Adipo: 三维脂肪组织成像的组织清除方法
July 28th, 2018
由于脂质含量高, 脂肪组织在使用传统的组织学方法进行可视化方面具有挑战性。Adipo 是一种组织清除技术, 它允许强健的标记和高分辨率的脂肪组织的荧光成像。在这里, 我们描述的方法, 样品制备, 预处理, 染色, 清除和安装的成像。
这种方法可以帮助回答脂肪组织生物学领域的关键问题，例如脂肪组织的不同成分如何在整个组织中相互作用。这种技术的主要优点是它可以完全去除储存在脂肪组织中的多余脂质，同时保持其三维结构。虽然这种方法可以深入了解脂肪组织的三维组织，但它通常也可以应用于其他脂质含量高的组织，例如记忆腺和淋巴结。
这种方法的目视演示至关重要，因为脱脂和透明化步骤需要足够的孵育时间，这可能很难确定。首先使用钝头镊子从新鲜灌注的动物模型中解剖感兴趣的脂肪垫。小心地取下整个时尚垫，不要捏或挤压组织或用毛皮污染解剖的组织。
将脂肪垫放入 15 毫升锥形管中约 10 毫升的固定液中，并在 4 摄氏度下固定过夜。第二天用 PBS 洗涤样品后，在解剖显微镜下轻轻去除样品中的任何碎屑。附着在样品上的头发、棉绒或其他碎屑会在成像过程中产生阴影。
将干净的样品转移至含有冰冷的 20% 甲醇 B1N 缓冲液的聚丙烯管中。将装有样品的试管水平放在轨道摇床上，将其设置为 100 RPM，然后摇动 30 分钟至 1 小时，具体取决于样品的大小。确保样品可以在试管内自由移动。
通过在 B1N 缓冲液中加入 40%、60% 和 80% 的甲醇，然后加入 100% 甲醇，继续对样品进行脱水。尽可能减少残留溶液。脱水后，用 100% 二氯甲烷或 DCM 替换 100% 甲醇溶液，使样品脱脂。
按照表 2 中列出的孵育时间重复洗涤两次。在第二次和第三次 DCM 洗涤结束时，样品应沉到试管底部。如果没有，请延长孵育时间以确保完全脱脂。
脱脂后，用 100% 甲醇洗涤两次，洗涤时间如表 2 所示。在反相甲醇 B1N 缓冲液系列中按照表 2 所示的时间对样品进行再水化。再水化后，在室温下用 PTXWH 缓冲液洗涤样品 2 小时。
样品现在可用于免疫染色，也可以在 4 摄氏度的 PTXWH 缓冲液中储存长达 1 年。首先，在 PTXWH 缓冲液中将一抗稀释至推荐浓度。然后，将稀释的抗体溶液以 20,000 G 离心 10 分钟，以防止引入抗体沉淀或聚集。
选择与甲醇和 DCM 处理兼容的合适一抗非常重要。新抗体应使用小块组织或甲醇处理的组织切片进行验证。将脱脂样品与一抗溶液孵育 3 至 5 天，具体取决于样品的大小。
初级孵育后，用几次更换的 PTXWH 缓冲液洗涤样品。第二天，在 PTXWH 缓冲液中将二抗稀释至推荐浓度。像以前一样离心稀释的抗体溶液。
将样品与二抗溶液一起孵育 3 至 5 天，具体取决于样品的大小。同样，像以前一样，在一系列孵育步骤中用 PTXWH 缓冲液洗涤样品。第二天，用 1XPBS 洗涤样品 5 分钟、10 分钟，然后 30 分钟。
将脂肪组织包埋在琼脂糖中，以便于用于光片显微镜检查的样品安装。首先，在 1XPBS 中加入 1% 琼脂糖制备包埋溶液。将包埋溶液冷却至 40 摄氏度左右，以避免样品暴露在过热的环境中。
在避免液体残留的同时，将清洁后的组织样品放入模具中，并将其排列到所需位置。然后将包埋溶液轻轻倒在样品上，同时避免气泡。在琼脂糖凝固之前，应将任何气泡移动到外围。
琼脂糖完全凝固后，切出一个包含样品的块。将样品转移至 25% 甲醇的水溶液中，避光，并按表 2 所示的振荡孵育时间。继续通过甲醇梯度对样品进行脱水。
将样品在 100% DCM 中振荡孵育 1 小时。DCM 洗涤后的样品在空气中容易变干，这会影响样品的清晰度并导致图像模糊。将样品快速转移到新鲜溶液中以防止干燥非常重要。
每次 DCM 洗涤结束时，样品应沉到试管底部。将样品在二苄醚或 DBE 中孵育过夜，轻轻摇动以实现示差折光匹配。样品最终会变成透明的不可见光。
第二天，将样品与新鲜 DBE 温育 2 小时并轻轻摇动后，将样品在室温下避光储存或直接进行成像。要使用与 DBE 兼容的光片显微镜对样品进行成像，请将琼脂糖包埋的样品安装在可以防止成像过程中移动的支架上。要使用倒置共聚焦或双光子显微镜对样品进行成像，请将琼脂糖包埋的样品放入带有玻璃底的腔室载玻片中。
使用低放大倍率的光片显微镜扫描后皮下脂肪垫，显示脂肪细胞的小叶组织。更详细的信息，例如脂肪细胞的大小，可以通过以更高的放大倍率放大感兴趣的区域来揭示。用酪氨酸羟化酶染色的后皮下脂肪垫，交感神经系统的标志物通过光片荧光显微镜成像。
TH 染色显示结构显示为大神经束，如此处箭头所示。TH 染色也揭示了血管神经支配以及组织实质中致密的末端树枝化。使用血小板内皮细胞粘附分子或 PCAM1（也称为 CD31）作为标记血管的标志物，可以观察到所有脂肪细胞都与整个组织的毛细血管接触，支持脂肪对有效营养和氧气交换的高需求。
开发后，这项技术为脂肪生物学领域的研究人员探索其他问题铺平了道路，例如早期组织形态发生和脂肪细胞祖细胞的命运图谱。它也可以用于研究人类脂肪组织的组织学。不要忘记，使用多聚甲醛、甲醇、二氯甲烷和二苄醚可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用通风柜和个人防护设备。
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概述
本研究针对脂肪组织生物学中的一个关键问题，即脂肪组织内不同成分之间的相互作用。利用Adipo-Clear技术，研究人员可以以高分辨率可视化脂肪组织，同时保留其三维结构，从而深入了解其组织和相互作用。
关键研究组成部分
研究领域
- 脂肪组织生物学
- 组织透明化技术
- 生物组织的三维成像
背景
- 脂肪组织含有高脂肪含量，这使得可视化变得复杂。
- 传统的组织学方法对这种组织不太有效。
- 对理解组织相互作用的稳定成像技术是至关重要的。
使用的方法
- Adipo-Clear组织透明化技术
- 使用新鲜动物模型进行精确的样本解剖
- 光片显微镜用于成像
主要结果
- 成功透明化了脂肪组织，同时保留了结构完整性。
- 展示了与各种一抗的兼容性。
- 实现了脂肪细胞及其相互作用的详细可视化。
结论
- 该方法为研究脂肪组织结构提供了新的途径。
- 它在理解其他高脂肪含量组织方面具有应用前景。
常见问题
Executive Industry Relevance
Adipose tissue biology is central to metabolic disease research, yet lipid-rich composition limits comprehensive 3D visualization. Adipo-Clear enables whole-tissue imaging by removing lipids while preserving architecture, supporting mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence in adipose-resident cell interactions and stromal-vascular niche analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipose tissue architecture and cellular distribution for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides volumetric readouts that reduce sampling bias from traditional sectioning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, lipid-cleared tissue platforms compatible with immunostaining for biomarker co-localization.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by visualizing adipocyte-immune, vascular, and nerve interactions in intact tissue.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of tissue remodeling in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
Adipo-Clear fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing 3D contextual data on adipose tissue composition and structure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular organization and intercellular signaling in adipose tissue.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved outputs for evaluating compound effects on tissue architecture.
- Analytics: Enables volumetric measurements of cell density, vessel density, and nerve innervation as decision-grade readouts.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via preserved tissue morphology and biomarker compatibility.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clearing protocol for lipid-rich tissues across metabolic, immunology, and neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in adipose tissue studies through intact 3D visualization.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for multi-site reproducibility in imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing off-target effects on adipose stroma or vasculature.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on adipose tissue engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, immunostaining, and clearing chemistry optimization.
- Depends on access to light sheet or compatible confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of delipidation and refractive index matching steps across laboratories.
- Involves adaptation considerations for human versus murine adipose tissue due to lipid density differences.
- Involves practical limitations related to reagent hazards (DCM, DBE) requiring fume hood and PPE compliance.
