应用 Videomicroscopy 评价人脂肪组织微血管功能

这种视频显微镜技术的总体目标是检查分离的微血管在药理学和生理刺激下的功能特性，从而深入了解导致人类血管功能障碍的病理生理学和分子机制。这种方法有助于理解导致脂肪内局部微血管系统功能障碍的分子机制，这与全身性疾病有关。这种技术的主要优点是血管在从人体中取出一段时间后仍能保持功能，并且很容易检查其生理特性。

这种实验方法的临床相关性在于，它使我们能够识别在疾病条件下发生差异改变的通路，并有可能发现新的治疗靶点。在组织解剖显微镜下，使用微剪刀和微镊子小心地从脂肪样本内的小动脉中取出周围的脂肪和结缔组织。区分动脉和小静脉是必不可少的。

动脉的直径通常较小，表现出更大的张力，并且比小静脉反应更强烈。当动脉被隔离后，使用尼龙或丝绸缝合线系住任何树枝。接下来，使用 10 毫升注射器将新鲜的 Krebs 溶液缓慢填充到管道中。

然后，将橡胶管连接到腔室内的压力储液器和玻璃毛细管移液器上。接下来，将解剖的动脉移至器官腔，并将血管插管到玻璃毛细管移液器上。用尼龙缝合线小心地将动脉的两端固定在移液器上。

容器固定后，慢慢地从腔室中取出 Krebs 缓冲液，并向腔室中加入 2 毫升新鲜的 Krebs 溶液。接下来，将器官室连接到配备摄像机的倒置显微镜的载物台上。以 1 kHz 的采样率打开边缘检测软件。

将剩余的加压管连接到第二个充满 Krebs 溶液的压力储液罐，然后将储液罐连接到压力传感器。连接所有管道后，将加热块设置为 37 摄氏度。接下来，使用压力控制装置逐渐将腔内压增加到每 5 分钟五毫升汞柱，以在离体血管腔内达到适当的实验压力。

一旦压力达到 60 毫升汞柱，让血管平衡 20 到 30 分钟，并记录脂肪动脉在静止时的直径。在平衡期结束时，每 5 分钟向浴中直接加入 1 微升内皮素 1，将血管预收缩至静息基线直径的约 55%，直到血管直径得到适当收缩。对于血流诱导的内皮依赖性血管舒张，诱导以相等和相反的方向连续流入动脉腔内腔，以便可以在血管中产生压力差，而不会改变 60 毫米汞柱的平均腔内压力。

3 到 5 分钟后，测量血流介导的扩张。每增加一次压力梯度，每 5 到 6 分钟换水 10 厘米，最高可达 100 厘米水。评估流介导的血管扩张后，将压力储液器返回到相同的高度以停止流的诱导。

然后立即但小心地用新鲜的 Krebs 溶液替换腔室溶液，不要干扰悬浮的动脉，让血管开始恢复到基线直径 20 至 30 分钟。一旦动脉恢复到静息基线直径，就可以评估细微的胆碱介导的内皮依赖性血管舒张。如前所述，首先用内皮素 1 将血管预收缩到其静止直径的约 55%。

一旦达到预收缩，将 2 微升递增剂量的乙酰胆碱直接加入浴中。记录每次给药后 5 分钟动脉直径的变化。乙酰胆碱剂量反应完成后，通过依次将罂粟碱和非内皮血管扩张剂直接给药到浴中来评估内皮非依赖性血管舒张和血管活力。

在人类肥胖症中，内皮依赖性血管舒张对血流增加和纯粹压力或乙酰胆碱的反应在内脏脂肪动脉中与皮下脂肪动脉中显着减弱。然而，响应罂粟碱的内皮非依赖性血管舒张在两者之间没有差异改变，这表明内脏区域的血管功能障碍主要是内皮水平功能障碍的结果，至少在疾病的早期阶段是这样。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 3 到 5 小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住花点时间并保持勤奋，因为即使是对血管的轻微损伤也可能使结果产生偏差。在此程序之后，可以执行其他方法，例如血管的 siRNA 转染，以回答有关特定基因对人类疾病中血管舒缩功能影响的其他问题。开发后，这项技术为脂肪组织生物学和微循环领域的研究人员探索脂肪组织微环境对人类肥胖局部血管健康的影响铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何直接探测人体血管的整个完整节段的病理生理学有一个很好的了解，这些血管是从活体受试者身上去除的，这个过程是非侵入性成像无法复制的。