使用场效应生物传感技术探索分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用

场效应生物传感（FEB）是一种用于检测生物分子相互作用的无标记技术。它测量通过石墨烯生物传感器的电流，结合目标被固定到该传感器。FEB技术用于评估Hsp90和Cdc37之间的生物分子相互作用，并检测到两种蛋白质之间的强相互作用。

FEB是一个无标签且具有成本效益的____________互动检测平台，可提供快速准确的测量。该方法提供了已知或未知相互作用的验证，以及测试生物分子相互作用的潜在抑制剂的简单方法。FEB的主要优点是其自动化，用户友好的软件，通过开放式的手动移液平台在整个实验过程中锁定用户，使用户能够在很少甚至不需要培训的情况下工作。

FEB技术还在制药，小分子，肽和蛋白质的生物分子分析，通过将体外生物活性容易转化为体内功效的药物验证等多个领域提供应用。作为初学者，您可能会面临选择正确分析物浓度以优化实验以获得可靠KD值的挑战。我们建议注意芯片功能化过程和适当的缓冲液更换。

首先通过上下移液混合等体积的EDC和磺基NHS溶液。将公司提供的生物传感器芯片放在装有盖子的玻璃培养皿中。建议芯片激活中涉及的所有功能化步骤都在培养皿内完成。

将50微升单摩尔MES缓冲液涂在生物传感器芯片上。在室温下孵育一分钟。然后，吸出缓冲液并立即将50微升EDC磺基-NHS溶液施加到传感器芯片上。

盖上培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸出EDC磺基NHS溶液，并施加50微升的单摩尔MES缓冲液。吸出MES缓冲液，并用50微升1X PBS冲洗芯片两次。

从芯片中吸取PBS并加入目标分子Hsp90.盖上玻璃培养皿并在室温下孵育30分钟。然后，吸出含有目标分子的溶液，并用50微升1X PBS冲洗三次。

从芯片中吸出1X PBS溶液，并加入50微升淬火一种溶液。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸取淬火一溶液，加入50微升淬火二溶液。

盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。之后，从芯片中吸出淬火两个溶液，并使用50微升1X PBS冲洗芯片五次，留下传感器上的最后一个PBS液滴。在所需浓度范围内制备Cdc37的分析物稀释系列。

将实验设计为包括至少八种不同的分析物浓度以获得可靠的解离常数或KD值，并在用于校准和靶蛋白的同一缓冲液中制备这些不同的稀释液。将芯片小心地放在仪器上。确保软件已打开且 LED 指示灯变为绿色。

接下来，按自动化软件上的"运行实验"模块，然后选择10个具有再生或任何其他所需协议的点。填写详细信息，例如操作员姓名、实验名称、日期、再生缓冲液、固定目标和溶液中的分析物。按软件上显示的"开始实验"按钮，然后按照自动化软件显示的说明进行操作。

要执行仪器校准，请从芯片中吸取剩余的PBS溶液，并施加50微升校准缓冲液。按"继续"按钮并等待五分钟，直到校准步骤完成。该软件显示为校准步骤确定的端点，并发出警告警报以进行跟进。

接下来，通过从芯片中吸取校准缓冲液并施加50微升最低分析物浓度来执行分析物关联。按"继续"按钮并等待五分钟，直到关联步骤完成。软件显示关联步骤的终点，并显示警告警报以继续。

要进行分析物解离，请从芯片中吸取分析物溶液并施加50微升解离缓冲液。按继续按钮。解离步骤持续时间后，软件将显示解离步骤的端点，并发出警告警报。

接下来，通过从芯片中吸取解离溶液并施加50微升再生缓冲液来执行芯片再生。然后，按"继续"按钮。再生步骤通常需要大约 30 秒才能完成。

之后，软件显示再生步骤的终点，并发出警告警报以进行跟进。最后，要洗涤芯片，从芯片中吸取再生溶液并施加50微升的洗涤缓冲液。从芯片中吸出溶液并重复五次。

将洗涤缓冲液的最后一滴留在芯片上。然后，按"继续"按钮并等待30秒，直到软件显示屏中的洗涤步骤持续时间结束。对使用的每种分析物浓度重复上述步骤。

校准、分析物关联、解离、再生和洗涤五次的五个步骤构成一个循环。在实验结束时按自动分析软件中的分析按钮。将出现一个包含所有实验点的显示窗口。

确保用于规定方案的分析物浓度是正确的。按"运行分析"按钮可自动生成 KD 值。该软件通过将分析物浓度与相应的I响应绘制在一起来生成山丘拟合图，从中计算平衡处的解离常数。

将目标蛋白Hsp90固定到芯片上，在第一次实验中，制备了10浓度的分析物蛋白Cdc37，范围从25纳摩尔到5， 000纳摩尔。此处显示了从实验一生成的数据文件。实时监测的实验数据如图所示。

Y轴对应于生物传感器单元中的I响应，X轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。此处显示的图形图像表示从自动分析软件生成的坡道拟合图。Y轴对应于生物传感器单元中的I响应，X轴对应于实验中的不同分析物浓度。

此处显示的图形图像表示使用统计分析软件生成的关联图。Y轴对应于关联阶段结束时的I响应，X轴对应于分析物Cdc37的不同浓度。在实验二中，使用了一组从0.4纳摩尔到200纳摩尔的不同浓度，生成的数据文件如下所示。

图形图像表示Hsp90和Cdc37相互作用的ITC温度图。这里显示的是由于将Cdc37连续注射到298.15开尔文的Hsp90中获得的相应热演化曲线。这里使用的差分功率是时间的函数。

此图中的集成数据点指定了相应的归一化热与 Hsp90 与 Cdc37 的穆勒比值。这里使用的开放式移液方法要求用户对手动移液有基本的掌握，确保不要用尖端触摸生物传感器。步进计时的再现性完全取决于用户。

一旦研究人员表征了两种生物分子之间的相互作用，我们就可以通过使用FEB系统设计针对特定生物分子相互作用的潜在抑制剂或调节剂来进行筛选实验。该程序可用于鉴定，验证和量化蛋白质以及小分子（包括药物和肽）之间的已知和新颖的相互作用。