采用荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双染法评估小脑颗粒神经元培养物中的神经元存活率

本实验的总体目标是准确测定小脑颗粒神经元培养物中的细胞活力。该方法有助于回答神经科学和神经药理学领域的一些关键问题。该技术的主要优势在于，我们能够在MISTA细胞培养中区分出不需要的胶质细胞与神经元。

演示实验操作的是我实验室的三名本科生：Lin Jiajia、Wang Jialing 和 Xu Dilin。首先从八日龄大鼠幼崽的枕骨大孔插入剪刀，沿耳至眼方向剪开颅骨两侧，开始解剖其头部。然后用镊子抬起颅骨。

使用镊子分离小脑，并将其放入含有解剖液的35毫米培养皿中。将培养皿置于解剖显微镜载物台上，用两对镊子去除软脑膜和血管。用刀片切碎组织，然后将组织转移至含有30毫升解剖液的离心管中。

在室温下以 1,500 × g 离心五分钟。离心后，吸去上清液，保留沉淀。随后，向沉淀中加入胰蛋白酶溶液，轻轻振荡重悬。

然后将试管置于37摄氏度水浴中15分钟。15分钟后，加入DNase I、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁的溶液，并振荡混匀。随后在室温下以1,500 × g离心5分钟。

吸去上清液后，将沉淀重悬于浓度较高的DNase One、大豆胰蛋白酶抑制剂和硫酸镁溶液中。接着，准备两个15毫升离心管，将细胞均分为两份放入管中，使用带有棉塞的巴斯德移液管上下吹打60至70次，以充分均质化细胞。

匀浆后，向每个15毫升离心管中加入3毫升硫酸镁和氯化钙溶液。将离心管在室温下静置10分钟。时间结束后，用带有棉塞的巴斯德移液管小心吸除上清液，并转移至新的15毫升离心管中。

在室温下以1,500 × g离心五分钟。向沉淀中加入培养基，将细胞密度稀释至约1.5 × 10⁶ 个细胞/毫升。用移液器将细胞悬液加入6孔板中，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。

24小时后，向培养孔中加入AraC储备液，使其终浓度为1毫摩尔，以抑制胶质细胞的生长，然后将培养板放回培养箱。随后在第7天，加入50微升D-葡萄糖储备液，使其终浓度为1毫摩尔。开始染色时，将荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate）配制成终浓度为10微克/毫升，碘化丙啶（propidium iodide）配制成终浓度为50微克/毫升，并加入10毫升PBS。

将FDA/PI溶液涡旋混匀后置于冰上。将培养板置于冰上。小心吸除培养基，注意移液枪头勿接触细胞，然后缓慢加入预冷的PBS。

吸去 PBS，然后每孔加入冷的 FDA/PI 或 FDA/PI/Hoechst 工作液。将培养板置于冰上孵育 5 分钟。随后吸去 FDA/PI 或 FDA/PI/Hoechst 工作液，每孔加入冷 PBS。

确保荧光显微镜正确设置。使用100至300毫秒的曝光时间和2.8 ×的模拟增益，分别在520、620和460纳米处检测FDA、PI和Hoechst的荧光发射。采集荧光图像后，使用相差模式在普通光下拍摄一张图像。

进行 FDA/PI 双重染色时，在图像编辑软件中通过将 FDA 阳性图层拖动到 PI 阳性图层上方来叠加细胞图像。在“图层”面板的“不透明度”字段中输入 50%，以调整 FDA 阳性图层的不透明度。打开“图层”菜单，点击“合并可见图层”按钮，将两个图层合并。

在“图像”、“调整”、“亮度/对比度”下的“对比度”字段中输入 50，以设置叠加图像的对比度。检查叠加图像中是否存在 FDA 和 PI 双阳性细胞。对于 FDA/PI/Hoechst 三重染色，再次将 FDA 阳性层拖动到 PI 阳性层上，调整 FDA 阳性层的不透明度，并按之前方法合并图像。

然后将Hoechst阳性层拖至合并层上。在“图层”面板的“不透明度”字段中输入50%，调整Hoechst阳性层的不透明度，随后打开“图层”菜单，点击“合并可见图层”按钮以合并两个图层。通过比较荧光模式与相差模式下采集的图像，直观区分体积较大、形态不规则的胶质细胞与小脑颗粒神经元。

以下图像显示，在小脑颗粒神经元（CGN）培养物中同时存在小型神经元和大型、不规则的胶质细胞。该图像显示了体外培养八天的小脑颗粒神经元（CGN）培养物中GAP-43氨基酸染色结果。蓝色箭头指示神经元。

此处显示的是胶质细胞的 GFAP 氨基染色。白色箭头指示一个胶质细胞。该相差显微图像显示了细胞的形态。

FDA/PI 染色法能够区分胶质细胞与神经元，有利于在小脑颗粒神经元（CGN）培养中准确评估神经元的存活率。该图像为在正常生长培养基中培养的三重染色细胞的合并图像。箭头所示为典型的胶质细胞。

此处，类似的培养物经含低钾培养基处理，箭头再次指示一个典型的胶质细胞。同时注意红色碘化丙啶染色的出现。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。

类似的策略也可应用于其他混合细胞培养物，例如原代皮层培养物和原代海马培养物，以准确分析神经元的存活能力。