线下拍摄图像。

对于 FDA/PI 双重染色，通过在图形编辑软件中将 FDA 阳性层拖动到 PI 阳性层的顶部来叠加细胞图像。通过在 Layers 面板的 Opacity 字段中输入 50% 来调整 FDA 正图层的不透明度。通过打开 图层 菜单并单击 合并可见 按钮来合并两个图层。

通过在 对比度 字段 图像、调整、亮度/对比度 中设置叠加图像的对比度。检查叠加图像中没有 FDA 和 PI 双阳性细胞。对于 FDA/PI/Hoechst 三重染色，通过再次在 PI 阳性层上拖动 FDA 阳性层、调整 FDA 阳性层的不透明度并像以前一样合并图像来叠加细胞图像。

然后将 Hoechst 正图层拖动到合并的图层上。通过在"图层"面板的"不透明度"字段中输入 50% 来调整 Hoechst 正图层的不透明度，然后通过打开"图层"菜单并单击"合并可见"按钮来合并两个图层。通过在荧光模式下拍摄的图像与在相差模式下拍摄的图像进行比较，在视觉上区分大的、不规则的神经胶质细胞和小脑颗粒神经元。

下图显示 CGN 培养物中同时存在小神经元和大的不规则神经胶质细胞。该图像显示了体外 8 天时 CGN 培养物的 GAP-43 氨基染色。蓝色箭头表示神经元。

这里显示了神经胶质细胞的 GFAP 氨基染色。白色箭头表示神经胶质细胞。该相差图像显示了细胞的形态。

可以区分神经胶质细胞和神经元的 FDA/PI 钩染色有利于准确评估 CGN 培养中神经元活力。这是在正常生长培养基中生长的三重染色细胞的合并图像。箭头显示了典型的神经胶质细胞。

在这里，用含有低钾的培养基处理了类似的培养物，箭头再次表示典型的神经胶质细胞。此外，请注意红色碘化丙啶染色的外观。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。

类似的策略可应用于其他混合细胞培养物，例如原代皮质培养物和原代海马培养物，以准确分析神经元活力。