Name: 用于生物标志物检测的电解质门控石墨烯场效应晶体管的开发与功能化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习开发电解质门控石墨烯场效应晶体管生物传感器，用于检测IgG生物标志物。该方法实现高选择性、高灵敏度且无标记的实时检测，适用于血液样本分析。

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实验在西弗吉尼亚大学进行。我们感谢西弗吉尼亚大学共享研究设施中心在器件制备和材料表征方面的支持。本工作由美国国家科学基金会资助，项目编号NSF1916894。

1. 石墨烯的化学气相沉积转移
<ol>
	<li>使用剪刀将铜基底上的石墨烯片裁剪成两半（2.5 cm × 5 cm）。用耐高温胶带固定石墨烯方片的四个角于旋涂仪垫圈上（见材料表）。 
	注意：购买的石墨烯尺寸为 5 cm × 5 cm（见材料表）。</li>
	<li>在石墨烯片上旋涂一层薄的 PMMA 495K A4（100–200 nm），先以 500 rpm 旋转 10 秒，再以 2000 rpm 旋转 50 秒。然后将样品在 150 °C 下烘烤 5 分钟。</li>
	<li>使用氧气等离子体（见材料表）在 30 W、15 sccm 条件下处理 5 分钟，去除石墨烯背面。</li>
	<li>将经等离子体处理的石墨烯方片裁剪为更小的尺寸（1 cm × 2 cm），用于器件制备。</li>
	<li>将预清洁的基底（SiO2）切割成约 2.5 cm × 2 cm 的小片。</li>
	<li>使用商用石墨烯蚀刻剂（氯化铁）蚀刻去除铜层（见材料表）。不要稀释蚀刻剂。将样品以铜面朝下、PMMA 面朝上的方式漂浮在液态蚀刻剂中。</li>
	<li>铜层蚀刻完成后，用经等离子体处理的基底缓慢提起石墨烯薄膜。</li>
	<li>将转移后的石墨烯在空气中干燥 2 小时，然后在 80 °C 下烘烤 15 分钟。</li>
	<li>按照以下步骤去除 PMMA：
	<ol>
		<li>在 70 °C 下用丙酮蒸气预处理样品。将 PMMA 面朝下，保持样品距丙酮蒸气上方约 2 cm 处 4 分钟。然后将样品浸入丙酮中 5 分钟。</li>
		<li>小心地用去离子水清洗样品，并在显微镜下观察转移后的石墨烯。最后用 N2 轻柔吹干样品。</li>
		<li>进行原子力显微镜（AFM）观察，确认石墨烯表面无 PMMA 残留。若图像中可见 PMMA 残留，则重复一次丙酮蒸气清洗和浸泡步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行拉曼光谱和原子力显微镜（AFM）表征，以确认石墨烯单层的转移情况并观察其表面特性（图 1A、B）。</li>
</ol>
2. 石墨烯场效应晶体管（GFET）的制备
<ol>
	<li>使用丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水（DI 水）清洗已转移石墨烯的基底，然后在热板上于 75 °C 烘烤 30 分钟（图 2A）。</li>
	<li>使用电子束蒸发仪30（见材料表），在石墨烯样品上沉积 5 nm 镍和 45 nm 金（图 2B）。</li>
	<li>使用掩模 A（补充图 1）进行第一次光刻30，以图形化电极（图 2C）。</li>
	<li>在样品上旋涂正性光刻胶（AZ 5214E，见材料表）（2000 rpm 旋涂 45 秒），并在 120 °C 下烘烤 1 分钟。</li>
	<li>将样品置于紫外泛光曝光系统中，在 200 mJ/cm2 条件下曝光约 10 秒。</li>
	<li>使用光刻胶显影液（AZ300 MIF，见材料表）显影约 2 分钟，然后用去离子水冲洗。</li>
	<li>将样品浸入金刻蚀液中刻蚀金层 10 秒；用去离子水冲洗，并将样品浸入丙酮中 10 分钟以去除残留的光刻胶层（图 2C）。</li>
	<li>使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗样品；在热板上于 75 °C 烘烤 30 分钟。然后使用掩模 B（补充图 1）进行第二次光刻，以图形化石墨烯通道。 
	注意：除掩模对准器中的紫外曝光系统外，其余工艺参数与第一次光刻相同（步骤 2.4–2.6）（图 2D）。</li>
	<li>将样品浸入 60 °C 的镍刻蚀液中刻蚀镍层 10 秒；用去离子水冲洗，并用 N2&#160;吹干（图 2D）。</li>
	<li>将样品放入等离子体灰化仪中，使用氧气等离子体（氧气流速 49 sccm，功率 100 W，时间 90 秒）去除暴露的石墨烯；随后将样品浸入丙酮中 10 分钟以去除光刻胶层（图 2E）。</li>
	<li>使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗样品；在热板上于 75 °C 烘烤 30 分钟，并使用掩模 C（补充图 1）进行第三次光刻，以图形化钝化光刻胶层，从而保护基底上层的石墨烯。除掩模对准器中的紫外曝光系统外，其余工艺参数与第一次光刻相同（步骤 2.4–2.6）（图 2F）。</li>
	<li>完成第三次光刻后，将样品在 60 °C 的镍刻蚀液中浸渍 10 秒以去除残留的镍层；然后用去离子水冲洗，并用 N2 吹干（图 2G）。最后，在热板上于 120 °C 烘烤 30 分钟（图 2H）。</li>
</ol>
3. 用于IgG检测的GFET功能化
<ol>
	<li>组装样品递送通道。
	<ol>
		<li>使用软光刻技术在 PDMS 中制备样品递送通道31。</li>
		<li>将石墨烯器件浸入 0.1 M 的 NaOH 溶液中 30 秒；用去离子水冲洗，并在器件表面保留一层薄水层，以辅助 PDMS 井的对准和键合。然后使用氧气等离子体活化 PDMS 井的表面。</li>
		<li>在显微镜下对准样品递送通道与石墨烯器件；将对准后的器件置于 60 °C 的烘箱中 3 小时，以完成键合。组装后的器件如图 3A所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对 GFET 进行功能化修饰。
	<ol>
		<li>使用 IgG 适体对石墨烯表面进行功能化修饰（参见材料表）。使用移液器从 PDMS 井中加载和移除每种试剂或缓冲液。示意图过程如图 4所示。 
		注：以下步骤均在室温下操作。</li>
		<li>用 DMSO 冲洗石墨烯表面三次后，加入 1-吡rene丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（PBASE，10 mM 溶于 DMSO，参见材料表），孵育 2 小时。</li>
		<li>用 DMSO 冲洗后，加入 5' 氨基修饰的 IgG 适体（20 µM 溶于 1x PBS），孵育 3 小时，再用 1x PBS 冲洗三次。</li>
		<li>在石墨烯表面加入牛血清白蛋白（BSA，10% w/v 溶于 1x PBS），孵育 1 小时，再用 1x PBS 冲洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. IgG 检测
<ol>
	<li>用 0.01x PBS 冲洗装置三次。将 PDMS 微腔中充满 0.01x PBS（检测缓冲液）（图 3A、B）。</li>
	<li>将电极连接至高性能参数分析仪（见材料表）。将源极接地，漏极和栅极分别连接至参数分析仪配备的源测量单元（SMU 1 和 SMU 2）（图 3C）。</li>
	<li>设置测量参数并启动采样过程。</li>
	<li>通过连续监测漏极电流来测试 EGGFET 对 IgG 的响应。将 IgG 溶解于不同浓度的 0.01x PBS 中，将溶液加入检测室，并持续监测漏极电流。保存数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何竞争利益或利益冲突需要披露。

购买的铜膜上化学气相沉积石墨烯需要裁剪至合适尺寸，以用于后续制备步骤。切割薄膜可能导致褶皱，需避免此现象。可参考制备步骤中提供的参数进行石墨烯的等离子体刻蚀，但使用不同仪器时这些数值可能需要调整。刻蚀后的样品必须密切监控和检查，以确保石墨烯完全被刻蚀。可采用多种预清洗方法清洁基底，例如在丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水中分别超声处理5分钟，用去离子水冲洗，并用氮气吹干或进行O2等离子体处理（300 W，流量约100 sccm，持续5分钟）。使用商用氯化铁铜刻蚀液时，铜的刻蚀速率约为1.25–1.67 微米/分钟。刻蚀过程需密切观察。刻蚀完成后，需用去离子水充分冲洗。
本方案中提到的丙酮清洗技术是最优的残留物清洗方法。等离子清洗有可能损伤单层石墨烯，因此对石墨烯层最友好的清洗技术是丙酮清洗。但去除PMMA残留同样至关重要，因为它会影响后续工艺。进行拉曼光谱分析和原子力显微镜（AFM）检测可以实时评估石墨烯的质量以及PMMA残留情况。本方案中使用的仪器和化学品非常关键，会直接影响所制备器件的质量，因此需要定期检查并更新仪器的性能状态和化学品的有效性。
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石墨烯及其衍生物已被研究并应用于诸多领域，包括电子学1,2、传感3,4,5、能量存储6,7以及光催化1,6,8。高质量、高均匀性且低缺陷的石墨烯的合成与制备，对于高性能和高灵敏度器件至关重要。自2009年化学气相沉积（CVD）技术发展以来，该方法展现出巨大前景，并已成为石墨烯制备技术中不可或缺的重要组成部分9,10,11,12,13。CVD石墨烯通常在金属基底上生长，随后为实际应用需要被转移至绝缘基底上14。近年来已有多种转移方法被用于CVD石墨烯的转移。其中，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）辅助转移法是目前应用最广泛的技术。该方法因其可实现大规模生产、成本较低以及转移后石墨烯质量较高，特别适用于工业应用14,15。该方法的关键在于彻底去除转移后残留的PMMA，因为残留物可能导致石墨烯电子性能下降14,15,16，影响生物传感器的灵敏度与性能17,18，并引起器件间显著的性能差异19。
在过去几十年中，基于纳米材料的生物传感器得到了广泛研究，包括硅纳米线（SiNW）、碳纳米管（CNT）和石墨烯20。由于石墨烯具有单原子层结构和独特的性质，表现出优异的电子特性、良好的生物相容性以及易于功能化的特点，使其成为开发生物传感器的理想材料14,21,22,23。由于场效应晶体管（FET）具有高灵敏度、标准构型以及成本低廉、适合大规模生产等优势21,24，相较于其他基于电子器件的生物传感设备，FET在便携式和即时检测（point-of-care）应用中更受青睐。电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）生物传感器即是上述FET的典型代表21,24。EGGFET能够检测多种目标分析物，如核酸25、蛋白质24,26、代谢物27以及其他具有生物学意义的分析物28。本文所述技术实现了化学气相沉积（CVD）石墨烯在无标记生物传感纳米电子器件中的应用，相较于其他生物传感设备，具有更高的灵敏度和精确的时间检测能力29。
本研究展示了一种开发EGGFET生物传感器并实现其生物标志物检测功能化的整体流程，包括将化学气相沉积（CVD）石墨烯转移至绝缘基底上，以及对转移后的石墨烯进行拉曼光谱和原子力显微镜（AFM）表征。此外，还讨论了EGGFET的制备及其与聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品输送井的集成、生物受体的功能化，以及通过加标回收实验成功检测血清中人免疫球蛋白G（IgG）的方法。

<table><tbody><tr><td>1-芘丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>457078-1G</td><td>功能化</td></tr><tr><td>Asylum MFP-3D 原子力显微镜</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>石墨烯表征</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ 300 MIF</td><td>光刻胶显影液</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ 300 MIF</td><td>光刻胶</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>810014</td><td>封闭</td></tr><tr><td>Branson 1210 超声波清洗机</td><td>SONITEK</td><td></td><td>样品清洗</td></tr><tr><td>铜刻蚀液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>667528-500ML</td><td>去除铜膜以释放石墨烯</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>VWR</td><td>97063-136</td><td>功能化</td></tr><tr><td>一次性活检打孔器，Integra Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-144</td><td>在PDMS中创建样品井</td></tr><tr><td>金刻蚀液</td><td>Gold Etch, TFA, Transene</td><td>658148</td><td>刻蚀</td></tr><tr><td>石墨烯</td><td>Graphene supermarket</td><td>2&quot; x 2&quot; 片材</td><td>器件的生物传感元件</td></tr><tr><td>IgG 适配体</td><td>Base Pair Biotechnologies</td><td>定制</td><td>生物受体</td></tr><tr><td>Keithley 4200A-SCS 参数分析仪</td><td>Tektronix</td><td></td><td>测量与检测</td></tr><tr><td>KMG CR-6</td><td>KMG chemicals</td><td>64216</td><td>铬刻蚀液</td></tr><tr><td>Kurt J. Lesker 电子束蒸发仪</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>金属沉积</td></tr><tr><td>Laurell Technologies 400 旋涂机</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td>薄膜涂覆</td></tr><tr><td>March PX-250 等离子体灰化仪</td><td>March Instruments</td><td></td><td>样品清洗</td></tr><tr><td>镍刻蚀液</td><td>Nickel Etchant, TFB, Transene</td><td>600016000</td><td>刻蚀液</td></tr><tr><td>OAI 漫曝光系统</td><td>OAI</td><td></td><td>光刻</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806552-500ML</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>PMMA 495K A4</td><td>MicroChemicals</td><td>PMMA 495K A4</td><td>辅助石墨烯转移的光刻胶</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Sylgard 184</td><td>样品输送井</td></tr><tr><td>Renishaw InVia 拉曼显微镜</td><td>Renishaw</td><td></td><td>石墨烯表征</td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>功能化</td></tr><tr><td>Suss Microtech MA6 掩模对准仪</td><td>Suss MicroTec</td><td></td><td>光刻</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Cimarec 加热板</td><td>Thermo Scientific</td><td>SP131635</td><td>样品与器件烘烤</td></tr></tbody></table>

用于生物标志物检测的电解质门控石墨烯场效应晶体管的开发与功能化

Development and Functionalization of Electrolyte-Gated Graphene Field-Effect Transistor for Biomarker Detection

在本研究中，石墨烯及其衍生物已被探索并应用于诸多领域，包括电子学、传感、能量存储和光催化。高质量、高均匀性且低缺陷石墨烯的合成与制备，对于高性能和高灵敏度器件至关重要。在众多合成方法中，化学气相沉积法（CVD）被认为是制备石墨烯的领先方法，可控制石墨烯层数并获得高质量石墨烯。CVD生长的石墨烯需要从其生长所用的金属基底转移至&#160;绝缘基底，以实现实际应用。然而，将石墨烯完整地分离并转移至新基底上，同时不破坏或影响其结构与性能，以获得均匀的单层，仍具挑战性。此外，电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）因其高灵敏度和标准器件结构，在多种生物分子检测中展现出广泛应用前景。本文展示了聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）辅助的石墨烯转移方法、石墨烯场效应晶体管（GFET）的制备以及生物标志物免疫球蛋白G（IgG）的检测。采用拉曼光谱和原子力显微镜对转移后的石墨烯进行表征。该方法被证明是一种实用的策略，可在保持石墨烯晶格结构完整的前提下，将洁净且无残留的石墨烯转移至用于电子或生物传感应用的绝缘基底上。

代表性结果分别展示了通过拉曼光谱和原子力显微镜（AFM）表征的转移后化学气相沉积（CVD）石墨烯。拉曼成像中的G峰和2D峰提供了有关转移单层石墨烯存在性及其质量的全面信息32（图1）。如图2所示，采用标准光刻工艺30,31制备石墨烯场效应晶体管（GFET）器件。图3展示了制备完成的GFET器件，其上组装了聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品进样井以及实验装置。PDMS以10:1的质量比混合后倒入培养皿中，随后将含有PDMS混合物的整个培养皿置于60 °C烘箱中加热3小时。固化后的PDMS从培养皿上剥离，并裁剪成一个立方体（1 cm × 1 cm × 1 cm）。然后使用打孔器在PDMS立方体上打出一个直径为6 mm的孔作为进样井。
用于IgG检测的...

本实验方案展示了电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）生物传感器的构建及其在生物标志物免疫球蛋白G（IgG）检测中的应用。

在本研究中，石墨烯及其衍生物已被探索并应用于诸多领域，包括电子学、传感、能量存储等。

该方法能有效去除PMMA残留物，同时保护底层的石墨烯晶格。功能器件在检测血清中的IgG抗体时表现出一致的结果。此外，该方案可确保将化学气相沉积（CVD）石墨烯应用于实时、无标记的生物传感装置中。这些步骤相当简单，只需经过最少的培训即可完成。该设备与其他生物传感器相比，具有高选择性、高灵敏度和实时检测的优势。首先使用手术刀将铜基底上的石墨烯片从中间切割成两半。然后使用耐热胶带将石墨烯方片的四个角固定在旋转涂布仪垫圈上。将石墨烯的方形薄片旋涂一层100至200纳米厚的PMMA 495K A4，先以500转/分钟的转速旋转10秒，然后以2,000转/分钟的转速旋转50秒。随后，在150°C下烘烤样品5分钟。使用氧气等离子体以30瓦功率、15标准立方厘米/分钟的气体流速处理5分钟，去除石墨烯的背面。将等离子体处理过的石墨烯方片切割成宽度为一厘米、高度为两厘米的尺寸，用于器件制备。将预先清洗过的二氧化硅基底切割成宽度约为四厘米、高度为两厘米的小片。使用未经稀释的三氯化铁石墨烯刻蚀剂去除铜层。将样品以铜面朝下、PMMA面朝上的方式漂浮在液态刻蚀剂上。铜刻蚀完成后，使用经等离子体处理的基底缓慢提起石墨烯薄膜。将转移后的石墨烯薄膜在空气中干燥两小时，然后在加热板上烘烤。为去除PMMA，首先将样品置于70摄氏度的丙酮蒸气中加热，使样品PMMA面朝下，距离丙酮蒸气约2厘米，持续4分钟。随后，将样品浸入丙酮中5分钟。用去离子水小心清洗样品。最后，用氮气轻轻吹干样品。使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗带有转移石墨烯的基底。然后，将基底置于加热板上，在75°C下烘烤30分钟。使用电子束蒸发仪，在石墨烯样品上分别沉积厚度为5纳米和45纳米的镍和金。使用掩模A进行第一次光刻工艺，以图形化电极。以每分钟2,000转的速度在样品上旋涂AZ 5214E正性光刻胶，持续45秒，并在120摄氏度下烘烤样品1分钟。将样品放入紫外泛光曝光系统中，在200毫焦耳/平方厘米条件下曝光约10秒。使用光刻胶显影液AZ 300 MIF显影约2分钟，然后用去离子水冲洗。将样品浸入金刻蚀液中刻蚀金层10秒，用去离子水冲洗后，再浸入丙酮中10分钟以去除残留的光刻胶层。使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗样品，随后在75摄氏度的热板上烘烤30分钟。然后使用掩模B进行第二次光刻工艺，以图形化石墨烯通道。将样品浸入60摄氏度的镍刻蚀液中，刻蚀镍层10秒。用去离子水冲洗，并用氮气吹干。将样品放入等离子体刻蚀仪中，利用氧气等离子体去除暴露的石墨烯。随后，将样品浸入丙酮中10分钟，以去除光刻胶层。使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗样品，并在75摄氏度的热板上烘烤30分钟。采用掩模C进行第三次光刻工艺，以图形化钝化光刻胶层，保护基底上下方的石墨烯。使用与之前相同的工艺参数，包括旋涂正性光刻胶、固化样品以及使用光刻胶显影液进行显影。随后，将样品浸入镍刻蚀液中，在 60 摄氏度下处理 10 秒，以去除残留的镍层，然后用去离子水冲洗，并用氮气吹干。最后，将样品置于加热板上，在 120 摄氏度下烘烤 30 分钟。代表性结果展示了通过拉曼光谱和原子力显微镜表征的转移后化学气相沉积石墨烯。拉曼图像中的G峰和二维峰提供了有关转移单层石墨烯存在性及其质量的全面信息。该图显示了集成有标准银/氯化银参比电极以及用于容纳样品的聚二甲基硅氧烷小室的石墨烯场效应晶体管生物传感器。此外，石墨烯沟道的放大视图展示了其与源极电极接地端、漏极以及栅极电极与源极的连接情况。PBASE是一种广泛用于石墨烯功能化的试剂，可通过π-π相互作用吸附在石墨烯表面，且不会破坏石墨烯的电学性质。5'端氨基修饰的IgG适配体通过PBASE中的活性羟基-6-肉桂酰酯与IgG适配体5'端氨基之间的酰胺键连接，与PBASE共价偶联。在用单倍浓度PBS冲洗器件后，采用牛血清白蛋白孵育以封闭剩余未偶联的位点。该图展示了在不同电解质条件下对IgG的检测结果。石墨烯的质量是决定该器件最佳性能的关键。因此，在等离子体刻蚀过程中，必须确保等离子体不会损伤石墨烯的有用区域。同时，必须彻底清除PMMA残留物，以获得洁净的石墨烯表面。该功能器件在检测人IgG抗体时表现出稳定的结果，因此该实验流程可作为参考，用于构建基于其他纳米材料的器件，以研究界面相互作用和生物传感。

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Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

本文介绍了一种生物制造方法：在偏置电极存在下，沉积具有刺激响应性的多糖，以制备可与细胞或蛋白质功能化的生物相容性薄膜。我们展示了一种可在实验台操作的薄膜制备策略，以及这些薄膜在构建用于芯片实验室应用的交互式生物功能化表面中的基本用途。...

通过生物制造技术连接生物-电子界面

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基于石墨烯生物传感器的场效应生物传感技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

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用于化学与生物传感应用的硅纳米线场效应晶体管的制备

采用低成本干膜光刻胶技术设计并制备了一种微流控生物传感器平台，用于多种分析物的快速、高灵敏度定量检测。该一次性使用系统通过停流技术实现对芯片上固定的酶联检测方法进行电化学读出。...

基于干膜光刻胶的电化学微流控生物传感器平台：器件制备、芯片上检测构建与系统操作

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体外 基于微米级有机电荷调控场效应晶体管阵列的多参数细胞分析

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利用场效应生物传感技术探究分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用

本方案描述了一种基于氧化铟锡（ITO）的一体式离子敏感场效应晶体管（ISFET）的制备方法，该器件可通过简短且简单的工艺（约半天时间）构建为溶液门控场效应晶体管传感器（例如pH传感器）。这种一体式ITO-ISFET也可应用于生物传感。...

基于溶液门控氧化铟锡一体化晶体管的制备及其在高灵敏生物传感中的应用

学习开发电解质门控石墨烯场效应晶体管生物传感器，用于检测IgG生物标志物。该方法实现高选择性、高灵敏度且无标记的实时检测，适用于血液样本分析。

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