Name: 使用场效应生物传感技术探索分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 探索场效应生物传感技术用于检测Hsp90与Cdc37蛋白相互作用的实验方法。该技术无需标记即可快速准确测量生物分子结合，为药物开发和验证提供有效工具。

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本研究获得了美国-以色列两国科学基金会（BSF）向 S.K.S. 和 N.Q. 提供的资助。

注意：本研究中使用的重组蛋白 Hsp90 和 Cdc37 为商业获得（见材料表）。
1. 芯片活化
注意：实验中使用的所有材料均列在材料表中。所有配制的溶液均需通过无菌的 0.2 μm 滤膜过滤。
<ol>
	<li>在15 mL离心管中，将2 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）加入2.5 mL 1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液（pH = 6.0）中，配制EDC溶液。另取一个15 mL离心管，将6 mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠（sulfo-NHS）加入2.5 mL 1 M MES缓冲液（pH = 6.0）中，配制sulfo-NHS溶液。&#8239;将上述两种溶液分别分装50 µL至独立离心管中，于-20 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>用移液器吸取等体积的EDC溶液和sulfo-NHS溶液（50 µL EDC + 50 µL sulfo-NHS），上下吹打混匀（切勿涡旋混合）。 
	注意：&#8239;EDC/sulfo-NHS混合溶液必须在30分钟内使用，以确保有效的交联反应，实现芯片的正确功能化。</li>
	<li>将厂商提供的生物传感器芯片（5.7 cm × 2.4 cm；参见材料表）放入带盖玻璃培养皿中。建议所有芯片活化相关的功能化步骤均在该培养皿中进行。向生物传感器芯片表面加入50 µL 1 M MES缓冲液（pH = 6.0），室温孵育1分钟，随后吸除缓冲液。</li>
	<li>立即向传感器芯片表面加入50 µL&#8239;EDC/sulfo-NHS溶液。&#8239;盖上培养皿，室温孵育15分钟&#8239;。&#8239;随后吸除芯片上的EDC/sulfo-NHS溶液。</li>
	<li>用50 µL 1 M MES缓冲液（pH = 6.0）冲洗芯片一次，随后吸除MES缓冲液。</li>
</ol>
2. 目标蛋白的固定
<ol>
	<li>用缓冲液冲洗芯片 2 次&#8239;50 µL 的 1x PBS（pH = 7.4）。从芯片中吸除 PBS，然后加入&#8239;靶分子，Hsp90（50 µL；500&#8239;nM 
	注意： &#8239;缓冲液不匹配可能会毁掉整个实验；因此，实验前必须确保目标分子所处的缓冲液与校准所用的缓冲液相同（例如，&#160;1× PBS（pH = 7.4）。如需要，实验前可进行过夜透析以更换缓冲液。本实验中，重组蛋白Hsp90和Cdc37均在1× PBS（pH = 7.4）中进行过夜透析（参见 材料表在4°C下通过适当的缓冲液置换进行操作。目标物质（本例中为Hsp90）的浓度可能因不同的实验方案及目标物质的性质（蛋白质/多肽/配体）而有所变化。</li>
	<li>盖上玻璃培养皿，室温孵育30分钟。吸除含有目标分子的溶液，用缓冲液洗涤3次&#8239;50 µL 的 1x PBS（pH = 7.4）。从芯片中吸除 1x PBS（pH = 7.4）溶液。</li>
	<li>添加&#8239;向芯片中加入50 µL淬灭液1（3.9 mM 氨基-PEG5-醇溶于1×PBS（pH = 7.4）中）溶液。&#8239;盖上玻璃培养皿&#8239;室温孵育15分钟。从芯片中吸除Quench 1溶液。</li>
	<li>添加&#8239;向芯片中加入50 µL淬灭液2（1 M乙醇胺（pH = 8.5）），并用玻璃培养皿盖住&#8239;室温孵育15分钟。从芯片上吸除Quench 2溶液，用50 µL 1×PBS冲洗芯片5次，最后一次保留PBS液滴在传感器上。</li>
</ol>
3. 准备分析物样品
<ol>
	<li>在所需浓度范围内配制Cdc37的分析物稀释系列。在第一次实验中，使用的浓度如下：25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM、1,000 nM、2,000 nM、3,000 nM 和 5,000 nM。在第二次实验中，使用了另一组浓度，范围从 0.4 nM 到 200 nM。</li>
	<li>设计实验时应包含至少八个不同的分析物浓度，以获得可靠的 KD 值。用与校准品和靶蛋白相同的缓冲液配制分析物蛋白的不同稀释液；此处为 1× PBS（pH = 7.4）。</li>
</ol>
4. 将活化的生物传感器芯片装入FEB装置
注意：FEB 设备由一个带有 LED 指示灯的读数仪和一个用于插入生物传感器芯片的卡盒组成。
<ol>
	<li>靶蛋白固定后，将活化芯片插入与设备相连的卡盒中 通过 USB 连接到计算机。芯片插入后，读取器上的绿色 LED 指示灯将亮起，表明 FEB 装置已准备就绪，可进行实验。安装自动化软件（参见 材料表由公司提供的、连接在计算机上的FEB设备，用于逐步监控实验过程，具体操作如下所述。</li>
</ol>
5. 运行实验
<ol>
	<li>在自动化软件中点击Run Experiment 模块，并选择10 Points with Regeneration或其他所需方案。填写以下信息：&#8239;操作者姓名、实验&#8239;名称、日期（例如：Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021）；再生缓冲液（例如：PBS缓冲液）；固定化靶标（例如：Hsp90）；溶液中的分析物（例如：Cdc37）。详见Supplementary Figure S1。</li>
	<li>点击软件界面上显示的Begin the Experiment按钮，并按照自动化软件提示的以下步骤进行操作。 
	注意：该软件完全自动化，操作界面友好，可全程逐步引导用户完成实验。在实验的每一步骤中，屏幕上将弹出窗口提示下一步操作。在整个实验过程中，软件将依次提供针对每个分析物浓度的重复步骤说明，包括校准、分析物结合、解离、再生和清洗（5次）。</li>
	<li>执行仪器校准。操作时，从芯片中吸出残留的PBS溶液，并加入50 µL校准缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。点击Continue 按钮，等待5分钟直至校准步骤完成。软件将显示校准步骤的终点时间（5分钟），并发出警报提示用户继续操作。</li>
	<li>接下来进行分析物结合。操作时，从芯片中吸出校准缓冲液，并加入50 µL最低浓度的分析物溶液（25 nM Cdc37）。点击Continue 按钮，等待5分钟直至结合步骤完成。软件将显示结合步骤的终点时间（5分钟），并发出警报提示用户继续操作。</li>
	<li>执行分析物解离。操作时，从芯片中吸出分析物溶液，并加入50 µL解离缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。点击Continue 按钮，等待5分钟直至解离步骤持续时间（5分钟）结束。软件将显示解离步骤的终点时间（5分钟），并发出警报提示用户继续操作。</li>
	<li>接下来进行芯片再生。从芯片中吸出解离溶液，并加入50 µL再生缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。点击Continue 按钮，等待30秒直至再生步骤持续时间（30秒）结束。软件将显示再生步骤的终点时间（30秒），并发出警报提示用户继续操作。</li>
	<li>最后清洗芯片。从芯片中吸出再生溶液，并向芯片中加入50 µL清洗缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。吸出溶液后重复此步骤5次。最后一次清洗后，将最后一滴清洗缓冲液保留在芯片上，点击Continue 按钮，等待30秒，直至软件界面显示清洗步骤持续时间结束。 
	&#8203;注意：软件将显示清洗步骤的终点时间（30秒），并发出警报提示用户进入实验的下一个循环。</li>
	<li>对所使用的每种分析物浓度重复上述步骤；校准、分析物结合、解离、再生和清洗（5次）五个步骤构成一个循环。本实验中，我们针对10种分析物浓度（范围从25 nM到5,000 nM或0.4 nM到200 nM）进行了10个循环（图2）。</li>
</ol>
6. 分析
<ol>
	<li>实验结束后，点击自动分析软件顶部显示的分析按钮。此时将出现一个包含所有实验数据点的显示窗口。在该窗口中，确保所用分析物浓度与规定方案中的浓度一致。</li>
	<li>点击运行分析按钮，以自动生成 KD 值。软件通过将分析物浓度与相应的 I-响应值作图，生成Hill拟合曲线，并据此计算平衡状态下的解离常数 KD 值。</li>
	<li>使用以下所述的数据审查/导出软件，将原始数据导出，以便在其他统计分析软件中进行分析。
	<ol>
		<li>将实验结束时自动生成的 R1R 文件（例如&#160;Hsp90 + Cdc37 14.03.2021）复制到桌面上的新文件夹中。打开公司提供的数据审查/导出软件（参见补充图 S2A）。</li>
		<li>在数据审查/导出软件的主界面，点击数据处理 &#62; 处理 R1R 文件 &#62; 确定。</li>
		<li>选择步骤 6.3.1 中在桌面创建的包含 R1R 文件的文件夹，然后点击确定按钮。此操作将创建原始 R1R 数据的副本，以便在不覆盖原始文件的前提下进行数据审查和编辑。</li>
		<li>点击数据审查/导出软件主界面上的数据处理图标，然后点击加载已处理的 R1R 文件 &#62; 确定。选择步骤 6.3.1 中创建的、包含已处理 R1R 文件的同一文件夹，点击确定。此时，包含实验文件的文件夹已准备就绪，可供审查。</li>
		<li>在数据审查/导出软件的主界面，点击数据分析，然后选择校准 &#62; 校准已编辑的 R1R 文件 &#62; 确定（参见补充图 S2B）。此步骤将根据首次校准步骤对所有数据点进行校准，以建立基线。</li>
		<li>在数据审查/导出软件的主界面，点击数据分析，然后选择审查和编辑 R1R 文件 &#62; 确定。审查数据点，使用删除/添加步骤按钮删除或添加步骤。确保所有步骤位置正确，例如校准步骤位于基线上，结合步骤位于峰值处（参见补充图 S3），然后点击保存按钮以保存所有修改。</li>
		<li>在数据审查/导出软件的主界面，点击数据分析，然后选择分析/绘制数据，选择要导出的步骤（参见补充图 S4）。在导出数据前，将每个结合步骤（例如&#160;步骤 2、步骤 7 等）减去校准步骤（例如步骤 1、步骤 6 等）后添加至导出列表中。</li>
		<li>点击导出此数据。软件将生成一个电子表格文件，其中包含来自每个晶体管的每个分析物浓度数据点的 I-响应值（如果所有晶体管均正常工作，则每个浓度点将有三个不同的 I-响应值）。使用此电子表格文件在统计软件中进一步分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开统计分析软件，创建一个包含三个 Y 值的 XY 表格，然后点击创建。该表格的数据（X、Y 值）来自步骤 6.3.8 中生成的电子表格文件。X 轴对应分析物浓度（根据所用浓度而定），三个 Y 值对应从公司提供的数据审查/导出软件中获得的 I-响应值。</li>
	<li>点击分析此数据，选择XY 分析 &#62; 非线性回归（曲线拟合） &#62; 结合饱和度 &#62; 单一位点 &#62; 总量。软件将自动分析数据，生成 KD 值，并绘制数据点的图表。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

本研究评估了使用FEB技术（一种实时动力学表征方法）来确定Hsp90与Cdc37之间生物分子相互作用的可行性。初步探索性实验（第一次实验）表明，选择合适的分析物浓度是实验的关键环节，实验设计应包含高于和低于KD值的浓度点，这些值是基于文献中已有数据预测得出的。
然而，如果对相互作用尚无初步了解，我们建议设计一个预实验，包含较宽浓度范围的多个浓度点，包括低浓度范围（0.08 nM、0.16 nM、0.4 nM、2 nM）和高浓度范围（1,000 nM、2,500 nM、5,000 nM）。预实验可对 KD 值进行粗略估计，并有助于规划后续实验，选择合适的浓度范围以获得准确的 KD 值。FEB 系统提供了一个可编辑的实验方案功能，用户可自由选择实验中的浓度点数量。
根据我们的经验，FEB 方案中最关键的步骤如下：目标蛋白和分析物缓冲液应与校准缓冲液相同。即使微小的缓冲液差异也可能导致 I-响应波动，从而产生不可靠的结果。因此，我们建议通过适当的缓冲液置换进行过夜透析...

生物分子相互作用： 
蛋白质是生物体的重要组成部分，参与多种分子通路，如细胞代谢、细胞结构、细胞信号传导、免疫反应、细胞黏附等。尽管某些蛋白质可独立发挥其功能，但大多数蛋白质通过结合界面与其他蛋白质相互作用，以协调正常的生物学活性1。
生物分子相互作用主要可根据所涉及蛋白质的不同结构和功能特征进行分类2，例如基于蛋白质表面、复合物稳定性或相互作用的持续性3。鉴定关键蛋白质及其在生物分子相互作用中的作用，对于在分子水平上理解生化机制至关重要4。目前已有多种方法用于检测这些相互作用5：in vitro6、in silico7、活细胞内8、ex vivo9以及in vivo10，每种方法均有其优势与局限性。
的 体内 使用整个动物作为实验工具进行检测11，以及 t离体 在受控的外部环境中，通过尽量减少对自然条件的改变，对组织提取物或完整器官（如心脏、脑、肝脏）进行检测。最常见的应用是 体内 和 离体 研究旨在通过确保潜在药理学制剂的整体安全性和有效性，评估其在人体试验前的药代动力学、药效动力学及毒性作用。12.
生物分子相互作用也可以在活细胞内被检测到。对活细胞进行成像使我们能够观察特定生化通路中动态发生的相互作用过程13。此外，诸如生物发光或荧光共振能量转移等检测技术，可提供这些相互作用在细胞内发生的位置和时间信息14。尽管在活细胞中进行检测能够提供关键的生物学细节，但这些检测方法依赖于光学系统和标记物，可能无法真实反映天然的生物学状态；同时，与体外（in vitro）方法相比，这些技术的可控性较低，且需要专门的技术 expertise 才能实施15。
计算机模拟（in silico）计算方法主要用于体外（in vitro）实验前对靶分子进行大规模筛选。计算预测方法、基于计算机的数据库、分子对接、定量构效关系以及其他分子动力学模拟方法均属于成熟的in silico工具16。与繁琐的实验技术相比，in silico工具能够以高灵敏度快速进行预测，但在预测性能的准确性方面有所降低17。
体外 在标准生物环境之外，利用微生物或生物分子进行检测。通过以下方式展示生物分子相互作用： 体外 方法对于理解蛋白质功能以及细胞复杂功能网络背后的生物学机制至关重要。应根据蛋白质的内在特性、动力学参数以及相互作用的方式和强度来选择合适的检测方法。18,19.
Hsp90/Cdc37 相互作用： 
连接 Hsp90 和 Cdc37 的分子伴侣-激酶通路是肿瘤生物学中一个有前景的治疗靶点20。Hsp90 在细胞周期调控、蛋白质组装、细胞存活和信号转导通路中发挥核心作用。依赖 Hsp90 发挥功能的蛋白质通过共伴侣蛋白（如 Cdc37）递送至 Hsp90 并形成复合物。Hsp90/Cdc37 复合物调控大多数蛋白激酶的折叠，并作为多种细胞内信号网络的枢纽21。由于其在多种恶性肿瘤（包括急性髓性白血病、多发性骨髓瘤和肝细胞癌）中表达升高，因此成为一个有前景的抗肿瘤靶点22,23。
常用方法 体外 生物分子相互作用检测技术 
共免疫沉淀（co-IP）是一种依赖抗原-抗体特异性的技术，用于鉴定具有生物学意义的相互作用24该方法的主要缺点是无法检测低亲和力相互作用及动力学参数24生物物理方法（如等温滴定 calorimetry（ITC）、表面等离子共振（SPR）、生物膜干涉技术（BLI）和 FEB 技术）是测定动力学参数的首选方法。
等温滴定量热法（ITC）是一种基于结合能测定并结合完整热力学分析来表征生物分子相互作用的生物物理检测方法25。ITC的主要优势在于无需对目标蛋白进行标记或固定。ITC面临的主要困难包括单次实验需要较高浓度的目标蛋白，以及由于结合焓较小而难以分析非共价复合物26。表面等离子体共振（SPR）和生物膜干涉技术（BLI）均为无需标记的生物物理技术，其原理是将目标分子固定在传感器表面，随后使分析物依次流经固定化的目标分子27,28。在SPR中，通过检测生物分子相互作用过程中折射率的变化来获取信号27；而在BLI中，则实时记录反射光干涉的变化，表现为波长随时间的变化曲线28。SPR和BLI均具有高特异性、高灵敏度和良好检测能力等共同优点29。在这两种方法中，目标蛋白均需固定于生物传感器表面，因此可能导致目标蛋白天然构象的部分丧失，从而难以区分特异性与非特异性相互作用30。BLI使用昂贵的一次性光纤生物传感器来固定目标分子，因此是一种成本较高的技术31。与这些成熟的生物分子检测工具相比，FEB技术能够在实时检测中利用低纳摩尔浓度实现生物分子的可靠、无标记检测，并提供动力学表征。此外，FEB技术克服了ITC中存在的气泡问题，且相较于SPR或BLI更具成本效益。
基于场效应晶体管（FET）的生物传感器是检测生物分子相互作用的一个新兴领域，具有多种生物医学应用前景。在FET系统中，靶标分子被固定在生物传感器芯片上，通过电导率的变化来检测分子间的相互作用32。在高效电子生物传感器的开发过程中，需要考虑的一个关键特性是用于构建传感器表面的涂层材料的理化性质，例如其半导体特性和化学稳定性33。传统FET材料如硅由于需要在晶体管沟道与特定环境之间插入氧化层才能正常工作，限制了传感器的灵敏度34。此外，硅基晶体管对高盐环境敏感，因此难以在生物分子的天然环境中准确测量其相互作用。石墨烯基生物传感器作为一种替代方案被提出，因其具有优异的化学稳定性和电场性能。由于石墨烯是单原子层厚度的碳材料，既作为半导体具有极高的灵敏度，又在化学上与生物溶液相容；这两种特性均使其成为构建兼容性电子生物传感器的理想选择35。石墨烯涂层生物传感器所展现出的显著超高生物分子负载能力，推动了基于石墨烯的生物传感器FEB技术的发展。
FEB 技术原理：FEB 是一种无标记生物分子检测技术，通过测量与结合靶标固定的石墨烯生物传感器中的电流来进行检测。固定化的蛋白质与分析物之间的相互作用会引起电流变化，这些变化可被实时监测，从而实现精确的动力学测量36。
仪器设备：FEB 系统由石墨烯场效应晶体管（gFET）传感器芯片和电子读数仪组成，后者在整个实验过程中施加恒定电压（图1）。将待测物溶液加入到固定在生物传感器表面的目标蛋白上。当发生相互作用时，电流的变化被实时测量并记录。随着待测物浓度的增加，结合的待测物比例也随之增加，导致电流变化更加显著。使用仪器配套的自动化分析软件（材料表），测量并记录I-响应值，单位为生物传感单位（BU）37。I-响应定义为固定化目标分子与待测物相互作用时，通过生物传感器芯片的电流（I）发生的实时变化。FEB 自动化分析软件可同时分析动态相互作用事件中的 I-响应和 C-响应，其中 C-响应记录电容（C）的变化。I-响应和 C-响应的变化均直接对应于结合待测物的比例，可进一步分析以获得 KD 值。自动化分析软件默认优先使用 I-响应进行分析。
<img alt="生物传感器装置；石墨烯表面；电极；电子读取器；固定化靶标；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验装置示意图。（A）基于石墨烯的芯片与电子读取器。（B）芯片组件的总体结构。芯片连接两个电极，用于向系统供电。芯片表面覆盖有石墨烯，激活后可结合靶标分子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
方法： 
首先，将活化的生物传感器芯片插入 FEB 装置（图1），然后执行以下步骤：（1）校准：使用1×磷酸盐缓冲液（PBS；pH = 7.4）对系统进行校准，以建立基线平衡响应。（2）结合：将分析物引入芯片，并监测I-响应，直至达到结合饱和。（3）解离：使用1×PBS使分析物解离。（4）再生：使用1×PBS去除芯片上残留的分析物。（5）清洗：使用1×PBS进行共计五次清洗，以彻底清除芯片上结合和未结合的分析物。
分析： 
数据分析使用随仪器提供的全自动软件进行。自动分析软件生成带有 KD 值的Hill拟合曲线图。Hill拟合曲线描述了分析物与靶蛋白结合的程度随分析物浓度变化的关系。达到半最大响应时的浓度与 KD 值成正比。较低的 KD 值表示较高的结合亲和力，反之亦然。
为了验证从FEB实验中获得的数据，使用数据回顾/导出软件从每个分析物浓度的各个读出点提取I-Response，并可按照下文所述导出至其他统计分析软件（参见材料表）。

<table><tbody><tr><td>自动化分析软件</td><td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>文中所指为随仪器提供的自动化分析软件，可生成自动化分析结果。</td></tr><tr><td>COOH-BPU（生物传感处理单元）</td><td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>生物传感器芯片</td></tr><tr><td>数据审查软件</td><td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>文中称为随仪器提供的数据审查软件，可用于查看和导出信息数据点。</td></tr><tr><td>透析袋</td><td>CelluSep,&amp;nbsp; Membrane filtration products</td><td>T2-10-15&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>T2 型管材（6,000–8,000 MWCO），（10 mm 平展宽度，6.4 mm &amp;Oslash;，0.32 ml/cm，15 m）</td></tr><tr><td>EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>EDC160322-02&lt;br/&gt; CAS number: 25952-53-8</td><td>白色粉末</td></tr><tr><td>ITC（等温滴定微量热法）系统</td><td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td></td></tr><tr><td>MES（2-(N-吗啉代)乙烷磺酸）缓冲液</td><td>Merck</td><td>M3671-50G&lt;br/&gt; CAS number: 4432-31-9</td><td>白色粉末</td></tr><tr><td>NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）芯片</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>基于石墨烯的芯片</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲盐水）10 倍浓缩液</td><td>Bio-Lab</td><td>001623237500&amp;nbsp;&lt;br/&gt; CAS number: 7758-11-4</td><td>透明液体溶液</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>11855231&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>Finnpipette F3 5–50 &amp;micro;L，黄色</td></tr><tr><td>封闭液 1（1× PBS 中含 3.9 mM 氨基-PEG5-醇）</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-002-001&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>液体，透明溶液</td></tr><tr><td>封闭液 2（1 M 乙醇胺（pH=8.5））</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-003-001&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>液体，透明溶液</td></tr><tr><td>重组蛋白 Cdc37</td><td>Abcam</td><td>ab256157&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td></td></tr><tr><td>重组蛋白 Hsp90 beta</td><td>Abcam</td><td>ab80033&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td></td></tr><tr><td>电子表格软件</td><td>Excel, Microsoft office</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td></td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>GraphPad, Prism</td><td>NA&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>文中称为其他统计软件，也可使用 SigmaPlot、Python 或其他统计程序。</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NHS160321-07&lt;br/&gt; CAS number: 106627-54-7</td><td>白色粉末</td></tr><tr><td>吸头</td><td>Alex red</td><td>LC 1093-800-000&lt;br/&gt; CAS number: NA</td><td>1–200 &amp;micro;l 吸头，散装，1,000 个</td></tr></tbody></table>

利用场效应生物传感技术探究分子伴侣hsp90与其客户蛋白激酶cdc37之间的生物分子相互作用

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

生物分子相互作用通过调控和协调功能相关的生物学事件，在多种细胞过程中发挥着多样化的作用&#160;。蛋白质、碳水化合物、维生素、脂肪酸、核酸以及酶等生物分子是生命体的基本组成单元；它们在生物系统中组装成复杂的网络，以协调无数生命活动。蛋白质通常利用复杂的相互作用组网络来执行其功能，因此评估这些相互作用对于揭示其在细胞和有机体水平上的重要性至关重要。为实现这一目标，我们介绍一种快速兴起的技术——场效应生物传感（FEB），用于测定特定的生物分子相互作用。FEB是一种台式、无标记且可靠的生物分子检测技术，利用高质量的电子型生物传感器来确定特异性相互作用。由于其生物传感器表面采用了生物相容性纳米材料，FEB技术可在纳摩尔范围内监测分子相互作用。作为概念验证，本研究阐明了热休克蛋白90（Hsp90）与细胞周期调控蛋白37（Cdc37）之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。Hsp90是一种依赖ATP的分子伴侣，在多种蛋白质的折叠、稳定性、成熟过程及质量控制中发挥关键作用，从而调控多种重要的细胞功能。Cdc37被认为是一种蛋白激酶特异性的分子伴侣，能够特异性识别并将蛋白激酶招募至Hsp90，进而调控其下游信号转导通路，因此Cdc37被视为Hsp90的共伴侣蛋白。Hsp90/Cdc37复合物所介导的伴侣-激酶通路在多种恶性肿瘤中呈高活性状态，促进细胞生长，因而成为癌症治疗的潜在靶点。本研究以Hsp90/Cdc37为模型系统，展示了FEB技术的有效性。FEB检测到两种蛋白之间存在强烈的PPI（三次独立实验中测得的KD值分别为0.014 µM、0.053 µM和0.072 µM）。综上所述，FEB是一种无标记、成本效益高的PPI检测平台，可实现快速而准确的测量。

实验1的结果： 
根据上述靶点固定化方案，将靶蛋白Hsp90（500 nM）固定在芯片上。在第一次实验中，根据文献中已有的数据，配制了10个浓度梯度的分析物蛋白Cdc37，浓度范围为25 nM至5,000 nM（见表1）。
通过观察I-Response的变化，可以实时监测实验的各个步骤（图3A）。可以直观地看到实验流程中每一步操作对I-Response的影响。例如，在校准阶段，I-Response接近于零；而在结合步骤中，随着分析物（Cdc37）浓度的增加，I-Response逐渐上升。从本实验的数据来看（图3A），在较低的分析物浓度下（25 nM时为50 BU），I-Response出现了突然的上升。通常情况下，在低浓度时I-Response应较低，并随浓度升高而逐步增加。这一突然上升的现象提示，应设计包含更低分析物浓度梯度点的实验。
<p class="jove_content"...

场效应生物传感（FEB）是一种用于检测生物分子相互作用的无标记技术。该技术通过测量结合有靶标分子的石墨烯生物传感器中的电流变化来实现检测。利用FEB技术评估了Hsp90与Cdc37之间的生物分子相互作用，结果检测到这两种蛋白质之间存在强烈的相互作用。

利用场效应生物传感技术探究分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用

生物分子相互作用通过调控和协调功能相关的生物学事件，在多种细胞过程中发挥着多样化的作用。

FEB 是一种无标记、低成本的______ _______相互作用检测平台，可提供快速且准确的测量。该方法可用于验证已知或未知的相互作用，并为生物分子相互作用的潜在抑制剂提供简便的检测手段。FEB 的主要优势在于其自动化且用户友好的软件，可在整个实验过程中引导用户操作，并配备开放的手动移液平台，使用户几乎无需培训即可开展工作。FEB 技术在制药、小分子、肽和蛋白质的生物分子分析，以及通过将体外生物活性快速转化为体内功效来进行药物验证等多个领域也具有应用前景。作为初学者，在选择合适的分析物浓度以优化实验并获得可靠的 KD 值时，您可能会面临挑战。我们建议您重点关注芯片功能化过程以及正确的缓冲液置换。首先通过反复吹吸等体积的EDC和sulfo-NHS溶液进行混合。将公司提供的生物传感器芯片放入带有配套盖子的玻璃培养皿中。建议芯片活化过程中的所有功能化步骤均在培养皿内进行。向生物传感器芯片上加入50微升1摩尔的MES缓冲液。室温孵育1分钟。然后吸去缓冲液，并立即向传感器芯片上加入50微升EDC sulfo-NHS溶液。盖上培养皿，在室温下孵育15分钟。用移液器吸去芯片上的EDC sulfo-NHS溶液，加入50微升1摩尔的MES缓冲液。吸去MES缓冲液，再用50微升1×PBS溶液冲洗芯片两次。从芯片中吸除 PBS，并加入目标分子 Hsp90。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育 30 分钟。然后吸除含有目标分子的溶液，用 50 微升 1× PBS 洗涤三次。从芯片中吸除1X PBS溶液，加入50 µL淬灭溶液一。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸除淬灭溶液一，加入50 µL淬灭溶液二。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。随后，从芯片中抽吸去除淬灭液二，并用50 µL的1×PBS缓冲液冲洗芯片5次，最后一次冲洗后在传感器上保留PBS液滴。配制Cdc37在所需浓度范围内的分析物稀释系列。设计实验时应包含至少八种不同浓度的分析物，以获得可靠的解离常数（KD值），并在用于校准和目标蛋白的相同缓冲液中配制这些不同稀释度的溶液。将芯片小心地放入仪器中。确保软件已开启且LED指示灯变为绿色。接下来，在自动化软件中点击“运行实验”模块，并选择包含再生步骤的10个点或其他任意所需方案。填写详细信息，例如操作员姓名、实验名称、日期、再生缓冲液、固定化靶标以及溶液中的分析物。按下软件上显示的“开始实验”按钮，并按照自动化软件显示的说明进行操作。为进行仪器校准，从芯片中吸取剩余的 PBS 溶液，并加入 50 微升校准缓冲液。按下“继续”按钮，等待五分钟，直至校准步骤完成。软件将显示校准步骤确定的终点，并发出警告提示需进行后续操作。接下来，通过从芯片中吸取校准缓冲液并加入50微升最低浓度的分析物来进行分析物结合。按下继续按钮，等待五分钟，直至结合步骤完成。软件将以警告提示音显示结合步骤的终点，提示继续操作。为进行分析物解离，从芯片中吸出分析物溶液，并加入50微升解离缓冲液。按下继续按钮。解离步骤持续一段时间后，软件将显示解离步骤的终点，并发出警告警报。接下来，通过从芯片中抽吸解离溶液并加入 50 µL 再生缓冲液来执行芯片再生。然后，按下继续按钮。再生步骤通常需要约 30 秒完成。随后，软件会显示再生步骤的终点，并发出警告提示以供跟进。最后，为清洗芯片，需从芯片中吸出再生溶液，并加入 50 µL 洗涤缓冲液。从芯片中吸出溶液，重复此步骤五次。在芯片上保留最后一滴洗涤缓冲液。然后，按下“继续”按钮，等待30秒，直至软件界面显示洗涤步骤完成。对所使用的每种分析物浓度重复上述步骤。校准、分析物结合、解离、再生以及清洗五次的五个步骤构成一个循环。实验结束时，在自动分析软件中按下分析按钮。包含所有实验数据点的显示窗口将出现。确保用于规定实验方案的分析物浓度准确无误。按下“运行分析”按钮以自动生成KD值。软件通过将分析物浓度与其对应的I响应值作图，生成Hill拟合曲线，并据此计算平衡状态下的解离常数。目标蛋白Hsp90被固定在芯片上，首次实验中配制了10个浓度梯度的分析物蛋白Cdc37，浓度范围从25纳摩尔到5,000纳摩尔。此处展示了第一次实验生成的数据文件。此处显示了实时监测的实验数据。Y轴对应生物传感器单位中的I响应，X轴对应实验中分析物的不同时间点和浓度。此处显示的图形表示由自动化分析软件生成的hill拟合曲线图。Y轴对应生物传感器单位中的I响应，X轴对应实验中分析物的不同浓度。此处显示的图形表示使用统计分析软件生成的结合相图。Y轴对应结合相结束时的I响应值，X轴对应分析物Cdc37的不同浓度。在实验二中，使用了另一组浓度，范围从0.4 纳摩尔到200 纳摩尔，生成的数据文件如图所示。图示为Hsp90与Cdc37相互作用的等温滴定量热法（ITC）热谱图。此处显示的是在298.15开尔文温度下，将Cdc37连续注入Hsp90中所得到的相应放热曲线。所用的差分功率是时间的函数。该图中的集成数据点表示对应于 Hsp90 与 Cdc37 的穆勒比值的归一化热量。此处使用的开放式移液方法要求操作者熟练掌握手动移液技术，并确保移液枪头不接触生物传感器。步骤时间的可重复性完全取决于操作者。一旦研究人员表征了两种生物分子之间的相互作用，便可利用FEB系统设计靶向该特定生物分子相互作用的潜在抑制剂或调节剂，进而开展筛选实验。该方法可用于鉴定、验证和定量已知及新发现的蛋白质之间，以及蛋白质与小分子（包括药物和多肽）之间的相互作用。

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