用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

本方案提供了在微流控装置中进行可控的二维和三维共培养的实验设置，用于可视化和监测肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，并分析抗癌治疗的效果。该技术可实现实时、便捷地观察免疫细胞的募集与相互作用，适用于人源及患者来源的样本，并与大多数先进的显微镜技术兼容。

演示该实验操作的人员为意大利高等卫生研究院肿瘤与分子医学系的博士生Francesco Noto，以及圣心天主教大学转化医学与外科学系的博士生Nicoleta Manduca和Esther Maccafeo。芯片需预先在洁净室中使用等离子清洗机或反应性离子刻蚀仪进行等离子活化处理。本实验采用小鼠脾细胞和一种肿瘤细胞系，以模拟文中所述的实验方案。

在接种细胞悬液之前，从全部六个储液池中吸出培养基。随后，将重悬于10至50 µL生长培养基中的1 × 10⁵个肿瘤细胞缓慢加入左上方储液池和下方孔中。在右侧，轻轻将重悬于50 µL生长培养基中的1 × 10⁶个悬浮免疫细胞移液至两个孔中。

所有细胞添加完毕后，向每个芯片的全部六个储液池中各加入 100 至 150 微升培养基，并检查细胞是否已正确分布于各个培养腔室内。将芯片孵育一小时，以使系统在开始延时成像前达到稳定状态。进行活细胞成像时，将含肿瘤免疫细胞的芯片培养板安装在显微镜载物台上。

在显微镜软件界面（如 Incucyte 活细胞分析软件）中自定义采集工作流程设置。根据实验和所研究细胞类型的适当参数，选择观察视野、最佳帧率和时间持续时间。在适当的实验时间段内对细胞进行成像。

使用预冷的枪头，将Matrigel用含有药物或药物组合的培养基稀释，为两种实验条件各准备两份等分试样。将悬浮于基质溶液中并用荧光染料标记的活细胞在冰上轻轻吹打混匀，以获得细胞的均匀分布。将芯片板置于冷却块或装有冰的篮子上，使用预冷的10微升移液枪头，缓慢将经药物处理的肿瘤细胞基质溶液注入左侧和右侧的凝胶加样口。

轻轻施加压力，将基质溶液从通道的一侧推至另一侧。所有肿瘤细胞加载完毕后，将装置直立放入培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，待基质完全凝胶化，向全部六个储液池的培养基通道中各加入50微升培养基。

在显微镜下检查聚合凝胶的完整性及肿瘤细胞的分布情况，然后将芯片放入培养箱中孵育，直至免疫细胞制备完成。孵育结束后，吸去每个孔中的培养基。

将移液 tip 置于中间培养基通道的入口附近，用适中的压力轻轻注入 10 微升浓度为 10⁶ 的、用对比性荧光染料标记的免疫细胞。向四个侧通道的每个孔中注入 50 至 100 微升培养基，向顶部中央孔中注入 40 至 90 微升培养基，向底部中央孔中注入 50 至 100 微升培养基。当所有孔均加样完成后，使用显微镜确认免疫细胞的分布仍局限于中央腔室。

然后小心地将装置放置于细胞培养孵育箱内的水平表面上，直至成像。为计算荧光标记的活免疫细胞浸润肿瘤区域的程度，需在特定感兴趣的时间点通过荧光显微镜对装置进行成像，并在显微镜成像软件（如 Nikon NIS-Elements）中设置适当的相机参数。同时，为标记的免疫细胞设置相应的参数。

通过视频显微镜，可以追踪白细胞在微流控平台中经由适当构建的微通道桥向其靶细胞迁移的过程。在此追踪分析中，分别用死亡的多柔比星处理的癌细胞或活的磷酸盐缓冲液（PBS）处理的癌细胞刺激单个外周血单个核细胞（PBMCs）。系统自动生成了相关的趋化值和迁移图谱，结果显示，当免疫细胞与经多柔比星或PBS处理的乳腺癌细胞共加载时，其迁移模式存在差异。

当PBMCs与凋亡的癌细胞接触时，它们会穿过微通道趋向于濒死和死亡的细胞，但不会向存活的未处理细胞迁移。在本分析中，采用了一种新型的3D免疫活性肿瘤模型，用于量化免疫细胞对表观遗传药物联合抗肿瘤治疗的募集反应。

随后将红色染料标记的外周血单个核细胞（PBMCs）均匀分布至中央流体腔室中。接着比较两个肿瘤团块对PBMCs的趋化能力，在本实验中，PBMCs被显著募集至右侧微通道。对于3D模型，需在冰上将溶液与水凝胶及细胞混合，避免产生气泡和预聚合。

缓慢注射，避免过度加压。根据所使用的基质调整聚合步骤。可实施活/死细胞检测及上清液中细胞因子分泌谱分析。

可进行共聚焦成像的免疫荧光实验，以分类免疫亚型及检测活化与耗竭成熟相关的表达标志物。