Adipo-Clear：一种用于脂肪组织三维成像的组织透明化方法
2018年7月28日
由于脂肪组织含有高含量的脂质，使用传统组织学方法对其进行可视化一直存在挑战。Adipo-Clear 是一种组织透明化技术，可实现对脂肪组织的稳定标记和高分辨率的三维荧光成像。本文中，我们描述了用于成像的样本制备、预处理、染色、透明化和封片等步骤的方法。
该方法有助于解答脂肪组织生物学领域中的关键问题，例如脂肪组织的不同组分在完整组织中如何相互作用。该技术的主要优势在于，能够在维持脂肪组织三维结构的同时，完全去除其中储存的过量脂质。该方法不仅能揭示脂肪组织的三维空间组织特征，还可广泛应用于其他富含脂质的组织，如乳腺和淋巴结。
该方法的可视化演示至关重要，因为脱脂和透明化步骤需要足够的孵育时间，而这一时间往往难以确定。首先，使用平头镊子从新鲜灌注的动物模型中分离出目标脂肪垫。在操作过程中，应小心地完整去除整个脂肪垫，避免夹捏或挤压组织，同时防止毛发污染已分离的组织。
将脂肪垫置于含有约10毫升固定液的15毫升锥形管中，在4摄氏度下后固定过夜。次日用PBS洗涤样本后，在解剖显微镜下小心去除样本上的任何碎片。附着在样本上的毛发、绒毛或其他碎屑会在成像过程中产生阴影。
将洁净的样品转移至含有预冷的20%甲醇B1N缓冲液的聚丙烯管中。将装有样品的管子水平放置于旋转摇床，设置转速为100 RPM，根据样品大小振荡30分钟至1小时。确保样品在管内可自由移动。
使用B1N缓冲液中梯度浓度的40%、60%和80%甲醇溶液继续对样品进行脱水，随后使用100%甲醇。尽量减少溶液的残留转移。脱水完成后，将100%甲醇溶液替换为100%二氯甲烷（DCM）以对样品进行脱脂。
按照表2中列出的孵育时间重复洗涤两次。在第二次和第三次二氯甲烷（DCM）洗涤结束后，样品应沉降至试管底部。若未沉降，应延长孵育时间以确保完全脱脂。
脱脂后，用100%甲醇洗涤两次，每次洗涤时间见表2。随后按照表2所示时间，使用逆向甲醇B1N缓冲液系列对样本进行再水化。再水化完成后，在室温下用PTXWH缓冲液洗涤样本2小时。
样品现在可用于免疫染色，或可在 PTXWH 缓冲液中于 4 摄氏度保存长达 1 年。首先，用 PTXWH 缓冲液将一抗稀释至推荐浓度。然后，将稀释后的一抗溶液在 20,000 ×g 离心 10 分钟，以防止引入抗体沉淀或聚集体。
选择能够耐受甲醇和二氯甲烷（DCM）处理的合适一抗非常重要。新抗体应使用小块组织或经甲醇处理的组织切片进行验证。根据样本大小，将脱脂后的样本在一抗溶液中孵育3至5天。
一次孵育后，用多份PTXWH缓冲液洗涤样本。次日，将二抗用PTXWH缓冲液稀释至推荐浓度。同前次一样，离心稀释后的抗体溶液。
根据样本大小，将样本与二抗溶液孵育3至5天。再次按照之前的方法，用PTXWH缓冲液通过一系列孵育步骤清洗样本。次日，依次用1×PBS清洗样本，分别为5分钟、10分钟和30分钟。
将脂肪组织包埋于琼脂糖中，以方便在光片显微镜下进行样本固定。首先，用1%琼脂糖溶于1×PBS中制备包埋液。将包埋液冷却至约40摄氏度，以避免样本暴露于过高温度下。
避免液体携带污染，将清洗后的组织样本放入模具中，并调整至所需位置。然后轻轻将包埋液倒入样本上，注意避免产生气泡。在琼脂糖凝固前，应将任何气泡移至边缘区域。
待琼脂糖完全凝固后，切下含有样品的凝胶块。将样品转移至含25%甲醇的水中，避光，按表2所示时间在摇床上孵育。随后通过甲醇梯度继续对样品进行脱水处理。
将样品在100%二氯甲烷（DCM）中振荡孵育1小时。DCM洗涤后的样品在空气中容易干燥，这会影响样品的清晰度并导致图像模糊。为防止干燥，必须迅速将样品转移至新鲜溶液中。
每次二氯甲烷洗涤结束后，样品应沉降至管底。将样品在二苄基醚（DBE）中孵育过夜，并轻微振荡，以实现折射率匹配。样品最终将变得透明，不可见光。
第二天，将样品在新鲜的DBE中轻轻振荡孵育2小时后，可将样品置于室温避光处保存，或直接进行成像。若使用与DBE兼容的光片显微镜对样品成像，需将包埋在琼脂糖中的样品固定于可防止成像过程中移动的样品 holder 上。若使用倒置共聚焦显微镜或双光子显微镜成像，则将包埋在琼脂糖中的样品置于带有玻璃底的腔室载玻片中。
使用低倍率光片显微镜扫描后部皮下脂肪垫，可显示脂肪细胞的 lobular 组织结构。通过高倍率放大感兴趣区域，可进一步揭示脂肪细胞大小等更详细的信息。后部皮下脂肪垫经酪氨酸羟化酶（交感神经系统标志物）染色后，利用光片荧光显微镜成像。
TH染色显示出如图中箭头所示的大神经束结构。同时，TH染色也揭示了血管的神经支配以及组织实质中密集的终末分支。使用血小板内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule）或PCAM1（也称为CD31）作为标记物来标记血管，可以观察到在整个组织中，所有脂肪细胞均与毛细血管相接触，这支持了脂肪组织对高效营养物质和氧气交换的高需求。
该技术建立后，为脂肪生物学领域的研究人员探索早期组织形态发生及脂肪细胞前体的命运图谱等进一步问题开辟了道路。该技术也可用于研究人类脂肪组织的组织学。请注意，实验中使用的多聚甲醛、甲醇、二氯甲烷和二苄基醚可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如使用通风橱和个人防护装备。
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概述
本研究探讨了脂肪组织生物学中的一个关键问题，即脂肪组织内不同组分之间的相互作用。通过利用 Adipo-Clear 技术，研究人员能够在保持脂肪组织三维结构的同时，以高分辨率对其进行可视化，从而深入了解其组织结构及相互作用。
关键研究组成部分
研究领域
- 脂肪组织生物学
- 组织透明化技术
- 生物组织的三维成像
背景
- 脂肪组织含有高浓度脂质，使可视化变得复杂。
- 传统组织学方法对这类组织效果不佳。
- 迫切需要可靠的成像技术以深入理解组织间的相互作用。
使用的方法
- Adipo-Clear 组织透明化技术
- 采用新鲜动物模型进行精确的样本解剖
- 利用光片显微镜成像
主要结果
- 成功清除脂肪组织的同时保持了其结构完整性。
- 验证了与多种一抗的良好兼容性。
- 实现了对脂肪细胞及其相互作用的精细可视化。
结论
- 该方法为研究脂肪组织结构提供了新的途径。
- 在理解其他高脂含量组织方面具有应用前景。
常见问题
行业重要性概述
脂肪组织生物学在代谢性疾病研究中具有核心地位，然而其富含脂质的特性限制了对组织进行全方位的三维可视化观察。Adipo-Clear 技术通过去除脂质同时保留组织结构，实现了整个组织的成像，有助于在靶点验证和表型筛选中进行机制性风险评估。该方法提高了对脂肪组织内细胞相互作用及基质-血管微环境分析的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可对脂肪组织结构和细胞分布进行探究，以验证特定假设。
- 操作价值：提供体积层面的定量读数，减少传统切片方法带来的取样偏差。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成标准化的、去脂组织平台，可兼容免疫染色，用于生物标志物的共定位分析。
- 操作价值：支持高内涵成像工作流程中可重复的样本制备。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过在完整组织中可视化脂肪细胞与免疫细胞、血管及神经之间的相互作用，促进与疾病相关的系统建模。
- 操作价值：可在临床前模型中实现对组织重塑过程的长期追踪。
流程与工作流整合
Adipo-Clear 通过提供关于脂肪组织组成和结构的三维背景数据，契合了从靶点验证到临床前评估的发现连续过程。
- 发现生物学：支持对脂肪组织中细胞结构和细胞间信号传导的假设验证。
- 筛选：提供定量且具有空间分辨能力的输出结果，用于评估化合物对组织结构的影响。
- 分析：实现对细胞密度、血管密度和神经支配的体积测量，作为可用于决策的读出指标。
- 转化研究：通过保持组织形态和生物标志物兼容性，将发现成果与临床前研究连续性相连接。
- 企业级复用：建立适用于代谢、免疫学和神经科学项目的富含脂质组织的可重复使用透明化处理流程。
运营与企业影响
- 科学价值：通过完整的三维可视化，降低脂肪组织研究中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化组织制备流程，实现基于成像检测的多中心可重复性。
- 战略价值：通过揭示对脂肪组织基质或血管系统的脱靶效应，优化“进行/终止”决策。
- 项目组合影响：根据靶点在脂肪组织中的作用特征，实现基于风险调整的靶点优先排序。
实施注意事项
- 需要具备组织处理、免疫染色和透明化学优化方面的专业知识。
- 依赖于光片显微镜或兼容的共聚焦显微镜基础设施的可用性。
- 需要在不同实验室之间对脱脂和折射率匹配步骤进行标准化。
- 由于脂质密度的差异，需考虑人类与小鼠脂肪组织在应用中的适应性调整。
- 涉及试剂危害（如二氯甲烷、二苯醚）带来的实际限制，需遵守通风橱和个体防护装备的使用规范。
