使用场效应生物传感技术探索分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用
2022年3月31日
场效应生物传感（FEB）是一种用于检测生物分子相互作用的无标记技术。它测量通过石墨烯生物传感器的电流，结合目标被固定到该传感器。FEB技术用于评估Hsp90和Cdc37之间的生物分子相互作用，并检测到两种蛋白质之间的强相互作用。
FEB是一个无标签且具有成本效益的____________互动检测平台，可提供快速准确的测量。该方法提供了已知或未知相互作用的验证，以及测试生物分子相互作用的潜在抑制剂的简单方法。FEB的主要优点是其自动化，用户友好的软件，通过开放式的手动移液平台在整个实验过程中锁定用户，使用户能够在很少甚至不需要培训的情况下工作。
FEB技术还在制药，小分子，肽和蛋白质的生物分子分析，通过将体外生物活性容易转化为体内功效的药物验证等多个领域提供应用。作为初学者，您可能会面临选择正确分析物浓度以优化实验以获得可靠KD值的挑战。我们建议注意芯片功能化过程和适当的缓冲液更换。
首先通过上下移液混合等体积的EDC和磺基NHS溶液。将公司提供的生物传感器芯片放在装有盖子的玻璃培养皿中。建议芯片激活中涉及的所有功能化步骤都在培养皿内完成。
将50微升单摩尔MES缓冲液涂在生物传感器芯片上。在室温下孵育一分钟。然后，吸出缓冲液并立即将50微升EDC磺基-NHS溶液施加到传感器芯片上。
盖上培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸出EDC磺基NHS溶液，并施加50微升的单摩尔MES缓冲液。吸出MES缓冲液，并用50微升1X PBS冲洗芯片两次。
从芯片中吸取PBS并加入目标分子Hsp90.盖上玻璃培养皿并在室温下孵育30分钟。然后，吸出含有目标分子的溶液，并用50微升1X PBS冲洗三次。
从芯片中吸出1X PBS溶液，并加入50微升淬火一种溶液。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸取淬火一溶液，加入50微升淬火二溶液。
盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。之后，从芯片中吸出淬火两个溶液，并使用50微升1X PBS冲洗芯片五次，留下传感器上的最后一个PBS液滴。在所需浓度范围内制备Cdc37的分析物稀释系列。
将实验设计为包括至少八种不同的分析物浓度以获得可靠的解离常数或KD值，并在用于校准和靶蛋白的同一缓冲液中制备这些不同的稀释液。将芯片小心地放在仪器上。确保软件已打开且 LED 指示灯变为绿色。
接下来，按自动化软件上的"运行实验"模块，然后选择10个具有再生或任何其他所需协议的点。填写详细信息，例如操作员姓名、实验名称、日期、再生缓冲液、固定目标和溶液中的分析物。按软件上显示的"开始实验"按钮，然后按照自动化软件显示的说明进行操作。
要执行仪器校准，请从芯片中吸取剩余的PBS溶液，并施加50微升校准缓冲液。按"继续"按钮并等待五分钟，直到校准步骤完成。该软件显示为校准步骤确定的端点，并发出警告警报以进行跟进。
接下来，通过从芯片中吸取校准缓冲液并施加50微升最低分析物浓度来执行分析物关联。按"继续"按钮并等待五分钟，直到关联步骤完成。软件显示关联步骤的终点，并显示警告警报以继续。
要进行分析物解离，请从芯片中吸取分析物溶液并施加50微升解离缓冲液。按继续按钮。解离步骤持续时间后，软件将显示解离步骤的端点，并发出警告警报。
接下来，通过从芯片中吸取解离溶液并施加50微升再生缓冲液来执行芯片再生。然后，按"继续"按钮。再生步骤通常需要大约 30 秒才能完成。
之后，软件显示再生步骤的终点，并发出警告警报以进行跟进。最后，要洗涤芯片，从芯片中吸取再生溶液并施加50微升的洗涤缓冲液。从芯片中吸出溶液并重复五次。
将洗涤缓冲液的最后一滴留在芯片上。然后，按"继续"按钮并等待30秒，直到软件显示屏中的洗涤步骤持续时间结束。对使用的每种分析物浓度重复上述步骤。
校准、分析物关联、解离、再生和洗涤五次的五个步骤构成一个循环。在实验结束时按自动分析软件中的分析按钮。将出现一个包含所有实验点的显示窗口。
确保用于规定方案的分析物浓度是正确的。按"运行分析"按钮可自动生成 KD 值。该软件通过将分析物浓度与相应的I响应绘制在一起来生成山丘拟合图，从中计算平衡处的解离常数。
将目标蛋白Hsp90固定到芯片上，在第一次实验中，制备了10浓度的分析物蛋白Cdc37，范围从25纳摩尔到5， 000纳摩尔。此处显示了从实验一生成的数据文件。实时监测的实验数据如图所示。
Y轴对应于生物传感器单元中的I响应，X轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。此处显示的图形图像表示从自动分析软件生成的坡道拟合图。Y轴对应于生物传感器单元中的I响应，X轴对应于实验中的不同分析物浓度。
此处显示的图形图像表示使用统计分析软件生成的关联图。Y轴对应于关联阶段结束时的I响应，X轴对应于分析物Cdc37的不同浓度。在实验二中，使用了一组从0.4纳摩尔到200纳摩尔的不同浓度，生成的数据文件如下所示。
图形图像表示Hsp90和Cdc37相互作用的ITC温度图。这里显示的是由于将Cdc37连续注射到298.15开尔文的Hsp90中获得的相应热演化曲线。这里使用的差分功率是时间的函数。
此图中的集成数据点指定了相应的归一化热与 Hsp90 与 Cdc37 的穆勒比值。这里使用的开放式移液方法要求用户对手动移液有基本的掌握，确保不要用尖端触摸生物传感器。步进计时的再现性完全取决于用户。
一旦研究人员表征了两种生物分子之间的相互作用，我们就可以通过使用FEB系统设计针对特定生物分子相互作用的潜在抑制剂或调节剂来进行筛选实验。该程序可用于鉴定，验证和量化蛋白质以及小分子（包括药物和肽）之间的已知和新颖的相互作用。
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概述
场效应生物传感（FEB）是一种无标记检测生物分子相互作用的技术，通过石墨烯生物传感器测量电流变化。本研究评估了Hsp90与Cdc37之间的相互作用，揭示了这两种蛋白质之间存在强结合。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 生物物理学
背景
- FEB 是一种经济高效的生物分子相互作用检测平台。
- 它可提供快速且准确的测量结果。
- 该技术操作简便，仅需极少培训。
- 应用领域包括药物验证和生物分子分析。
研究目的
- 验证已知和未知的生物分子相互作用。
- 检测这些相互作用的潜在抑制剂。
- 优化实验条件以获得可靠的结果。
使用的方法
- 使用 FEB 技术进行无标记检测。
- 自动化软件引导用户完成实验。
- 芯片功能化及缓冲液置换优化。
- 蛋白质间结合相互作用的测量。
主要结果
- 检测到 Hsp90 与 Cdc37 之间存在强相互作用。
- 成功验证了 FEB 方法在蛋白质相互作用研究中的有效性。
- 展示了该方法对研究人员而言操作简便。
- 在药物研发领域具有广泛的应用潜力。
结论
- FEB 是研究生物分子相互作用的有效工具。
- 它可促进药物开发和验证过程。
- 正确的实验设置对于获得可靠结果至关重要。
常见问题
行业重要性概述
场效应生物传感（FEB）可实现蛋白质-蛋白质相互作用的快速、无标记定量，有助于生物制药研发早期阶段的靶点验证和机制性风险评估&D. 通过提供Hsp90/Cdc37等复合物在纳摩尔浓度范围内的亲和力数据，FEB增强了在关键发现转折点处的预测可信度。该平台具备可扩展且可重复的测量能力，可为项目组合的筛选及后续筛选策略提供依据。
生物制药中的战略应用&D
早期发现与靶点验证
- 通过量化分子伴侣与客户蛋白之间的直接结合亲和力，阐明信号通路的依赖关系。
- 实现对肿瘤学及其他治疗领域相关蛋白复合物的功能验证。
- 通过区分靶点选择中的特异性与非特异性相互作用，支持作用机制层面的风险评估。
- 提供定量的KD值，为靶点提名中的立项/终止决策提供依据。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的无标记检测结果，适用于针对蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂或调节剂筛选。
- 通过自动化、用户引导的工作流程，促进检测方法的标准化与可重复性。
- 生成定量输出结果（I-响应值、KD），实现对化合物的可靠评估与排序。
- 支持在同一平台上重复用于多种蛋白质、多肽及小分子相互作用研究。
转化与临床前研究
- 将体外结合数据与恶性肿瘤相关的伴侣蛋白-激酶通路进行整合。
- 实现从发现阶段的相互作用验证到临床前抑制剂评估的连贯性。
- 通过提供可靠的定量相互作用数据，降低转化医学研究中的风险，支持生物标志物和靶点结合研究。
流程与工作流整合
FEB 技术整合了早期发现与先导物识别之间的界面，为假设验证、筛选和临床前验证提供了一个可重复使用的平台。
- 发现生物学：支持对蛋白质相互作用网络和通路作图进行假设驱动的探究。
- 筛选：提供可重复、定量的亲和力测量，用于检测方法开发和化合物初筛。
- 分析：实现自动化的KD计算和实时响应数据输出，支持稳健的统计学比较。
- 转化研究：将体外相互作用数据与疾病相关通路调控相衔接。
- 企业级复用：提供可扩展、免标记的检测平台，适用于多种靶点和检测模式。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强相互作用检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项/终止决策，推动资本高效的投资组合进展。
- 组合影响：支持基于风险调整的优先级排序，以及跨项目数据的可比性。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质操作、移液和生物传感器芯片功能化的专业知识。
- 需要使用FEB仪器及兼容的分析软件，以实现自动化数据分析。
- 为获得可靠的KD值，需仔细优化分析物浓度和缓冲液条件。
- 时间控制和操作步骤的标准化对于不同操作者和团队间的可重复性至关重要。
- 针对新靶标的检测可能需要调整实验方案，并验证芯片化学修饰的适用性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:16
Chip Activation
2:09
Target Protein Immobilization
3:09
Preparing Analyte Samples and Running the Experiment
6:09
Analysis
6:43
Results: Data Files Generated from Hsp90 and Cdc37 Interaction Using FEB System (Experiment 1 and 2) and ITC Analysis
8:39
Conclusion
