Name: 利用广域跟踪平台对大型线虫种群进行自动行为分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习使用WF-NTP平台对秀丽隐杆线虫进行高通量行为分析，用于神经退行性疾病药物筛选。该方法可快速评估药物对阿尔茨海默病和帕金森病模型的治疗效果。

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本工作由蛋白质错误折叠疾病研究中心（CMD）资助。FAA 获得英国阿尔茨海默病协会高级研究奖学金资助（资助编号 317，AS-SF-16-003）。C. elegans 菌株由秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）提供。

1. C. elegans 实验方案所需材料的准备
<ol>
	<li>配制10倍浓度M9缓冲液，将30 g磷酸二氢钾、60 g磷酸氢二钠和50 g氯化钠加入1 L可高压灭菌瓶中。
	<ol>
		<li>加入1 L纯化水，高压灭菌 约 121 °C 灭菌 15 分钟</li>
		<li>用纯水稀释10倍，并在高压灭菌器中灭菌 约 121 °C 灭菌 15 分钟</li>
		<li>冷却后，加入1 mL 1 M硫酸镁溶液。 
		注意：以下步骤中处理线虫时应仅使用1x M9（M9）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备线虫生长培养基（Rich-NGM）时，将2.7 g氯化钠、15.75 g琼脂、5.75 g酪蛋白和900 mL纯水混合，于121 °C高压灭菌15 min。
	<ol>
		<li>将Rich-NGM培养基转移至约70 °C的保温箱中，若不立即使用；Rich-NGM在约70 °C下可保持熔融状态长达12小时，超过后则不宜再用。</li>
		<li>向Rich-NGM混合液中加入900 µL的1 M氯化钙溶液、900 µL的1 M硫酸镁溶液以及900 µL的胆固醇溶液（5 mg/mL，溶于无水乙醇中）。 
		注意： 胆固醇在使用前无需高压灭菌。</li>
		<li>为制备维持年龄同步群体的实验培养板，将92 µL浓度为812 µM的5-氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）加入900 mL富集型NGM培养基中。 
		注意： FUDR 具有剧毒和致癌性，因此除穿实验服和佩戴安全眼镜外，必须佩戴腈类手套。废弃物不得混入普通废物，须通过配备后燃器的焚烧设备进行处理。</li>
		<li>将20 mL高压灭菌的Rich-NGM倒入9 cm无菌培养皿中，制备生长平板（Rich-NGM平板）。将15 mL高压灭菌的Rich-NGM倒入9 cm无菌培养皿中，制备运动性平板（Mot平板）。将20 mL含FUDR的Rich-NGM倒入9 cm无菌培养皿中，制备FUDR平板。 
		注意： Mot平板中的低浓度琼脂有利于相机对焦和线虫追踪（见步骤3.2.5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备OP50 大肠杆菌 菌株，将1 L LB培养基在121 °C高压灭菌15分钟，冷却后接种起始培养物。
	<ol>
		<li>在37 °C下培养细菌过夜，并对将用于离心的试管进行灭菌。</li>
		<li>将细菌转移至无菌管中，在4,600 x g条件下离心 g 15分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用无菌水重悬沉淀物，重悬体积为原始体积的10%，制备成10倍浓缩的OP50菌液储备液。</li>
		<li>将15 mL 10倍浓缩的OP50菌液用无菌水稀释至150 mL，制备成1倍浓度的OP50菌液，用于接种富集型NGM平板。剩余的10倍浓缩菌液用于接种FUDR平板。 
		注意： Mot 培养板将保持不接种细胞，仅用于图像采集步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种细菌时，将Rich-NGM平板与FUDR平板分开。
	<ol>
		<li>在无菌条件下，向Rich-NGM平板中加入350 µL的1x OP50，均匀涂布。 
		注意： 不要将样品铺展至培养皿边缘，因为线虫会沿培养皿侧壁爬出并死亡。</li>
		<li>在无菌条件下，向含FUDR的平板中加入350 µL的10倍浓缩OP50菌液，并均匀涂布。</li>
		<li>让平板晾干，于20 °C培养2天后使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 线虫（C. elegans）用于宽场纳米移位技术前的准备
<ol>
	<li>将 C. elegans 培养在富集型 NGM 平板上，或通过将含有线虫的小块琼脂倒置转移到新鲜细菌菌层上进行传代。在开始实验方案之前，均以此方式维持 C. elegans 品系。</li>
	<li>采用传代方法（见步骤 2.1），将各品系的饱食后混合发育阶段线虫接种至 20 个平板，于 20 °C 培养 2 天。</li>
	<li>用 15 mL M9 溶液冲洗 5 个含线虫的平板，并将洗脱液收集至一个 15 mL 离心管中。对每个品系的全部 20 个平板重复此操作。</li>
	<li>以 2,000 x g 离心 2 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 2 mL M9 溶液中。</li>
	<li>通过将 13% 次氯酸钠与 4 M 氢氧化钠按 3:2 体积比混合，配制 10 mL 漂白液。 
	注意：该溶液无需高压灭菌。两种组分及最终溶液均具有腐蚀性，操作时应佩戴腈手套。氢氧化钠对玻璃有轻微腐蚀性，应储存于塑料容器中。</li>
	<li>向每个离心管中加入 1 mL 漂白液，剧烈震荡约 3.5 分钟，直至体壁完全溶解。</li>
	<li>在无菌条件下，将样品用 M9 溶液稀释至 15 mL，以 2,000 x g 离心 2 分钟，弃上清，沉淀重悬于 15 mL M9 溶液中。</li>
	<li>重复步骤 2.7 共 6 次，直至仅剩虫卵，且溶液不再有氯气味。</li>
	<li>以 2,000 x g 离心 2 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 2 mL M9 溶液中。</li>
	<li>在无菌条件下，使用无菌玻璃移液管将含虫卵的 2 mL M9 溶液转移至 12 孔细胞培养板的每一孔中，于 20 °C 培养至少 16 小时。 
	注意：不同品系应使用独立的培养板，以防止交叉污染。从离心管转移至多孔板的步骤有助于避免线虫窒息。</li>
	<li>将过夜孵化的线虫从 12 孔板转移至 15 mL 离心管中。取 3 滴 5 µL 虫液，计数其中处于一龄幼虫阶段（L1）的线虫数量。</li>
	<li>计算每 µL 溶液中的线虫数量。</li>
	<li>将 L1 期线虫以每板 3,000 条的密度接种至富集型 NGM 平板，于 20 °C 培养 2 天，直至发育至四龄幼虫（L4）阶段。</li>
</ol>
3. 通用宽场NTP协议
<ol>
	<li>加入2.2 mL适当浓度的每种药物化合物（如25或10 μM 对于如沙喹来明等药物18 和贝沙罗汀15分别将线虫菌株接种至6个含氟脱氧尿苷（FUDR）的平板上，并在无菌条件下干燥。 
	注意： 对每种待测化合物、每种浓度以及每种使用的溶剂均重复此步骤。
	<ol>
		<li>用15 mL M9缓冲液冲洗步骤2.13中准备的5块Rich-NGM平板上的线虫，并将线虫转移至离心管中。</li>
		<li>以 2,000 x g 离心 g 孵育2分钟，去除上清液，加入3 mL M9缓冲液重悬。取含有线虫的M9溶液3滴（每滴5 µL），计数处于最后幼虫期L4的线虫数量。</li>
		<li>计算每微升 M9 缓冲液中的线虫数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将700条L4期幼虫接种到含有特定化合物的干燥FUDR平板中的6个平板上，每种化合物的每种浓度均重复此操作，并在无菌条件下晾干。
	<ol>
		<li>将线虫在24 °C下孵育，从L4期开始，适用于那些仅通过升温诱导线虫瘫痪的品系，例如AD品系38将L4幼虫阶段的次日计为成虫期的第0天（D0）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开追踪器的舞台灯光。
	<ol>
		<li>用70%乙醇清洁玻璃载物台，确保无可见残留物，然后取下镜头盖。使用吹气球清洁成像镜头。确保相机已正确连接并安装，随后使用图像采集软件开始录制。</li>
		<li>将相机设置为每秒记录20帧，采用mono 16记录参数；记录1,200帧，以95%压缩率保存为MJPEG格式。使用一个空的9 cm培养皿确保载物台高度正确，必要时进行调整。 
		注意： 确保在录制过程中培养板的边缘可见，以便“keep-dead”算法能够正确运行（图1a).</li>
		<li>在无菌条件下，取步骤 3.2 中预先制备的 2 块相同条件的平板，以及步骤 1.2.4 中制备的 1 块 Mot 筛选平板。向 Mot 平板中加入 3 mL M9 溶液。用另外 2 mL M9 溶液冲洗步骤 3.2 制备的 2 块平板各三分之一的表面积，并将洗液转移至 Mot 平板中。</li>
		<li>将含有约5 mL M9溶液和约600条线虫的Mot板放置于追踪仪载物台上。使用单条线虫调焦相机，然后开始录制。</li>
		<li>记录完成后，丢弃带有线虫的 Mot 培养板；将已使用过的 FUDR 培养板标记为已使用一次，并放回培养箱。</li>
		<li>针对每种实验条件，重复步骤 3.3.3 至 3.3.5。</li>
		<li>对成年寿命中的每个时间点重复步骤 3.3.3 至 3.3.6。 
		注意：筛选程序可在线虫成虫期寿命的任意时间点进行（约 3 周）。这些方案支持最多 9 个时间点的筛选；作者建议从成虫期第 1 天开始，每 2 天进行一次筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 离散剂量研究的优化
<ol>
	<li>通过重复步骤 3.1.1 至 3.1.3 准备线虫。
	<ol>
		<li>将约 1000 条 L4 期线虫接种到 5 块 FUDR 培养基平板上。在 24 °C 下培养至成虫第 3 天，用于涉及 AD38 线虫的实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌玻璃移液管，将无菌条件下制备的线虫从平板转移至 15 mL 离心管中，在 2,000 × g 条件下离心 2 分钟，并弃去上清液。
	<ol>
		<li>将线虫悬浮于 1 mL M9 缓冲液中。转移至微量离心管，在 300 × g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行蛋白转导时，加入 40 µL 转染递送试剂和 20 µL 目标浓度（通常为 40 µM）的天然蛋白，在室温下孵育 30 分钟。
	<ol>
		<li>在无菌条件下，使用无菌玻璃移液管将步骤 4.2.1 中的线虫转移至含有包封蛋白的微量离心管中，总体积为 1060 µL。将离心管水平放置，在 24 °C、60 rpm 摇床培养箱中振荡孵育 8 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌条件下，向一块 Mot 培养基平板中加入 4 mL M9 溶液，并将一管线虫连同药物转移至该 Mot 平板上。
	<ol>
		<li>通过重复步骤 3.3 至 3.3.2 设置追踪系统。</li>
		<li>在无菌条件下，向一块 Mot 培养基平板中加入 4 mL M9 溶液，并将一管线虫连同药物转移至该 Mot 平板上。</li>
		<li>将 Mot 平板置于追踪仪载物台上，调节摄像头对准单条线虫并开始录像。完成后，标记 Mot 平板并妥善放置。</li>
		<li>对所有样品重复步骤 4.4.1 和 4.4.3。</li>
		<li>使用玻璃移液管在无菌条件下将线虫从 Mot 平板转移至 15 mL 离心管中，在 2,000 × g 条件下离心 2 分钟。弃去上清液，将沉淀物转移至 FUDR 平板上，并在无菌条件下晾干。</li>
		<li>对所有样品重复步骤 4.4.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将线虫在 24 °C 下继续培养至成虫第 6 天。 
	注意：也可进行多次抗体孵育。</li>
	<li>向 Mot 平板中加入 3 mL M9 缓冲液，并用 2 mL M9 溶液将 FUDR 平板上的所有线虫冲洗至 Mot 平板上。
	<ol>
		<li>通过重复步骤 3.3 至 3.3.2 设置追踪系统。</li>
		<li>将 Mot 平板置于追踪仪载物台上，根据需要调节摄像头焦距并开始录像。录像完成后，丢弃 Mot 平板或根据需要回收用于进一步筛选。</li>
		<li>对所有样品重复步骤 4.6 至 4.6.2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 分析视频数据
<ol>
	<li>获取视频后，在软件图形用户界面中选择适当参数（图2），用于数据分析。
	<ol>
		<li>通过浏览功能加载单个或多个视频。选择输出目标文件夹。确保30秒分析使用600至1,200帧。 
		注：可分析任意范围的帧。</li>
		<li>输入像素到毫米的转换系数，当以全分辨率成像9 cm培养皿时，该系数为0.029。选择“保留死亡”跟踪算法。 
		注：转换系数取决于所使用的视野。Z变换算法也可作为替代方案使用。</li>
		<li>填写定位部分的参数（图2）：Z使用图像 = 100，Z填充 = 3，标准像素 = 54，阈值 = 9，开运算 = 1，闭运算 = 2。调整过滤参数为最小尺寸 = 20，最大尺寸 = 180，类虫状 = 0.94。</li>
		<li>调节轨迹生成参数：最大移动距离 = 10；最小长度 = 150，记忆 = 10。</li>
		<li>设置弯曲与速度参数。将弯曲阈值设为1.8，最小弯曲数设为0，速度估计帧数设为150。</li>
		<li>调节死亡线虫统计参数。将每分钟最大波动次数设为5.0，最大速度设为1.0。</li>
		<li>选择输出文件夹。将输出帧数设为50。将字体大小设为10。 
		注：可选地，可选择一个或多个感兴趣区域（ROIs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用示例功能测试参数。输出示例图像，并检查线虫在8个阈值化步骤中是否均可见（图1）。</li>
	<li>使用开始任务功能。</li>
	<li>通过合并整个数据集的单个结果来分析文本结果文件。使用图形界面中的导出为tsv功能。 
	注：可选地，也可将线虫的个体指标用于群体研究。
	<ol>
		<li>使用统计软件包分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

由于光学科学领域技术的迅速发展，如今已有可能满足对自动化方法的需求 秀丽隐杆线虫 以显著新颖的方式开展研究。因此，出现了多种数字追踪平台20,41,42,43,44,45,46 在过去的几年中，已设计并推出多种工具，用于替代对手动计数参数的依赖，这些参数包括运动速度、弯曲频率、麻痹率，以及更为复杂的行为形式，如Ω形转弯，以及寿命测量。最近的自动化平台已显著提高了实验的可重复性和灵敏度 秀丽隐杆线虫 研究41 并对小规模群体甚至单个动物提供了高质量的数据。我们决定扩展对蠕虫行为分析的自动化，使其也能够并行评估数千只动物群体的表型。研究蠕虫群体的主要优势在于，能够考虑到蠕虫行为本身存在的高度内在变异性。24 并且由于药物治疗研究常常导致细微的表型变化，当使用少量动物时，很难以足够的统计学显著性检测到这些变化。因此，必须具备较高的检测效能（POD），以便可靠地检测出任何显著的行为变化，并减少假阳性结果。25.
本文介绍了一系列基于近期报道的 C. elegans 自动化筛选方法——宽视野线虫追踪平台（WF-NTP）36 的实验方案。本方案分为五个部分。第1和第2部分描述了大量线虫群体的制备过程。关键步骤包括实验环境的无菌条件，以及实验所需试剂和培养板的准备。需要注意的是，由于该方案相较于其他筛选方法具有更高的通量36，因此需要更多的试剂用量；在实验设计中必须充分考虑这一因素。我们还指出，漂白步骤至关重要，需提前进行测试，因为实验需要获得大量虫卵和健康的幼虫。第3部分详细说明了如何在固体培养基中递送药物并筛选线虫群体。需注意，该部分的实验规模高度依赖于用户并行测试的药物种类和浓度数量。由于筛选过程实现了完全自动化并可快速获取数据，实验的限速步骤已从行为观察转变为试剂准备以及大量线虫群体的培养与同步化。行为筛选中的关键步骤包括记录时间点的把握以及任何线虫操作步骤（例如，将线虫从NGM平板转移至追踪平台）。本文所述方案为一个示例，旨在对成虫寿命期间长达9天的行为进行筛选；然而，该方案可轻松调整以适应用户所需的任意时间点，例如连续18天36。第4部分则展示了该方案在向 C. elegans 递送蛋白质分子（如抗体和分子伴侣蛋白）中的应用，并说明如何根据具体应用需求对第1–3部分所述方案进行灵活调整。我们证明，该方法不仅可用于类药物分子的递送，还可拓展用于分子伴侣蛋白或抗体的给药37。除非另有说明，前四个步骤（部分）均需在无菌条件下进行。所有液体组分在使用前应进行高压灭菌，孵育过程应在70%相对湿度条件下进行。在第5部分中，我们介绍了如何结合追踪平台使用配套的软件包。该软件专为分析与大规模线虫群体行为相关的WF-NTP数据而定制设计。我们建议用户遵循第5部分提供的指南进行数据分析；然而，这些参数取决于所记录视频的具体特征（即帧率fps、视野范围、视频分辨率、采集帧数）。图形用户界面（GUI）中提供的示例函数旨在帮助用户在分析前评估合适的参数设置。
这些系列方案使得分析大规模群体表型成为可能 秀丽隐杆线虫 （目前可同时处理多达5,000条个体蠕虫），有效减少因动物行为内在变异性所导致的假象, 与初步研究结果一致，这些研究探讨了为达到统计学显著性所需的检测效能 秀丽隐杆线虫25该平台采用一套高分辨率摄像头系统，能够以高速记录大量动物的图像，同时对多个大规模群体进行同步记录。WF-NTP方案的高性能与高通量特性使其能够以极高精度检测线虫行为的微小变化。因此，该方法为生物学研究提供了新的研究途径，不仅限于 秀丽隐杆线虫，此外还可用于药理学和医学研究，例如基因修饰和药物处理的高通量筛选。该方法的另一优势在于可同时开展瘫痪表型研究与其他行为学指标的测量，这一特性在分子筛选研究中尤为关键。
迄今为止，在阿尔茨海默病（AD）15,34,35 和帕金森病（PD）18 的药物发现项目中所取得的结果表明，大视野数据采集对于显著增加单次实验中可监测的动物数量具有重要意义，从而显著降低实验误差，并大幅提高研究的统计学有效性。尽管本方案中描述的当前方法主要聚焦于解决药物发现领域的挑战，但我们希望该方法能在科研界得到广泛应用，并进一步拓展至复杂的遗传学和行为学研究，从而扩大目前可检测的表型数量。

大约半个世纪前，悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）提出了 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫) 作为研究发育和神经生物学的模式系统，因为这种小型（体长1毫米）、透明的线虫易于进行遗传操作，并可在实验室中方便地培养1今天， 秀丽隐杆线虫 用于研究多种生物过程，包括细胞凋亡、细胞信号转导、细胞周期特性、基因调控、代谢以及衰老2此外，细胞和组织的复杂性、蛋白质表达模式以及疾病通路在不同物种间的保守性 秀丽隐杆线虫 且高等生物（80%的线虫基因具有人类直系同源基因）与培养的简便性和成本效益相结合，使其成为一种高效的 体内 适用于高通量遗传学研究的模式生物3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 和药物14,15,16 筛选。由于上述所有原因， 秀丽隐杆线虫 已用于表征正常及疾病相关的分子通路；在神经退行性疾病领域，例如，该方法已实现对衰老对蛋白质聚集影响的探索3,4,7,15,17,18以及蛋白质聚集的启动子与抑制剂的表征3,4,5,6,7,14,18.
线虫的整体健康状况是此类研究中需要定义的一个重要行为参数，可通过多种手动方法进行测量，例如每分钟身体弯曲次数（BPM）4,6,19，或运动速度的测定20,21,22，以及平均寿命和麻痹速率的测量。尽管对身体弯曲次数和运动速度的手动测量已为多种分子通路和机制的研究提供了许多重要见解3,4,14,19,20,23，但目前的手动检测方法通量低、劳动强度高、耗时长，且容易引入误差和人为偏差。这些问题在收集具有足够统计效力以区分细微行为变化的数据时构成了重大挑战。这一局限性在药物筛选中尤为突出，因为潜在药物分子的处理通常仅引起微小的表型变化24，因此需要研究大量动物个体才能获得可重复的结果。为说明这一点，近期研究表明，必须具备高检测效能（POD），才能可靠地确定行为上的显著变化，并减少假阳性结果25。这促使秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域强烈希望以可重复、自动化、省时且经济高效的测量方法取代手动计数。为满足这一需求，近年来多个实验室已开发出用于高灵敏度测量及对大量线虫进行精确追踪的技术方法22,26,27,28,29,30,31,32,33。
为了进一步将自动化过程扩展到统计学显著性测量所需的大量动物群体，我们近期开发了一种宽视场线虫追踪平台（WF-NTP）15,34,35,36，该平台能够在极为庞大的线虫群体中同时检测多种表型读数&#160;，这是实现具有统计学意义的表型检测的关键因素25。目前，WF-NTP不仅可并行监测多达5,000只动物，其表型读数还包括多个参数，如身体弯曲的频率和幅度、运动速度、群体中瘫痪个体所占比例以及动物的体型大小。因此，可轻松实现对数千只线虫的并行筛选，并将不同读数整合为行为图谱，从而构建多维的行为指纹特征36。配套的开源软件采用Python编写，运行该软件亦需使用Python，且软件完全可自定义。同时提供图形用户界面（GUI），以便用户能够便捷地采用此技术。
本文介绍了一系列方案，用以说明WF-NTP的一些潜在应用。具体而言，我们讨论了从小分子到蛋白质治疗剂等多种化合物的给药方法，并描述了如何直接在大量线虫群体中筛选其效应，从而有效避免了仅对少量亚群进行取样分析的局限性。利用WF-NTP实现这一目标已在阿尔茨海默病（AD）15,34,35和帕金森病（PD）18的药物发现项目设计中展现出显著优势，这些研究利用体内数据对候选治疗药物进行评估35,37。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;可消耗试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨消化物（Difco）</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>211610</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2'-脱氧尿苷 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基胶囊</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>13% 次氯酸钠</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株 OP50</td><td>由 CGC 提供</td><td>Op50</td><td>E. coli 菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 野生型菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>N2</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; AD 菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>GMC101</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; PD 菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>NL5901</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; ALS 菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>AM725</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Tau 菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>BR5485</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 高压灭菌器</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 cm 无菌培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>2 L 锥形瓶</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus 地置式离心机</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>接种涂布器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>M4 多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>P10 移液器</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L 低吸附吸头</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 &amp;mu;L 低吸附吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 低吸附吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清移液管</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管 270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td>用于视频录制的摄像头</td></tr><tr><td>pulsin</td><td>Polyplus Transfection</td><td>501-04</td><td>转导试剂</td></tr><tr><td>Multitron Standard 摇床培养箱</td><td>Infors HT</td><td>INFO28573</td><td></td></tr><tr><td>气吹除尘器</td><td>Office Depot</td><td>1511631</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;WF-NTP 追踪组件及图像采集软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8'' × 8'' 背光源</td><td>Edmond Optics</td><td>88-508</td><td>追踪组件</td></tr><tr><td>适用于 1'' 传感器的 16 mm 焦距高分辨率镜头</td><td>Edmond Optics</td><td>86-571</td><td>追踪组件</td></tr><tr><td>6 百万像素摄像头</td><td>Edmond Optics</td><td>33540</td><td>追踪组件</td></tr><tr><td>FlyCapture 软件</td><td>PointGrey</td><td>SDK v2.12</td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>WF-NTP 软件</td><td>Cambridge Enterprise</td><td>v1.0</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>办公软件套件</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>统计分析软件</td></tr></tbody></table>

大型动物自动化行为分析 秀丽隐杆线虫 使用宽视野追踪平台的群体研究

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans 是生物医学研究中广泛使用的模式动物，常用于功能基因组学和衰老研究。为了评估实验动物的健康状况和适应性，通常依赖运动能力的检测指标，例如记录身体弯曲次数或运动速度。这些测量通常需要人工计数，难以获得良好的统计显著性，因为时间和人力的限制往往使每次实验的动物数量不超过25只。由于在研究微弱表型效应时，高统计效能对于获得可重复结果并减少假阳性与假阴性至关重要，近年来人们致力于开发自动化检测方案，以提高运动检测的灵敏度和实现多参数行为分析。 为了将检测限扩展到足以捕捉遗传学研究和药物发现中常见的微小表型变化所需的水平，本文介绍了一项技术进展，可同时研究多达5,000只个体动物，使测量的统计效能相比人工检测提高约1,000倍，相比其他现有自动化方法提高约100倍。

操作简便、多参数分析以及高通量是所展示的WF-NTP方案的优势图1 和 2）能够以非常精确的方式检测线虫行为的微小变化。该成像平台基于定制的光学机械装置，可使用600万像素单色相机，搭配适用于1''传感器的16 mm焦距高分辨率镜头，并采用8'' × 8''白色背光照明（参见 材料表 以及参考文献36 有关更多详细信息，请参见正文）。配套的 WF-NTP 软件使用 Python 编写，专为在 Windows 平台上运行而开发。该软件运行在一台定制组装的计算机上，配备 3.00 GHz 八核处理器和 64 GB 随机存取存储器（RAM）。该软件还设计为可根据计算机的 RAM 和 CPU 资源对任务和视频分析进行并行化处理； 即, 计算能力较低的设备将导致并行处理的视频数量减少。我们目前使用的配置经过优化，可并行处理约 16 个视频，并能完成约. 100个视频过夜处理。此外，WF-NTP图形用户界面（GUI）提供的高度定制化细节，使用户能够精确控制成像分析的质量。该GUI可用于并行上传大型数据集或单独视频；也可选择特定帧进行详细子分析，并结合像素转换因子，用于估算行为学指标。用户可根据是否希望在分析中纳入瘫痪动物，选择两种不同的追踪算法之一（keep dead 或 Z-transform）。阈值参数可根据视频和实验质量进行相应调整。开运算和闭运算参数允许用户去除噪声，并进一步实现阈值功能。骨架化算法提供了一种替代性的分析方法。对象大小截断（过滤）提供了额外的背景噪声过滤手段，而“蠕虫样参数”可让用户仅将具有椭球形状的对象视为蠕虫，从而区分其他可能与蠕虫像素大小相似的非目标对象。经过这些阈值处理后，所有生成的标记区域均可被识别为独立的蠕虫，并将各帧中这些区域的位置信息存储下来，用于后续分析与追踪。每个被追踪蠕虫的离心率用于估算蠕虫相关指标，例如蠕虫弯曲程度（BPM）随时间的变化。用户还可设定在发生碰撞后软件内存中保留蠕虫的帧数，以及蠕虫在连续帧间可移动的最大像素数，以进一步区分真实动物与噪声。最小轨迹长度选项允许用户剔除仅被追踪少数几帧的蠕虫。其他关键参数，如弯曲次数和速度，允许用户设定被计为一次体节弯曲所需的弯曲程度，以及估算动物运动速度所需的帧数。截断参数还可进一步调整以决定是否包含瘫痪动物。输出结果将自动显示在结果文件中。这些数值被视为评估瘫痪动物比例的上限。用户还可选择一个或多个感兴趣区域，此功能特别适用于分析蠕虫亚群，且输出结果将在结果文件中自动分类排序。输出选项允许用户指定输出文件夹及生成的追踪帧数。此外，还可使用多种工具集进行进一步数据分析，例如“轨迹路径工具”可显示单个蠕虫的运动轨迹，“指纹图谱工具”则允许用户生成指纹图谱。
这种方法能够推动新方法的采用，不仅适用于生物学研究 C. elegans 但也可用于药理学和医学研究，例如对基因修饰和药物治疗进行高通量筛选。我们通过描述大规模人群研究表型特征的方法，展示了这一潜力（N &gt; 1000）多种神经退行性疾病（额颞叶痴呆（FTD））的线虫模型39，帕金森病（PD）7，阿尔茨海默病（AD）16,40，以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）19 (图3a，并利用帕金森病的线虫模型表征潜在治疗分子的作用18 和阿尔茨海默病15,12 (图 3b）。两种小分子，鲨胺18 和贝沙罗汀15，给药浓度高达 25 µM 至 PD（图3b）和 10 µM 至 AD38 (图3b）线虫。两种化合物在测试的浓度范围内均表现出明显的剂量依赖性效应。我们已证明，与传统方法相比，通过增加可分析的线虫数量，能够实现高精度的测量结果图3c). 我们阐述了样本量的重要性（图3c)在分子筛选以及突变株的表征中具有重要意义。温度从 20 °C 导致约一半的AD线虫在成虫后3天出现瘫痪。在不同条件下对线虫群体进行了筛选，例如, 当过度表达淀粉样蛋白-β肽（Aβ）42个残基形式的线虫1-42)（AD 蠕虫）暴露于细微的温度变化（图 3c，左侧面板），当 Aβ1-42 在所有神经元中均有表达（图3c，中央面板），或当AD线虫暴露于贝沙罗汀（bexarotene）时图 3c，右侧面板）。还从使用WF-NTP获取的视频全视野中随机选择的小型ROI中分析了线虫（N &lt; 50，黄色条形图）突出显示了这些蠕虫的运动性与整个蠕虫群体平均运动性的比较（N &lt; 1,000）。在所有图示中，对整个蠕虫群体测量的差异均具有统计学显著性，p ≤ 0.0001（****）。
本文所述的WF-NTP协议还允许同时记录多个参数（图1b），以最佳方式支持内部验证，并相对于对照样本建立广泛条件的综合指纹图谱，从而实现跨多项研究的有意义比较。这种多参数方法包括对多种行为特征的同时分析，如弯曲频率、运动速度、麻痹率、体型大小、弯曲幅度和弯曲位移36。该方法可对数千个个体进行高度详细、高灵敏度且具有高度统计学显著性的监测，为大规模群体研究提供了可能。此外，该追踪方法的优势在于可将麻痹研究与其他行为测量并行开展，这对于分子筛选研究尤为关键。
迄今为止在阿尔茨海默病15,34,35 和帕金森病18 药物发现中取得的结果表明，大视野数据采集对于显著增加单次实验中可监测的动物数量具有重要意义，可显著降低实验误差，并大幅提高研究的统计学有效性。基于这些结果，我们预计，我们已向科研社区公开提供的大视野神经元追踪平台（WF-NTP）协议36，将显著拓展秀丽隐杆线虫（C. elegans）的应用范围。
<img alt="计算机视觉分析示意图；图像处理步骤；蜘蛛图；行为分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：WF-NTP分析步骤及表型指纹示例。（a）1. 原始视频。2. 背景图像。3. 背景相减后的图像。4–6. 阈值分割步骤。7–9. 线虫的单个标记。（b）针对野生型线虫以及帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）线虫模型，报告了多种表型的指纹图谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="用于视频分析的图形用户界面；实用工具，感兴趣区域示意图；数据处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：WF-NTP 的图形用户界面（GUI）。 可在图形用户界面中选择特定视频和选定帧进行分析，并输入像素转换系数，随后使用提供的两种追踪算法之一进行分析。用户可设定计为一次身体弯曲所需的弯曲程度，以及用于估算动物运动速度所需的帧数。身体弯曲和速度阈值可用于确定麻痹线虫的统计结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="鲨烯胺、贝沙罗汀用于人群研究和分子筛查的检测效能分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：WF-NTP方法实现的应用示例. (a) 大样本人群研究中WF-NTP的应用（N &gt; 1,000 次 BPM 测量结果 C. elegans 包括额颞叶痴呆（FTD）、帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）在内的多种神经退行性疾病模型。b) WF-NTP 在药物发现中的应用。 (c) 温度敏感性、药物疗效及突变株特性表征中群体研究的重要性。亚群表型 N &lt; 50（黄色条形）与整个蠕虫群体（N &lt; 1,000）。误差线表示平均值的标准误（SEM）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们介绍了使用宽视场线虫追踪平台（WF-NTP）的实验方案，该平台可实现对大量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）群体进行高通量的表型表征。这些方案可用于以高度可扩展的方式，表征突变品系或药物处理后所引起的细微行为变化。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是生物医学研究中广泛使用的动物模型，常用于功能基因组学和衰老研究。为了评估……

因此，该方法有助于回答药物研发过程中关于特定药物在活体生物体内作用方式的关键问题。该技术的主要优势在于，能够快速高效地筛选大量样本。通过实现对候选药物效应的高度定量评估，该技术已在药物发现领域产生重大影响。该方法为蛋白质错误折叠疾病的发病机制及进展提供了新的理论见解。此外，该方法还可应用于其他研究体系，如衰老及遗传筛选。我们非常期待借此机会将新的物理方法引入药物发现领域。该方法的演示至关重要，因为筛选步骤需要对这种新型自动技术具有高度的熟悉。本实验操作将由本实验室的搜索助理 Sam Casford 进行演示。在开始实验之前，为每种线虫品系准备六块含有 5-氟脱氧尿苷（5-fluorodeoxyuridine，FUDR）或 FUDR 的培养板，将每种药物化合物在适当浓度下各取 2.2 毫升，仔细均匀涂布于培养板的整个表面，并在无菌条件下将培养板晾干。在平板晾干的同时，使用 15 毫升 M9 缓冲液从五块富集型线虫生长培养基平板上冲洗线虫，并将收集到的线虫转移至一个锥形管中进行离心。将线虫重新悬浮于 3 毫升新鲜 M9 缓冲液中，以定量处于 L4 幼虫期的线虫数量，并按每种线虫品系、每种化合物分别在六块干燥的 FUDR 平板上接种 700 条 L4 幼虫。完成所有线虫接种后，将需要通过升温诱导瘫痪表型的线虫品系平板置于 24 摄氏度环境中培养 24 小时。第二天，打开并行线虫追踪系统的舞台灯，用70%的乙醇清洁追踪系统的玻璃平台。若无可见残留物，则取下镜头盖，并使用吹尘器清洁成像镜头。确认相机已正确连接并安装到位，然后使用图像采集软件开始记录。将相机设置调整为以每秒20帧的速度录制，并采用适当的mono-16录制参数。使用一个空的9厘米培养皿，确保载物台高度设置正确，必要时进行调整。在无菌条件下，向运动性筛选平板中加入3毫升M9溶液，并用2毫升M9溶液冲洗来自同一实验组的两个线虫负载FUDR平板表面积的三分之一，将洗液转移至筛选平板中。然后，将筛选板放置在追踪仪载物台上。使用一条线虫来对相机进行对焦，并开始记录动物的运动。当记录完成后，丢弃运动能力检测板，并在将FUDR板放回培养箱之前，标记其已被使用过一次。为了分析视频数据，打开并行线虫追踪数据分析软件的图形用户界面，使用浏览功能加载感兴趣的视频。选择一个输出目标文件夹，并确认已设置 600 至 1200 帧用于 30 秒的分析。输入 0.029 像素/毫米的转换系数，用于全分辨率下九厘米培养皿的成像，并选择保留死亡个体追踪算法。在定位参数选项卡中，将Z轴使用图像设为100，Z轴填充设为3，标准像素设为54，阈值设为9，开运算设为1，闭运算设为2。将过滤参数调整为最小尺寸20，最大尺寸180，类虫形系数设为0.94。将轨迹形成参数设置为最大移动距离10，最小长度150，记忆帧数10。将弯曲和速度参数设置为弯曲阈值 1.8，最小弯曲次数 0，用于估计速度的帧数为 150。将死亡线虫的统计参数调整为每分钟最大波动次数 5，最大速度为 1。选择输出文件夹，并设置输出帧数为 50，字体大小为 10。使用示例函数测试参数，并输出样本图像，以检查在线虫的八个阈值处理步骤中是否均能清晰可见。然后启动“开始任务”功能，整合整个数据集的各个结果以分析测试结果文件，并通过导出为 TSV 文件的功能保存结果。该方法可用于对多种神经退行性疾病线虫模型（如额颞叶痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症）进行大规模群体研究中的线虫表型特征分析。除了利用帕金森病和阿尔茨海默病的线虫模型来表征潜在治疗分子的作用外，该方法还通过增加可分析的线虫数量，实现了比传统方法更高的测量精度。在执行该操作时，需注意尽量缩短将线虫加入运动性检测装置后至开始追踪之间的时间间隔。完成此操作后，可采用其他方法来补充结果，并关联蛋白质聚集现象。该技术问世后，为帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病和蛋白质错误折叠疾病领域的研究人员探索相关发现应用铺平了道路。请注意，FUDR具有极高危险性，操作过程中必须始终采取预防措施，例如佩戴腈类手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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