绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

我们的研究直接从天然细胞和组织中绘制功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱，揭示疾病如何重构细胞网络。与大多数原子间方法不同，dfPPI 无需基因工程，也无需针对患者队列的特殊技能，每个样本仅需一次多重捕获。首先，配制蛋白提取缓冲液，其中包含 20 毫摩尔 Tris、20 毫摩尔氯化钾、5 毫摩尔氯化镁和 0.01% Nb-40。

使用前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并将缓冲液置于冰上。将冷冻的组织样本放入配有研杵的微型组织匀浆管中。加入500–700 µL的天然裂解缓冲液，根据组织的致密程度和匀浆难易程度调整体积。

然后，在冰上通过轻轻上下移动研杵并使其接触研磨壁，将样品匀浆至形成均匀的悬浮液。将裂解物置于旋转仪上，在 4 摄氏度孵育 30 分钟。孵育期间通过旋转轻柔混匀样品。

使用台式离心机，在 4 摄氏度条件下以 13,000 G 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。小心收集上清液，并将其转移至透明的 1.5 毫升微量离心管中。根据制造商说明书，使用 BCA 检测试剂盒测定上清液中的总蛋白浓度。

接下来，直接从异丙醇储存液中取出一份聚氨酯微珠。静置使微珠沉降，以去除保存用溶剂。小心吸除异丙醇，然后加入天然裂解缓冲液，通过轻柔吹打或颠倒充分重悬微珠。

为清洗并平衡磁珠，先涡旋混匀管内液体，然后进行离心。随后，使用连接真空泵的移液器吸头小心吸去上清液，注意不要扰动沉淀。按与清洗后磁珠相等的体积比例加入结合缓冲液，混匀以制成均匀的工作用磁珠悬液。

使用剪去尖端的移液枪头，将40微升聚氨酯珠悬液分装至1.5毫升微量离心管中，以确保平滑加样。随后，每管加入1毫升天然裂解缓冲液，洗涤珠子三次。涡旋振荡管子以重新悬浮珠子，然后在10,000 G离心1分钟，通过抽吸弃去上清液。

最后一次洗涤后，从离心管中移除大部分残留液体，确保沉淀的磁珠不受扰动。将标准化的蛋白质提取物加入含有40 µL对照磁珠悬液的各个1.5 mL微量离心管中。用适量的天然裂解缓冲液将终体积调至250 µL。

将样品在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，使用以每分钟 10–15 转旋转的翻转式旋转仪。在 4 摄氏度下以 10,000 G 离心 1 分钟，使对照珠粒以及聚集或不溶性蛋白质沉淀。使用 1 毫升移液器小心收集对照珠粒的上清液，并转移至含有 40 微升洗涤后的聚氨酯珠悬液的新鲜 1.5 毫升离心管中。

将样品在 4 摄氏度下孵育 3 小时，同时在翻转摇床（end-over-end rotator）上旋转。离心后小心取出离心管，吸去上清液，并如先前所示方法洗涤磁珠四次。从离心管中去除残留的 PBS。

用移液器或短暂涡旋，将洗涤后的磁珠重悬于80微升新鲜配制的2摩尔尿素溶液中，该溶液溶于pH 8.5的50毫摩尔碳酸氢铵缓冲液。然后加入二硫苏糖醇，使其终浓度为1毫摩尔。盖紧管盖后，在37摄氏度下于加热型轨道摇床中以每分钟1,100转的速度振荡孵育30分钟。

加入碘乙酰胺，使其终浓度为 3.67 毫摩尔/升。将离心管置于室温避光条件下，以每分钟 1,100 转振荡孵育 45 分钟。随后，加入额外的二硫苏糖醇以淬灭未反应的碘乙酰胺，确保其终浓度为 3.67 毫摩尔/升，并通过移液轻轻混匀。

向样品中加入750纳克浓度为0.5毫克/毫升的质谱级Lys-C蛋白酶。将混合物在37摄氏度孵育1小时，同时以每分钟1,150转的速度振荡。接着，向样品中加入750纳克新配制的浓度为0.5毫克/毫升的测序级胰蛋白酶。

将混合物在37摄氏度下振荡孵育过夜，转速为每分钟1,150转。次日，在室温下以1,000-5,000 ×g离心1-5分钟。使用移液器小心地将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并弃去珠粒。

通过逐滴加入50%三氟乙酸，将消化液的pH值调节至3以下。使用指示试纸验证pH值。PU-磁珠从高表达表型伴侣体的裂解液中强烈捕获HSP90、HSC70和热蛋白，而在低表达表型伴侣体的裂解液中信号极弱，证实了探针的生物学特异性。

PU磁珠的载物谱在PU磁珠泳道中显示出丰富且高分子量的信号，而在对照磁珠泳道中背景信号极低，证实了探针的成功活性。考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示，四个胶内处理样本的条带分布一致，证实了在质谱分析前已成功从天然裂解液中富集了蛋白质复合物。通过主成分分析验证了技术重复性，其中重复样本紧密聚类，而不同样本则清晰分离。

前体离子强度分布显示，大多数特征的变异系数低于20%，样品间的中位数介于9.7%至11.9%之间，证实了肽段检测与回收的一致性。对经对数转换的蛋白质丰度进行层次聚类分析，显示出明显的样品分离效果，并保留了样品间的差异，蛋白质强度覆盖从低丰度到高度富集的范围。通路富集分析表明，在多个本体数据库中具有广泛的注释覆盖，包括基因本体分类以及Reactome、KEGG和WikiPathways等人工审编数据库。

dfPPI 使我们能够揭示其他方法无法触及的机制性和治疗性见解。dfPPI 将跨组学研究提升至真实世界疾病队列和天然条件的水平，从而实现精确的机制与治疗假设。目前，我们正在扩展 dfPPI 的应用，以绘制阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中的网络水平变化图谱。