核壳镧系掺杂转换纳米晶的合成及其在蜂窝中的应用

该程序的总体目标是基于高温共沉淀方法合成核壳镧系元素掺杂的上转换纳米晶体，并进行生物相容性表面修饰，以实现进一步的细胞应用。在过去的几年里，我们实验室开发了一种非常独特的镧系元素掺杂纳米晶体的上转换，这表明了非常独特的光学特性，因此可以吸收长波长红外光，并基本上将这种光在短波长范围内转化为多色发射，包括甚至红外光窗可见的紫外线。这种独特的纳米晶体结构表明其在生物医学应用中的性能非常有前景。

该方法为合成核壳上转换纳米结构及其生物相容性表面改性技术提供了一种可行的方法，用于在近红外光照射下调节光门膜通道蛋白。要开始该程序，请在甲醇中制备稀土乙酸盐复合物的储备溶液。制备每毫升 20 毫克氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液。

将储备溶液储存在 4 摄氏度。然后，将 3 毫升油酸和 7 毫升 1-十八烯移液到 50 毫升三颈圆底烧瓶中。此外，还有 1.089 毫升醋酸钇溶液、0.608 毫升醋酸镱溶液、83.6 微升醋酸铥溶液和 128.5 微升醋酸钕溶液。

为烧瓶配备搅拌棒和温度计。在油浴中将烧瓶加热至 100 摄氏度，同时搅拌直至甲醇蒸发。然后，将培养瓶连接到 Schlenk 管路，将培养瓶向下抽真空 2 至 3 分钟，以去除残留的甲醇。

接下来，将培养瓶置于氮气气氛下。将反应混合物在 150 摄氏度下加热 1 小时，同时以 700 rpm 的速度搅拌。然后，让混合物冷却至室温。

接下来，在 15 毫升离心管中加入 2 毫升氢氧化钠储备液和 2.965 毫升氟化铵储备液。盖紧试管，涡旋氢氧化钠和氟化铵混合物 5 秒钟。在 5 分钟内，使用玻璃移液器在搅拌的同时将氢氧化钠-氟化铵混合物缓慢加入反应瓶中。

然后，将反应混合物加热至不超过 50 摄氏度。将混合物在该温度下保持 30 分钟。然后，将混合物加热至 100 摄氏度以蒸发甲醇。

将培养瓶连接到 Schlenk 管路，在真空下去除残留的甲醇 2 到 3 分钟。用氮气填充烧瓶，并以每分钟 5 摄氏度的速度将反应混合物加热至 290 摄氏度。将混合物保持在 290 摄氏度或略高于 290 摄氏度 1.5 小时。

然后，在搅拌的同时让混合物冷却至室温。将产物混合物转移到 50 毫升离心管中。用 30 毫升乙醇将残留物冲洗到试管中。

在室温下以 4， 000 g 离心混合物 8 分钟。弃去上清液，通过超声处理将固体分散在 10 mL 己烷中 2 分钟。向分散液中加入 30 毫升乙醇，在相同条件下再次离心混合物，弃去上清液。

将固体分散在 5 毫升己烷中，并将分散体储存在 4 摄氏度。检查在黑暗中 808 纳米激光照射下核壳 UCN 溶液的上转换发射。要开始制备 DBCO 修饰的 UCN，请通过离心在 30 毫升乙醇中洗涤制备的核壳纳米晶体。

弃去上清液，加入 10 毫升 pH 值为 4 的盐酸水溶液。对混合物进行超声处理 30 分钟以溶解固体。将混合物转移到玻璃瓶中，剧烈搅拌 2 小时。

然后，用四份 30 毫升的乙醚洗涤混合物。合并乙醚馏分，将洗涤过的水层放在一边。用 10 毫升去离子水从乙醚层中回收痕量无配体的 UCN，并合并水层。

向混合的水层中加入 20 毫升丙酮，涡旋混合物 5 秒钟。将混合物以 35， 000 倍 g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀物溶于两毫升去离子水中，得到无配体 UCN 溶液。

接下来，通过超声处理将 200 毫克聚丙烯酸溶解在 20 毫升去离子水中 20 分钟。加入无配体 UCN 溶液，同时剧烈搅拌。用一摩尔氢氧化钠溶液将混合物的 pH 值调节至 7.4。

对混合物进行超声处理 30 分钟，并在室温下搅拌混合物 24 小时。然后，将混合物以 35， 000 x g 离心 10 分钟。通过在 10 毫升去离子水中离心 4 次来洗涤固体。

将洗涤后的固体分散在 8 毫升去离子水中，以获得每毫升 10 毫克的聚合物改性 UCN 溶液。将 1 毫克聚合物改性的 UCN 以 35， 000 倍 g 离心 10 分钟。将剩余的溶液储存在 4 摄氏度。

用 1 毫升的干 DMF 离心 3 次来洗涤固体。然后，将沉淀物溶解在 200 微升干燥的 DMF 中。向该溶液中加入 12.2 毫克 HOBT、14 毫克 EDC、5 毫克 DBCO 胺和 16 微升 DIPEA。

在室温下搅拌混合物 24 小时。然后，以 35， 000 倍 g 的速度将混合物离心 10 分钟。用 1 mL 的 DMSO 离心，将固体洗涤四次。

将 DBCO 修饰的 UCN 分散在 0.2 毫升 DMSO 中，并将分散体储存在 4 摄氏度。首先，在 12 孔板中接种 10 倍的第 5 个 HEK293 细胞，并在 37 摄氏度下孵育细胞 24 小时。然后，在微量离心管中，将 1 μg 所选质粒与 2 μL P3000 转染试剂混合在 100 μL MEM 中。

在另一个微量离心管中，将 1.5 μL 转染试剂与 100 μL MEM 混合。将两种混合物在室温下孵育 10 分钟。然后，混合混合物，加入 400 μL 低血清 MEM。

接下来，用 1 mL 的无血清 DMEM 洗涤孵育的细胞两次。将 600 μL 转染混合物分配到 12 孔板的孔中。将细胞在 37 摄氏度下孵育 4 小时。

然后，去除培养基，用 1 毫升 DMEM 洗涤细胞两次。在孔中分配 1 毫升四乙酰化 N-叠氮基乙酰基甘露糖胺溶液，溶于 DMEM。将细胞在 37 摄氏度下孵育两天。

然后，洗涤、胰蛋白酶消化并在共聚焦培养皿中将细胞重新培养过夜。接下来，用 1 毫升新鲜 DMEM 替换培养基，其中含有 2 微升每毫升 50 毫克的 DBCO-UCN 溶液。将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 小时，并用 DMEM 洗涤细胞两次。

关掉通风橱的灯，向细胞中加入适当的二烯缓冲溶液进行钙成像，并在黑暗中孵育细胞 30 分钟。用无血清 DMEM 洗涤细胞。用 808 纳米近红外光照射细胞，每平方厘米提供 0.8 瓦的功率。

交替照射 5 分钟，休息 5 分钟，直到细胞照射 20 分钟。用共聚焦显微镜对细胞进行成像。核和核壳 UCN 的透射电子显微镜显示壳厚约为 5 纳米的球形结构。

高分辨率 TEM 显示 d 间距与高度结晶的纳米结构一致。表面修饰后，UCN 很容易分散到缓冲溶液中。动态光散射表明，DBCO-UCNs 在水溶液中的流体动力学直径约为 96 nm。

PAA 和 DBCO 修饰的 UCN 的 zeta 电位表示带负电荷的表面，这与在缓冲水溶液中的溶解度和稳定性一致。上转换发射测试表明，当用 808 纳米光照射时，PAA 和 DBCO 改性的 UCN 具有与基核壳 UCN 相同的发射模式。表达光门控通道蛋白的叠氮化物标记的 HEK293 细胞用于测试 DBCO-UCNs 的生物应用。

UCN 在叠氮化物标签上的定位归因于用含叠氮化物的染料染色的 DBCO 组。当这些细胞暴露在近红外光下时，DBCO-UCN 促进了钙离子流过细胞膜，如共聚焦成像和带有荧光钙指示剂的流式细胞术所示。观看此视频后，您应该对如何制备具有生物相容性表面改性的核壳上转换纳米晶体及其进一步的生物应用有一个很好的了解，以按照此程序激活活细胞中的光门控离子通道。