Name: 用于剖析体外肿瘤微环境中免疫反应的微流控共培养模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解微流控共培养模型技术，用于体外肿瘤微环境中免疫反应的实时可视化与动态监测。该方法支持二维和三维培养，适用于人源及患者来源样本，助力癌症免疫治疗研究。

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作者无任何利益冲突需要披露。AS 由意大利癌症研究基金会（AIRC，启动基金 2016 #18418）和意大利卫生部（RF_GR-2013-02357273）提供资助。GS 和 FM 由意大利癌症研究协会（AIRC）项目编号 21366（资助对象：G.S.）提供支持。

所述方法旨在以可调节的复杂程度，建立一种通用方法，以重现肿瘤免疫学领域的两个重要方面，从而受益于采用更具生理相关性的体外模型。第一个方面涉及肿瘤细胞群体本身，研究单个细胞的特性有助于更准确地描述其异质性以及相关的生物学和临床意义，包括对治疗的耐药性、转移倾向、干细胞特性及分化程度。另一方面则是肿瘤微环境（TME），包括非癌性组分（免疫细胞和基质细胞、血管）以及化学/物理环境（细胞外基质成分、趋化因子及其他释放的可溶性因子），这些因素可深刻影响疾病特征及个体对治疗——尤其是免疫治疗——的反应63。值得注意的是，将上述方法拓展至其他研究领域时，需充分理解新模型在开发与应用过程中所带来的一系列局限性与挑战。
引用工程建模中的一条准则（“对问题建模，而非对系统建模”），必须优化确定在芯片模型中所需的最少（细胞、物理和化学）组分与条件，以确保模型在整个实验过程中具有生物学相关性和稳定性。因此，每种细胞类型、微环境和实验设置的组合都必须经过仔细选择、评估，并在单次实验以及不同实验批次之间持续监测。这些检查包括如实验方案部分所述，严格控制微流控装置...

不同医学分支发展为实验性学科，依赖于在受控条件下操控细胞群体和器官功能的能力1。这种能力的基础在于是否存在可测量的模型，以重现人体内发生的生理过程。
在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代2，癌症生物学需要借助新兴的体外和计算模型，在恰当的时空背景下研究肿瘤与免疫系统的相互作用界面2,3。
肿瘤微环境4（TME）是一种复杂的组织，其中肿瘤细胞持续与其它细胞成分（免疫细胞、基质细胞和内皮细胞）以及非细胞成分（细胞外基质，ECM）相互作用并动态共进化。这一复杂环境的动态特性决定了免疫细胞是作为恶性细胞的“朋友”还是“敌人”，从而显著影响疾病进展及对治疗的反应。目前，肿瘤免疫学家、生物信息学家和系统生物学专家正共同努力，以阐明肿瘤异质性5,6在空间（即不同肿瘤区域）和时间（即肿瘤进展的不同阶段）上的临床意义5,6，并在单细胞水平上表征肿瘤细胞和免疫细胞的表型与功能。作为这种协同研究的一个范例，先进的计算机视觉技术目前已被常规用于对组织学样本中免疫浸润进行空间定位分析7,8。
在实验模型领域，微流控技术和共培养技术的发展架起了动物实验与传统体外方法之间的桥梁，使得研究人员能够构建多种微工程细胞模型，例如类器官、微生理系统9,10,11（MPS）以及器官芯片12,13,14（OOC）。这些模型的共同特点是能够聚焦细胞生态系统的“宏观图景”，在利用高内涵显微镜15和图像处理方法的同时，拓展体外控制微环境因素的能力。
如今，先进的微生理系统（MPS）和器官芯片（OOC）系统已开始纳入免疫学因素，通过在现有组织和共培养体系中引入不同亚型的免疫细胞，以探索和测量多种生理病理过程，如炎症性疾病、伤口愈合、黏膜免疫以及对毒素或日常食品成分的反应16肿瘤微环境芯片模型10,11,12,13,14,15,16,17，还可与可灌注的微血管集成18,19,20,21，已开发用于研究细胞类型依赖性相互作用、物理和化学扰动以及浸润性淋巴细胞的细胞毒性活性22，以及具有临床相关性的免疫调节剂23.
本文提供了多种通用实验方案，涵盖从细胞加载到芯片到图像处理工具的全过程，可用于开展二维（第1部分）和三维（第2部分）条件下的先进肿瘤-免疫微流控共培养16，并兼容对细胞功能的动态、多参数24监测与可视化。通过采用Fiji免费软件及其工具箱25,26，本方法在样本处理和数据分析方面均保持了操作简便性和灵活性。
第1节中描述的微流控装置旨在进行贴壁癌细胞与悬浮免疫细胞的二维共培养。该平台已验证可用于体外检测存在基因突变27和/或免疫缺陷28情况下免疫细胞的行为。本文介绍了利用基于Trackmate（Fiji软件中的一个插件）的半自动方法，在明场延时图像中追踪免疫细胞的步骤。该方法可提取免疫细胞迁移的动力学参数29以及其对靶向癌细胞的响应参数（即相互作用时间），无论这些癌细胞是否经过免疫原性细胞死亡诱导剂处理27。
重要的是，这些从时间序列图像中提取的参数可以通过先进的数学方法进行处理。作为该方法潜力的一个示例，我们课题组近期发表了一项分析，该分析基于随机过程和统计力学的数学方法，用于建模细胞网络特性，并对免疫细胞行为提供参数化描述（例如，有偏或无相关性的随机游走、高度协调或非协调性运动30,31）。
第二部分提供的3D实验体系基于一种共培养方案，通过竞争性方式在两个凝胶区域中嵌入不同类型细胞和药物的组合，以重建更为复杂的具有免疫活性的肿瘤微环境（TME）。本文描述了图像处理步骤，用于在不同时间点定量分析标记的免疫细胞向Matrigel中培养的人A375M黑色素瘤细胞的浸润情况，以评估抗肿瘤药物组合的效果32。A375M细胞系是由A375P衍生而来的细胞系，具有高度转移表型，被选用于评估其在免疫细胞存在下的转移能力32。
所述模型可完全兼容多种细胞来源（包括小鼠和人类的永生化细胞系或原代细胞系、类器官、异种移植瘤等）。在本实验室近期的研究中，通过结合高内涵视频显微镜与图像分析技术，将竞争性3D布局应用于以下研究：i）在HER2+乳腺癌芯片模型中，分析抗肿瘤免疫反应（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC），并解析成纤维细胞在曲妥珠单抗治疗耐药中的作用33；ii）研究髓系细胞（即肿瘤相关巨噬细胞）在肿瘤逃逸机制及T细胞募集过程中的作用34；iii）评估基于干扰素-α诱导的树突状细胞（IFN-DCs）的免疫治疗方案的疗效，具体方法是在胶原基质中将经药物处理的结肠癌细胞与IFN-DCs共培养，并分析其有效运动及随后的吞噬事件35；iv）研究骨髓来源嗜酸性粒细胞向经IL-33处理或未处理的黑色素瘤细胞进行趋化迁移的过程36。
这些先进模型可作为观察窗口，用于理解免疫微环境在癌症转移和耐药机制中的作用，但需要进一步努力将研究成果转化为临床应用，以弥合基础研究与临床之间的差距37。
作为一种新兴趋势，将自动化高内涵显微镜技术与更符合生理特征的微系统相结合，正在为处理、分析和解读单次实验可能产生的数百甚至数千吉字节多参数数据带来全新的挑战。这直接推动了器官芯片（OOC）实验与基于人工智能38,39,40,41,42（AI）算法的结合，不仅可用于高级自动化分析，还可提取特征参数，进而输入癌症-免疫相互作用的计算机模型43，在预测性药物筛选实验的开发等方面展现出令人期待的新应用前景44。
越来越多的研究致力于疾病模型的设计，同时优化大规模扰动筛选策略，并结合单细胞多组学检测手段。这无疑将推动系统性“癌症免疫芯片”方法的发展，并有望实现其在临床上的应用，同时伴随适当程度的方法标准化，从而深入揭示免疫紊乱和癌症扩散机制的新见解。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养材料&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning-Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>CLS430828</td><td>离心管</td></tr><tr><td>5-aza-2'-deoxycytidine DAC</td><td>Millipore-Sigma；St. Louis，MO</td><td>A3656</td><td>DNA去甲基化剂</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Corning-Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>CLS3506</td><td>培养皿</td></tr><tr><td>75 cm² 细胞培养处理过的培养瓶</td><td>康宁，纽约州，纽约</td><td>430641U</td><td>培养瓶</td></tr><tr><td>A365M</td><td>美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>&lt;br/&gt; CVCL_B222</td><td>人黑色素瘤细胞系</td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>Millipore-Sigma；St. Louis，MO</td><td>D1515</td><td>蒽环类抗生素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基 DMEM</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECM0728L</td><td>SK-MEL-28 细胞培养基&amp;nbsp; 细胞</td></tr><tr><td>不含钙不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECB4004L</td><td>生理盐水缓冲液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECS0180L</td><td>细胞培养辅助设备</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE-Heathcare</td><td>17-1440-02</td><td>从人血中分离单个核细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Neubauer</td><td></td><td>细胞计数器</td></tr><tr><td>肝素化小瓶</td><td>赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td>静脉血采集管</td></tr><tr><td>干扰素α-2b</td><td>Millipore-Sigma；St. Louis，MO</td><td>SRP4595</td><td>重组人细胞因子</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100X</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECB3000D</td><td>细胞培养辅助设备</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte 细胞分离培养基</td><td>Cedarlane Labs，Burlington，加拿大</td><td></td><td>通过密度梯度离心法分离淋巴细胞</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield PoC AS，挪威奥斯陆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>康宁，纽约州，纽约</td><td>354230</td><td>生长因子减少型基底膜基质</td></tr><tr><td>MDA-MB-231&amp;nbsp;</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>&amp;nbsp;HTB-26</td><td>人乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100X&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECB3001D</td><td>细胞培养辅助设备</td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>4-000-201</td><td>液体处理</td></tr><tr><td>PKH26 红色荧光细胞连接剂</td><td>Millipore-Sigma；St. Louis，MO</td><td>PKH26GL</td><td>红色荧光细胞染料</td></tr><tr><td>PKH67 绿色荧光细胞连接剂</td><td>Millipore-Sigma；St. Louis，MO</td><td>PKH67GL</td><td>绿色荧光细胞染料</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECM2001L</td><td>MDA-MB-231 细胞培养基</td></tr><tr><td>血清移液管（2 mL，5 mL，10 mL，25 mL，50 mL）</td><td>Corning- Millipore-Sigma；St. Louis，MO</td><td>CLS4486；CLS4487；CLS4488；CLS4489；CLS4490</td><td>液体处理</td></tr><tr><td>无菌吸头（1-10 &amp;mu;L, 10-20 &amp;mu;L, 20-200 &amp;mu;L, 1000 &amp;mu;L)</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECTD00010；ECTD00020；ECTD00200；ECTD01005</td><td>移液器使用技巧</td></tr><tr><td>计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>15250061</td><td>用于评估细胞活力的细胞染色</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>EuroClone Spa，意大利米兰</td><td>ECM0920D</td><td>贴壁细胞解离试剂</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS-FL 荧光显微镜</td><td>赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td>活细胞荧光显微镜</td></tr><tr><td>人源化细胞培养孵育箱&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>311 型直接加热 CO₂ 培养箱；TC 230</td><td>细胞培养的孵育 37 &amp;deg;C，5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>朱莉显微镜</td><td>Nanoentek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室冰箱（4 &amp;deg;C)</td><td>FDM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室安全柜（II级）</td><td>Steril VBH 72 MP</td><td></td><td>层流罩</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可冷藏离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微加工材料&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷（Aptes）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td>用于将PDMS键合到塑料盖玻片的硅烷化试剂</td></tr><tr><td>铬石英掩模 / 4&quot;×4&quot;HRC / 无AZ&amp;nbsp;</td><td>MB W&amp;amp;A,&amp;nbsp; 德国</td><td></td><td>光刻用光学掩模</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，D 263 M 舒特玻璃&amp;nbsp; (170 &amp;plusmn; 5 &amp;micro;m)</td><td>Ibidi，德国</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>30%过氧化氢溶液</td><td>卡洛·埃尔巴试剂</td><td>412081</td><td>过硫酸铵溶液试剂</td></tr><tr><td>甲基异丁基酮</td><td>卡洛·埃尔巴试剂</td><td>461945</td><td>PMMA电子束抗蚀剂显影液</td></tr><tr><td>显微镜载玻片（50片装）76.2 mm × 25.4 mm&amp;nbsp;</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td>用于键合芯片的基底</td></tr><tr><td>Miltex 活检穿孔器配推杆，内径 1.0 mm</td><td>Tedpella</td><td></td><td>用于芯片储液池的皮肤活检打孔器</td></tr><tr><td>PMMA&amp;nbsp; 950 kDa</td><td>Allresist，德国</td><td>AR-P. 679.04</td><td>用于光学掩模图案化的正性电子束光刻胶</td></tr><tr><td>未经处理的聚合物盖玻片</td><td>Ibidi，德国</td><td>10813</td><td>用于键合芯片的基底</td></tr><tr><td>Prime CZ-Si晶圆&amp;nbsp; 4&amp;rdquo;，（100），硼掺杂</td><td>Gambetti Xenologia Srl，意大利</td><td>30255</td><td></td></tr><tr><td>丙-2-醇</td><td>卡洛·埃尔巴试剂</td><td>415238</td><td></td></tr><tr><td>丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484431-4L</td><td>SU-8 抗蚀剂显影液</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>Micro resist technology，德国</td><td>C1.02.003-0001</td><td>负性光刻胶</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Micro resist technology，德国</td><td>C1.02.003-0005</td><td>负性光刻胶</td></tr><tr><td>Biopunch套件，ID 4.0 mm，6.0 mm，8.0 mm</td><td>Tedpella</td><td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td><td>用于芯片储液池的皮肤活检打孔器</td></tr><tr><td>硫酸 96%</td><td>卡洛·埃尔巴试剂</td><td>410381</td><td>过硫酸铵溶液试剂</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>11-3184-01</td><td>硅酮弹性体（PDMS）</td></tr><tr><td>三甲基氯硅烷 (TMCS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360-100ML</td><td>SU-8 图案化模具的硅烷化试剂</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微加工设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 kV 电子束光刻</td><td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>热板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学光刻系统</td><td>EV-420 双面接触式掩模对准器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反应离子刻蚀系统</td><td>Oxford Plasmalab 80 Plus 系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

复杂的疾病模型需要前沿工具，以提供具有生理和病理相关性的可操作见解，并揭示原本无法观察到的生物学过程。能够紧密模拟体内环境的先进细胞检测技术正成为可视化和量化影响癌症进展的肿瘤-宿主双向相互作用的新方法。本文中，我们描述了两种多功能实验方案，可在微流控装置中重建高度可控的二维（2D）和三维（3D）共培养体系，以模拟在自然状态及治疗诱导的免疫监视条件下肿瘤微环境（TME）的复杂性。在第一部分中，我们提供了一种实验设置，通过明场延时显微镜监测贴壁肿瘤细胞与悬浮免疫细胞群体之间的相互作用。作为应用示例，我们分析了抗癌治疗（如所谓的免疫原性肿瘤细胞死亡诱导剂）对免疫细胞募集和活化的影响。在第二部分中，构建了具有竞争性布局的三维肿瘤-免疫微环境，并通过荧光静态成像监测长达72小时的差异性免疫细胞浸润，以评估联合治疗策略的效果。在这两种实验体系中，均展示了图像处理步骤，用于提取多种免疫细胞参数（例如免疫细胞迁移与相互作用、对治疗药物的响应等）。这些简单而强大的方法可进一步优化，以模拟包含肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞亚群的异质性与可塑性，以及它们之间作为癌症演化驱动力的相互作用所构成的TME复杂性。这些快速发展的技术与活细胞高内涵成像的兼容性，将产生大量信息丰富的数据集，同时也带来新的挑战。事实上，“共培养/显微成像/高级数据分析”三者结合，为精确的问题参数化指明了方向，有助于制定个性化的治疗方案。我们预期，未来将芯片上的肿瘤-免疫系统与人工智能相结合，用于高通量数据处理，将协同推动其作为精准医学和个体化肿瘤学中预测性与临床前工具的能力迈上新台阶。

肿瘤免疫浸润是宿主抗肿瘤反应的一个参数。肿瘤中浸润性白细胞的组成、密度、位置和功能状态具有异质性，这些白细胞与癌细胞之间的相互作用可能蕴含可用于预测疾病进程和治疗反应的临床相关信息。在此背景下，微流控技术可作为互补且具有优势的体外工具，用于探索肿瘤的免疫微环境，以及监测对抗癌治疗的反应。将微流控检测、活细胞成像与追踪软件相结合，可能建立可靠的定量方法，以量化免疫细胞在不同环境下如何调整其迁移模式。在本章节中，我们报告了在通过标准软光刻工艺制备的定制微流控装置中，建立免疫细胞与靶向癌细胞的多功能二维（2D）或三维（3D）共培养体系的操作步骤。在第1节中，使用微流控装置使贴壁细胞（MDA-MB-231癌细胞）与非贴壁细胞（外周血单个核细胞，PBMCs）之间实现化学和物理接触。某些化疗药物（如蒽环类药物等）可诱导恶性细胞发生“免疫原性”凋亡，从而增强其在免疫活性宿主中的可识别性。癌症免疫原性细胞死亡（ICD）的特征是濒死细胞释放膜结合型和可溶性信号分子，这些分子作为警报素激活免疫细胞。为了对ICD反应进行定量验证，我们利用微流控平台收集的数据，其中白细胞可通过特制的微通道桥向其靶细胞移动。在将来自健康供体的PBMCs（WT，野生型）与经或未经...

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。

复杂的疾病模型需要前沿工具，以提供具有生理和病理相关性的可操作见解，并揭示原本难以察觉的生物学过程。能够高度模拟体内环境的先进细胞检测技术正成为可视化和量化肿瘤与宿主之间双向相互作用的新方法，这些相互作用影响着癌症的进展。本文描述了两种多功能实验方案，可在微流控装置中重建高度可控的二维（2D）和三维（3D）共培养体系，以模拟肿瘤微环境（TME）在自然状态及治疗诱导的免疫监视条件下的复杂性。在第一部分中，我们提供了一种实验设置，通过明场延时显微镜监测贴壁肿瘤细胞与悬浮免疫细胞群体之间的相互作用。作为应用示例，我们分析了抗癌治疗（如诱导免疫原性癌细胞死亡的药物）对免疫细胞募集与活化的影响。在第二部分中，构建了具有竞争性布局的3D肿瘤-免疫微环境，并通过荧光成像在长达72小时的时间内监测免疫细胞的差异性浸润，以评估联合治疗策略的效果。在这两种实验体系中，均展示了图像处理步骤，用于提取多种免疫细胞参数（例如免疫细胞迁移、相互作用及其对治疗药物的响应）。这些简单而强大的方法可进一步优化，以模拟包含肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞亚群的异质性与可塑性，及其作为癌症演化驱动因素的相互作用所构成的TME复杂性。这些快速发展的技术与活细胞高内涵成像的兼容性将产生大量信息丰富的数据集，同时也带来新的挑战。事实上，“共培养/显微成像/高级数据分析”三者结合为精确的问题参数化提供了路径，有助于定制化治疗方案的开发。我们预期，未来将肿瘤-免疫芯片技术与人工智能相结合用于高通量数据处理，将在提升精准医学和个体化肿瘤学的预测能力与临床前工具效能方面迈出重要一步。

本方案提供了在微流控装置中进行可控的二维和三维共培养的实验设置，用于可视化和监测肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，并分析抗癌治疗的效果。该技术可实现实时、便捷地观察免疫细胞的募集与相互作用，适用于人源及患者来源的样本，并与大多数先进的显微镜技术兼容。演示该实验操作的人员为意大利高等卫生研究院肿瘤与分子医学系的博士生Francesco Noto，以及圣心天主教大学转化医学与外科学系的博士生Nicoleta Manduca和Esther Maccafeo。芯片需预先在洁净室中使用等离子清洗机或反应性离子刻蚀仪进行等离子活化处理。本实验采用小鼠脾细胞和一种肿瘤细胞系，以模拟文中所述的实验方案。在接种细胞悬液之前，从全部六个储液池中吸出培养基。随后，将重悬于10至50 µL生长培养基中的1 × 10⁵个肿瘤细胞缓慢加入左上方储液池和下方孔中。在右侧，轻轻将重悬于50 µL生长培养基中的1 × 10⁶个悬浮免疫细胞移液至两个孔中。所有细胞添加完毕后，向每个芯片的全部六个储液池中各加入 100 至 150 微升培养基，并检查细胞是否已正确分布于各个培养腔室内。将芯片孵育一小时，以使系统在开始延时成像前达到稳定状态。进行活细胞成像时，将含肿瘤免疫细胞的芯片培养板安装在显微镜载物台上。在显微镜软件界面（如 Incucyte 活细胞分析软件）中自定义采集工作流程设置。根据实验和所研究细胞类型的适当参数，选择观察视野、最佳帧率和时间持续时间。在适当的实验时间段内对细胞进行成像。使用预冷的枪头，将Matrigel用含有药物或药物组合的培养基稀释，为两种实验条件各准备两份等分试样。将悬浮于基质溶液中并用荧光染料标记的活细胞在冰上轻轻吹打混匀，以获得细胞的均匀分布。将芯片板置于冷却块或装有冰的篮子上，使用预冷的10微升移液枪头，缓慢将经药物处理的肿瘤细胞基质溶液注入左侧和右侧的凝胶加样口。轻轻施加压力，将基质溶液从通道的一侧推至另一侧。所有肿瘤细胞加载完毕后，将装置直立放入培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，待基质完全凝胶化，向全部六个储液池的培养基通道中各加入50微升培养基。在显微镜下检查聚合凝胶的完整性及肿瘤细胞的分布情况，然后将芯片放入培养箱中孵育，直至免疫细胞制备完成。孵育结束后，吸去每个孔中的培养基。将移液 tip 置于中间培养基通道的入口附近，用适中的压力轻轻注入 10 微升浓度为 10⁶ 的、用对比性荧光染料标记的免疫细胞。向四个侧通道的每个孔中注入 50 至 100 微升培养基，向顶部中央孔中注入 40 至 90 微升培养基，向底部中央孔中注入 50 至 100 微升培养基。当所有孔均加样完成后，使用显微镜确认免疫细胞的分布仍局限于中央腔室。然后小心地将装置放置于细胞培养孵育箱内的水平表面上，直至成像。为计算荧光标记的活免疫细胞浸润肿瘤区域的程度，需在特定感兴趣的时间点通过荧光显微镜对装置进行成像，并在显微镜成像软件（如 Nikon NIS-Elements）中设置适当的相机参数。同时，为标记的免疫细胞设置相应的参数。通过视频显微镜，可以追踪白细胞在微流控平台中经由适当构建的微通道桥向其靶细胞迁移的过程。在此追踪分析中，分别用死亡的多柔比星处理的癌细胞或活的磷酸盐缓冲液（PBS）处理的癌细胞刺激单个外周血单个核细胞（PBMCs）。系统自动生成了相关的趋化值和迁移图谱，结果显示，当免疫细胞与经多柔比星或PBS处理的乳腺癌细胞共加载时，其迁移模式存在差异。当PBMCs与凋亡的癌细胞接触时，它们会穿过微通道趋向于濒死和死亡的细胞，但不会向存活的未处理细胞迁移。在本分析中，采用了一种新型的3D免疫活性肿瘤模型，用于量化免疫细胞对表观遗传药物联合抗肿瘤治疗的募集反应。随后将红色染料标记的外周血单个核细胞（PBMCs）均匀分布至中央流体腔室中。接着比较两个肿瘤团块对PBMCs的趋化能力，在本实验中，PBMCs被显著募集至右侧微通道。对于3D模型，需在冰上将溶液与水凝胶及细胞混合，避免产生气泡和预聚合。缓慢注射，避免过度加压。根据所使用的基质调整聚合步骤。可实施活/死细胞检测及上清液中细胞因子分泌谱分析。可进行共聚焦成像的免疫荧光实验，以分类免疫亚型及检测活化与耗竭成熟相关的表达标志物。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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用于重建肿瘤微环境的微流控装置 体外

本视频展示了一种建立三维肿瘤球体与T细胞共培养的方法。首先制备含有肿瘤球体的琼脂糖微孔模具，随后加入T细胞。经过孵育后，该体系可在可控的三维环境中研究T细胞与肿瘤球体之间的相互作用。...

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本文介绍一种三维共培养方案，可用于研究多细胞相互作用以及细胞外基质对癌细胞行为的调控作用。在此实验模型中，将癌细胞培养在嵌有人大肠癌相关成纤维细胞的胶原凝胶上。...

三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。...

在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境

我们介绍了一种微流控芯片上的癌症模型，即"进化加速器"技术，该技术可在明确定义的环境条件下，在单细胞水平上对癌症动态进行长期、实时、定量的可控研究。该技术有望作为基础研究或临床前药物开发的体外模型。...

在微流控进化加速器上生成跨越癌细胞群体的异质性药物梯度以实现实时观察

该方法可同时评估三维球状体实验中的癌细胞侵袭和T细胞介导的细胞毒性。球状体在无支架的琼脂糖多微孔模具中生成。共培养及包埋于I型胶原基质均在同一装置内完成，从而可实时监测癌细胞的侵袭行为以及T细胞介导的细胞毒性效应。...

在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞毒性

本文详细介绍了一种简单、快速且可靠的多参数流式细胞术联合肿瘤芯片辅助的实验方案，用于监测和表征构成癌症-免疫循环的各个步骤。事实上，深入理解癌症细胞与免疫细胞之间的相互作用，对于破解肿瘤免疫机制、指导临床诊疗具有重要意义。...

体外共培养系统重现癌症-免疫循环

在此，我们介绍了利用胶原蛋白及胶原蛋白-琼脂糖基质在微生理系统中建立三维细胞培养的具体操作方案。这些方案支持肾近端小管细胞与肾细胞癌球状体的共培养，以模拟 体内...

利用微流控共培养健康与肿瘤肾上皮细胞模拟肾癌进展

本实验方案描述了一种实验工作流程，可实现 离体...

经预处理肿瘤细胞异基因共培养体系中人类T细胞活性的分析

了解微流控共培养模型技术，用于体外肿瘤微环境中免疫反应的实时可视化与动态监测。该方法支持二维和三维培养，适用于人源及患者来源样本，助力癌症免疫治疗研究。

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

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