Name: 绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-24T13:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解利用化学探针和质谱技术从原生细胞和组织中捕获疾病特异性蛋白质相互作用的方法。该技术无需基因工程即可揭示疾病如何重塑细胞网络，为神经退行性疾病研究提供机制与治疗新见解。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）（R01 CA172546、U01 AG032969、P01 CA186866、R56 AG061869、R01 AG067598、R01 AG074004、R01 AG072599、R56 AG072599、RF1 AG071805、P30 CA008748、S10 RR027990）以及威廉·H·古德温先生与中国台湾爱丽丝·古德温夫妇、癌症研究联邦基金会和纪念斯隆-凯特琳癌症中心实验治疗中心（G.C.）提供资助。S.S. 感谢BrightFocus基金会（资助编号：A2022020F）提供的经费支持。

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<li>Liu, X., Abad, L., Chatterjee, L., Cristea, I. M., Varjosalo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-protein+interactions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. , (2024).</li>
<li>Luck, K., Sheynkman, G. M., Zhang, I., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-scale+human+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome-scale human interactomics.</a> Trends Biochem Sci. 42 (5), 342-354 (2017).</li>
<li>Greenblatt, J. F., Alberts, B. M., Krogan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+significance+of+protein-protein+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease.</a> Cell. 187 (23), 6501-6517 (2024).</li>
<li>Gonzalez-Avendano, M., Lopez, J., Vergara-Jaque, A., Cerda, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+computational+proteomics+platforms+to+decipher+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The power of computational proteomics platforms to decipher protein-protein interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 88, 102882(2024).</li>
<li>Komives, E. A., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial+overview%3A+Protein+networks+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Editorial overview: Protein networks in health and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 90, 102953(2025).</li>
<li>Botticelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+enabled+systems-level+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry enabled systems-level structural biology.</a> Curr Opin Struct Biol. 87, 102872(2024).</li>
<li>Chakrabarty, S., Wang, S., Roychowdhury, T., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+dysfunctional+protein-protein+interactome+%28dfppi%29+-+a+platform+for+systems-level+protein-protein+interaction+%28ppi%29+dysfunction+investigation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Introducing dysfunctional protein-protein interactome (dfppi) - a platform for systems-level protein-protein interaction (ppi) dysfunction investigation in disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 88, 102886(2024).</li>
<li>Pasala, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epichaperomes%3A+Redefining+chaperone+biology+and+therapeutic+strategies+in+complex+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Epichaperomes: Redefining chaperone biology and therapeutic strategies in complex diseases.</a> RSC Chem Biol. 6 (5), 678-698 (2025).</li>
<li>Chu, F., Sharma, S., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTMs+as+molecular+encoders%3A+Reprogramming+chaperones+into+epichaperomes+for+network+control+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">PTMs as molecular encoders: Reprogramming chaperones into epichaperomes for network control in disease.</a> Trends Biochem Sci. , (2025).</li>
<li>Chiosis, G., Digwal, C. S., Trepel, J. B., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+complexity+of+hsp90+in+cellular+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional complexity of hsp90 in cellular homeostasis and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (11), 797-815 (2023).</li>
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<li>Rodina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+analyses+of+protein-protein+interaction+network+dysfunctions+via+epichaperomics+identify+cancer-specific+mechanisms+of+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation.</a> Nat Commun. 14 (1), 26(2023).</li>
<li>Inda, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epichaperome+is+a+mediator+of+toxic+hippocampal+stress+and+leads+to+protein+connectivity-based+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The epichaperome is a mediator of toxic hippocampal stress and leads to protein connectivity-based dysfunction.</a> Nat Commun. 11 (1), 19(2020).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically+controlling+protein-protein+interactions+through+epichaperomes+for+therapeutic+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically controlling protein-protein interactions through epichaperomes for therapeutic vulnerability in cancer.</a> Commun Biol. 4 (1), 20(2021).</li>
<li>Bay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+interactome+mapping+reveals+actionable+protein+network+dysregulation+across+the+alzheimer%27s+disease+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Sq%22%5BJournal%5D)">Systems-level interactome mapping reveals actionable protein network dysregulation across the alzheimer's disease spectrum.</a> Res Sq. , (2025).</li>
<li>Moulick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+proteomics+reveal+cancer-specific+networks+coordinated+by+HSP90%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by HSP90.</a> Nat Chem Biol. 7 (11), 818-826 (2011).</li>
<li>Kishinevsky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90-incorporating+chaperome+networks+as+biosensor+for+disease-related+pathways+in+patient-specific+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hsp90-incorporating chaperome networks as biosensor for disease-related pathways in patient-specific midbrain dopamine neurons.</a> Nat Commun. 9, 15(2018).</li>
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<li>Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dia-nn%3A+Neural+networks+and+interference+correction+enable+deep+proteome+coverage+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dia-nn: Neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput.</a> Nat Methods. 17 (1), 41-44 (2020).</li>
<li>Wang, T., Digwal, C. S., Alam, A., Chiosis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((script+epichaperomics+-+systems-level+analyses+of+protein-protein+interaction+network+dysfunctions+via+epichaperomics+identify+cancer-specific+mechanisms+of+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">script epichaperomics - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation.</a> Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7416220 (2022).</li>
<li>Chaperomics_ad_2019. , Chiosislab. 
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<li>Chaperomics_controllability_2020. , Chiosislab. 
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<li>Alam, A., Wang, T., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+files+-+systems-level+analyses+of+protein-protein+interaction+network+dysfunctions+via+epichaperomics+identify+cancer-specific+mechanisms+of+stress+adaptation+%5Bdata+set%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Cytoscape files - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation [data set].</a> Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7433980 (2022).</li>
<li>Kolberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%3AProfiler-interoperable+web+service+for+functional+enrichment+analysis+and+gene+identifier+mapping+%282023+update%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G:Profiler-interoperable web service for functional enrichment analysis and gene identifier mapping (2023 update).</a> Nucleic Acids Res. 51 (W1), W207-W212 (2023).</li>
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<li>Castelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+aberrant+n-glycosylation+can+alter+protein+functionality+and+ligand+binding%3A+An+atomistic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">How aberrant n-glycosylation can alter protein functionality and ligand binding: An atomistic view.</a> Structure. 31 (8), 987-1004.e8 (2023).</li>
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</ol>

纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）拥有表伴侣体组合物的知识产权。G.C.、A.R.、C.S.D. 和 S.S. 是已授权知识产权的发明人。其余所有作者声明无竞争利益。

本文所述方案利用dfPPI平台，可在天然生物样本中绘制功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）图谱。与传统方法通过丰度或表达变化推断功能障碍不同，该平台通过使用靶向表型伴侣体（epichaperome）的探针进行亲和纯化，结合无标记强度定量质谱技术，在结构层面捕获网络重构，从而分离出疾病特异性的相互作用蛋白。尽管当前应用主要集中于死后脑组织，但该方法广泛适用于其他类型的样本和疾病模型，包括癌变、神经退行性疾病及免疫功能障碍模型中的培养细胞和组织16,17,18,19,20,22,23。
dfPPI 依赖于能够通过动力学选择表伴侣体并捕获其结合互作分子的探针。PU-珠（源自表伴侣体结合化学型如 PU-H71/PU-AD）以非共价但长停留时间的方式结合由 HSP90 核心组织的表伴侣体，这是对表伴侣体构象而非传统伴侣蛋白复合物实现动力学选择性的典型特征23。YK5-B 是一种生物素标记的共价探针，靶向表伴侣体内的 HSC70，可在细胞裂解前实现细胞内捕获，从而保留内源性蛋白质相互作用17。选择性源于疾病相关翻译后修饰（PTMs），这些修饰重塑了 HSP90/HSC70 的构象与结合口袋化学性质，并稳定表伴侣体复合物14,23,43,44；这些改变使 PU 型非共价探针表现出高亲和力和缓慢的解离速率（koff）45，同时也支持 HSC70 靶向的 YK5-B 实现共价捕获，从而在动力学上保留表伴侣体复合物，并共分离其直接和间接互作分子，用于后续 LC-MS/MS 分析。在实际应用中，PU-珠适用于裂解液或匀浆样本的工作流程，而 YK5-B 支持活细胞捕获；两种方法均可保留依赖于细胞环境的复合物，这些复合物可通过 LC-MS/MS 鉴定，并用于下游 dfPPI 分析。
对于dfPPI技术，需要具备化学方面的专业知识以合成捕获探针。然而，这一要求并非dfPPI所独有：目前广泛使用的蛋白质相互作用研究方法（如AP-MS、邻近标记、XL-MS）同样依赖于专业技术，例如克隆/构建带标签的诱饵蛋白、稳定细胞系的建立、标记/交联条件的优化，以及复杂的生物信息学分析流程。相比之下，dfPPI无需进行基因操作和诱饵蛋白的过表达，可直接应用于原代细胞或组织（包括稀有的临床生物样本），并采用蛋白质组学核心实验室中常规使用的标准亲和捕获与液相色谱-质谱（LC-MS）工作流程。为了降低技术应用门槛，经验证的PU磁珠及匹配的对照磁珠可通过与Chiosis实验室签署材料转移协议（MTA）获得，且相关操作与质量控制步骤已在步骤1.3和1.4中详细说明。最后，dfPPI配套的网络分析工具可实现所需的统计分析及通路/网络结果输出，显著减轻了生物信息学分析负担（尤其适用于无编程背景且仅具备基础生物信息学技能的用户）。
AP-MS、XL-MS、邻近标记、共分级分离以及CETSA/TPP各自回答不同的科学问题（直接结合蛋白、空间邻近性、邻域标记、共组装或热共稳定性）。当研究目标是描绘疾病中内源性、依赖于特定环境的相互作用重连网络时——尤其是在无法进行基因标记的原代组织或大规模临床队列中，并且希望从单次捕获获得通路或网络水平的读出结果时，dfPPI是首选方法。dfPPI利用表型伴侣复合体（epichaperomes）作为多重诱饵，在一次免疫共沉淀中捕获多个蛋白质之间协调发生的相互作用变化，从而实现从原始生物材料中进行可扩展的LC-MS/MS鉴定和以通路为中心的分析。在实际应用中，dfPPI可为后续以诱饵为中心的功能验证实验（例如针对特定节点蛋白的AP-MS）提供线索，而传统方法则可用于进一步解析由dfPPI鉴定出的蛋白复合物的拓扑结构（如直接接触关系、空间约束）。参见表1中的并列比较。
多个关键步骤影响该实验流程的成功。首先，高质量的蛋白质提取物至关重要。这要求对组织或细胞进行谨慎处理——理想情况下应速冻并储存在 -80 °C——以最大限度减少蛋白降解并保持天然复合物的完整性。蛋白酶和磷酸酶抑制剂的使用是必不可少的：在此检测中，作为功能性&#34;诱饵&#34;的变构伴侣体（epichaperome）的完整性依赖于核心组分（如 HSP9023,43）的特定翻译后修饰。例如，Ser226 和 Ser255 的磷酸化对于稳定变构伴侣体的构象并维持其支架功能至关重要23。若省略磷酸酶抑制剂，则可能导致结构崩解并丧失生物学特异性。
另一个关键因素是PU磁珠亲和基质的质量和处理方式。磁珠应保存在100%异丙醇中，并于-20 °C条件下储存，且应在规定的活性窗口内使用，理想情况下在1-2年内使用完毕。在进行关键实验前应验证磁珠的活性，因为陈旧的磁珠可能表现出结合能力下降或非特异性结合增加。孵育时间和蛋白上样量也必须优化：孵育时间过长可能增加背景信号，而蛋白上样量不足则可能影响检测深度。我们建议孵育时间为3小时，并通过预实验进行拉下试验，以针对每种样本类型校准合适的上样量。
本方案兼容两种消化策略：磁珠上消化和胶内消化。虽然两种流程均可获得可重复的结果，但各有优缺点。胶内消化可能引入角蛋白等污染物，并需要额外的操作步骤。磁珠上消化简化了实验流程，当样本通量或起始量受限时通常更受青睐。然而，蛋白酶的用量需根据总蛋白投入量进行校准：尽管本方法设计使用750 ng胰蛋白酶，但如果蛋白含量较高，则可能出现消化不完全，导致漏切位点增加和肽段回收率降低。建议评估消化效率，并相应调整酶的用量。所有消化步骤均应在低吸附管中进行，并使用新鲜配制且无污染的试剂，以确保实验的一致性并尽量减少背景干扰。
每针LC-MS进样的蛋白上样量取决于捕获流程、肽段产率和色谱柱容量。对于在标准纳米液相C18色谱柱（内径约50–75 µm，长度约15–25 cm）上分析的磁珠上消化样品，我们通常每针上样300–500 ng；当上样量超过约400–500 ng时，未观察到检测性能提升，而更高上样量可能导致离子抑制和色谱峰展宽。对于凝胶内流程（例如每泳道切取5个胶条），我们通常每个重复每条胶段进样脱盐后样品的约25%，并保留约50%作为备份，以备需要时重新进样。在所有情况下，进样前均需测定肽段浓度，使用质控消化样品验证线性响应，并优化上样量，以在避免超载的同时维持良好的色谱峰形和肽段鉴定深度。
基于DIA的无标记定量技术因其可重复性和深度而在蛋白质组学中被广泛应用46。然而，在亲和捕获实验（例如本研究）中，目标是鉴定与表伴侣体支架相互作用的蛋白质，而非测量全局蛋白质丰度，因此诸如MaxLFQ之类的归一化策略并不适用。这些方法假设输入样本均匀且整个蛋白质组具有相似性，而本实验方案固有的富集步骤破坏了这些前提条件。相反，质谱信号强度值或MS/MS谱图计数已足以提供具有生物学意义的定量数据，用于后续功能分析。这些指标反映了在不同条件下蛋白质与表伴侣体之间相互作用的相对强度或频率。如先前研究16,17,18,20所示，这些数值非常适合用于系统水平的相互作用组分析（如dfPPI），可在无需全蛋白质组归一化的前提下识别发生改变的生物学通路。基于强度或MS/MS的定量方法保留了由疾病或处理所引入的真实生物学变异，从而实现对蛋白质相互作用网络功能障碍的准确且稳健的描绘。
尽管亲和捕获相比全裂解液缩小了搜索范围，但dfPPI下拉样品中仍包含数百至数千种蛋白质，其丰度动态范围广泛，并伴有共富集的背景蛋白。在队列规模的比较研究中，数据依赖性采集（DDA）的随机前体离子选择会导致不同运行间出现缺失值，以及对低丰度互作蛋白的采样不一致18。数据非依赖性采集（DIA）则在预设的质量窗口内系统性地对所有离子进行碎裂，从而实现更深度的检测、更少的缺失值以及更高的运行间重复性——当后续分析聚焦于通路或网络水平而非单个蛋白质时，这些特性尤为关键。因此，我们在dfPPI研究中将DIA作为标准方法。
与所有亲和捕获方法一样，非特异性蛋白结合是一个固有的需要考虑的因素。蛋白质可能由于对树脂的黏附性、高丰度或聚集而被保留下来。尽管此类非特异性相互作用蛋白可能出现在下拉洗脱液中，但它们的存在并不会影响本方案下游分析目标的实现17。dfPPI 工作流程的设计目的并非确定二元相互作用，而是从系统层面提取蛋白质相互作用重布线的模式。对差异性相互作用蛋白进行功能富集分析，并利用基于网络的统计方法揭示通路水平上的协调性改变。如先前研究所示17，这种系统层面的方法可最大限度地减少孤立的非特异性蛋白的影响，从而从群体水平的数据中得出可靠的生物学结论。
与传统的相互作用组作图方法（如共免疫沉淀、邻近标记或交联）相比，dfPPI 平台具有独特优势：它能够在与疾病相关的条件下捕获功能性的相互作用组重塑，而无需对诱饵蛋白进行工程化改造或过表达。由于该方法可分离在超分子表分子伴侣复合体周围形成的蛋白质复合物，因此能够检测到在健康系统中不存在的新型蛋白质组装体，从而有助于发现新的疾病驱动因子。该方法可扩展并适用于不同组织、物种和疾病状态，已在癌症和神经退行性疾病的蛋白质组重塑研究中提供了独特的见解。因此，该方法为揭示人类疾病中功能网络的紊乱提供了一种强有力的工具。
除了上述示例外，dfPPI 技术还适用于以下方向：（i）应用于大规模临床队列，根据网络功能障碍对患者进行分层，并发现能够反映靶点结合和通路校正的药效学生物标志物；（ii）进行纵向采样（如治疗前/后、疾病分期）以追踪网络重连轨迹并预测治疗响应者；（iii）与磷酸化蛋白质组学及其他关注翻译后修饰（PTM）的组学技术整合，将相互作用状态的变化与上游信号传导关联；（iv）利用显微切割区域（如肿瘤-正常组织交界区、脑区亚区）的空间分辨捕获技术，描绘局部网络的病理生物学特征；（v）开展扰动筛选（基因或化合物干预），通过 dfPPI 的检测结果识别可干预的关键节点及作用机制；（vi）结合图模型或人工智能建模，从 dfPPI 图谱中学习疾病特异性的网络特征，用于预后判断与治疗策略设计。在方法学层面，微型化、自动化（例如 96 孔板格式）以及标准化的质量控制将推动高通量流程在转化研究和临床试验中的应用。最后，dfPPI 的输出结果可引导针对性的后续实验——如亲和纯化-质谱（AP-MS）、交联-质谱（XL-MS）或邻近标记技术——以解析优先模块的拓扑结构，凸显该方法在互作组学工具箱中的互补性。

细胞的功能以及生物体的功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的精确协调1,2。这些网络负责组织和执行几乎所有的生物学过程。尽管PPI网络本质上具有动态性并能响应应激刺激，但在疾病状态下，它们可能发生异常重连，导致适应不良的功能。重要的是，这种重连并不一定涉及基因或蛋白质表达水平的改变；相反，它源于原本正常表达的蛋白质之间物理相互作用的改变3,4,5。系统生物学中的传统方法，如转录组学或蛋白质组学，无法捕捉到这些关键的相互作用层面的变化。
蛋白质相互作用（PPI）图谱技术已取得显著进展，为揭示细胞网络的组织结构与调控机制提供了重要见解6,7,8,9,10,11。常用的技术方法包括亲和纯化-质谱法（AP-MS）、交联-质谱法（XL-MS）、邻近标记以及共分级分离技术，每种方法均具有特定优势，例如高特异性、空间分辨率，或检测瞬时复合物的能力6,8,9,10,11。然而，这些方法通常需要诱饵蛋白、基因操作或复杂的生物信息学分析，且在捕捉天然生物系统中由疾病驱动的大规模蛋白质网络重连方面存在困难6,7,8,9,10,11。大多数方法还缺乏可扩展性，难以适用于大规模样本队列的分析，或在不同条件、细胞类型或时间点之间系统性地绘制相互作用组的变化6,7,8,9,10,11（表1）。
为弥补这一空白，我们开发了功能失调蛋白质-蛋白质相互作用组（dysfunctional Protein-Protein Interactome, dfPPI）平台，这是一种化学蛋白质组学方法，可直接鉴定导致疾病表型的蛋白质相互作用网络功能障碍12。该方法基于一个关键的生物学认知：在疾病状态下，一部分分子伴侣会形成称为“表伴侣体”（epichaperomes）的超分子支架结构13,14,15。这些结构并不参与蛋白质折叠，而是作为支架式相互作用枢纽，重新组织蛋白质之间的连接关系3。关键的是，被招募进入表伴侣体的蛋白质并非随机选择，而是直接参与维持疾病表型的蛋白质16,17,18,19,20。通过捕获这些与表伴侣体结合的蛋白质及其相互作用伙伴，dfPPI 能够识别驱动特定疾病状态的确切网络改变。由表伴侣体介导的网络重连在多种疾病中普遍存在——在阿尔茨海默病队列中占大多数，在癌症样本中约占70%16,20，这支持了 dfPPI 在大规模、以疾病为中心的研究中的广泛应用前景。
dfPPI 平台涵盖了从样本制备、表伴侣体亲和捕获、质谱鉴定相互作用组到下游生物信息学分析（如通路富集分析和功能蛋白网络建模）的完整工作流程（图1）。该方法利用固定在亲和基质上的表伴侣体特异性化学探针（PU-珠粒或其他探针）13,16,17，从细胞或组织中分离功能性相互作用组。这些探针已在多项研究中被严格验证，证实其对表伴侣体具有特异性，并适用于 dfPPI 分析16,17,18,20,21,22。捕获的复合物通过珠上消化和凝胶内消化两种流程进行质谱分析，并采用无标记 LC-MS/MS 技术。所得数据可通过专用的生物信息学流程进行分析，以定义相互作用层面的功能障碍，并将其与生物学过程和表型相关联。由于表伴侣体可作为特定背景下相互作用组的支架结构17,18,20，dfPPI 能够揭示蛋白质网络在特定疾病、细胞类型或发育阶段中的重构方式，因而成为一种强大的系统生物学工具，可用于精确表型分析。
该方法具有高度可扩展性，已应用于数百个临床和实验样本，包括癌症和神经退行性疾病等多种疾病的人类尸检组织和培养细胞16,17,18,19,20,22,23。通过揭示定义病理状态的蛋白质相互作用（PPI）变化，dfPPI 能够提供机制性见解，并有助于发现可干预的治疗靶点16,17,18,19,20,22,23。
在本实验方案中，我们详细描述了dfPPI平台的实验组成部分，从亲和捕获与表伴侣体结合的相互作用组，到用于LC-MS/MS分析的样品制备，再到通过质谱（MS）进行相互作用组的鉴定。由于篇幅限制，本文未涵盖计算分析流程，即如何利用质谱鉴定出的蛋白质列表来定义差异性相互作用及其功能影响。然而，该分析流程可通过dfPPI Shiny应用程序（https://epichaperomics.mskcc.org，已更新为https://dfppi.mskcc.org）以及Chiosis实验室网站（https://www.chiosislab.com/resources）免费获取，并有详尽文档说明。除上述资源门户外，完整的生物信息学分析流程及配套脚本还包含在多项将dfPPI应用于癌症16,17,19和阿尔茨海默病18,20的研究出版物中。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>有毒，易燃</td></tr><tr><td>乙腈（ACN）Optima&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科技&amp;nbsp;</td><td>A955-1</td><td>液相色谱-质谱级（易燃）</td></tr><tr><td>Affi-Gel 10 活化亲和层析介质</td><td>伯乐</td><td>1536099</td><td>用于制备 PU-珠粒和对照珠粒（易燃）</td></tr><tr><td>碳酸氢铵（ABC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLC 色谱柱</td><td>IonOpticks</td><td>AUR3-25075C18-CSI</td><td></td></tr><tr><td>放射自显影胶片</td><td>EWEN-PARKER X-RAY CORP</td><td>EBA45</td><td>Western 印迹后化学发光信号检测的替代方法</td></tr><tr><td>Biomasher 微型组织匀浆器</td><td>DWK 生命科学 Kimble</td><td>7496250010</td><td>用于匀浆冷冻脑组织以提取蛋白质</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5 mL 管的离心机</td><td>艾本德</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5 mL 管的离心机&amp;nbsp;</td><td>艾本德</td><td>5417R</td><td>带温度控制</td></tr><tr><td>适用于 15–50 mL 管的离心机</td><td>艾本德</td><td>5810R</td><td>用于锥形管</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 成像系统</td><td>伯乐</td><td>17001402</td><td>用于凝胶/印迹的密度测定</td></tr><tr><td>色谱柱恒温箱</td><td>Sonation GmBH，德国</td><td>ES071/ES072</td><td>将纳米液相色谱柱维持在 50 &amp;deg;C 以保持保留时间稳定</td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>费舍尔科技</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>对照珠粒</td><td>Chiosis 实验室</td><td>N/A</td><td>Taldone 等（PMID:&amp;nbsp;21459002）</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G-250 染色剂（生物安全型）</td><td>伯乐</td><td>1610786</td><td></td></tr><tr><td>避光 Eppendorf 管（1.5 mL）</td><td>USA 科学</td><td>1415-2507</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>罗氏</td><td>10197777001</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>Easy nLC 1000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Easy nLC 1000</td><td>与 Q Exactive HF 联用的液相色谱系统</td></tr><tr><td>Empore 固相萃取盘</td><td>3M 公司</td><td>2215-C18（十八烷基）</td><td>用于制备 StageTips 以进行肽段脱盐；用 100% 甲醇活化</td></tr><tr><td>增强型化学发光（ECL）试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管（1.5 mL）</td><td>费舍尔科技</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（FA）Optima&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科技</td><td>A117-10X1AMP</td><td>液相色谱-质谱级</td></tr><tr><td>g:Profiler（e111_eg58_p18_f463989d）</td><td>BIIT 集团-塔尔图&amp;Uuml;likool</td><td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td><td>通路富集分析</td></tr><tr><td>甘油</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP229-1</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP381-5</td><td>结晶粉末</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 HRP 标记二抗（RRID: AB_2619742）</td><td>Sothern Biotech</td><td>1030-05</td><td>H90-10 抗体的二抗</td></tr><tr><td>山羊抗兔 HRP 标记二抗（RRID: AB_2632593）</td><td>Sothern Biotech</td><td>4010-05</td><td>HSP90&amp;alpha; 和 HOP 抗体的二抗</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 HRP 标记二抗（RRID: AB_2716837）</td><td>Sothern Biotech</td><td>3030-05</td><td>HSC70 抗体的二抗</td></tr><tr><td>加热式轨道摇床</td><td>艾本德</td><td>ThermoMixer C（2231001127）</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 蛋白酶解标准品-Pierce</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88329</td><td>用于液相色谱-质谱质量控制评估</td></tr><tr><td>HOP 抗体（RRID: AB_10828378）</td><td>细胞信号技术</td><td>5670</td><td>用于 PU-珠粒质量控制</td></tr><tr><td>HSC70 抗体（RRID: AB_10617277）</td><td>Enzo</td><td>SPA-815</td><td>用于 PU-珠粒质量控制</td></tr><tr><td>HSP90（H90-10）抗体（RRID: AB_854214）</td><td>StressMarq</td><td>SMC-107</td><td>用于 PU-珠粒质量控制</td></tr><tr><td>HSP90 alpha 抗体（RRID: AB_303423）</td><td>Abcam</td><td>Ab2928</td><td>根据第 1.2 节进行归一化</td></tr><tr><td>人源细胞系：ASPC1（RRID:CVCL_0152）</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td>对照细胞系，表伴侣体低/伴侣蛋白高</td></tr><tr><td>人源细胞系：MDA-MB-468（RRID: CVCL_0419）</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td>对照细胞系，表伴侣体高/伴侣蛋白高</td></tr><tr><td>ImageJ（v1.54p）</td><td>Wayne Rasband</td><td>https://imagej.net/ij/</td><td>密度测定</td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149-5G</td><td>有毒</td></tr><tr><td>低蛋白吸附微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C 蛋白酶</td><td>普洛麦格&amp;nbsp;</td><td>VA1170</td><td>液相色谱-质谱级</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>MaxQuant（v2.1.1.0）</td><td>马克斯·普朗克生物化学研究所</td><td>https://www.maxquant.org/</td><td>MaxDIA 工作流程，用于肽段/蛋白质鉴定及基于无标记强度的定量</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>费舍尔化学</td><td>A454-4</td><td>高效液相色谱级，易燃，有毒</td></tr><tr><td>迷你蛋白酶抑制剂混合片剂（Complete）</td><td>罗氏</td><td>4693124001</td><td></td></tr><tr><td>迷你转印电泳转移槽</td><td>伯乐</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>迷你凝胶电泳槽&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A25977</td><td>用于 Novex 预制胶</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽&amp;nbsp;</td><td>伯乐</td><td>1658004</td><td>用于 Mini-PROTEAN 预制蛋白胶或手工灌胶</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;TGX 预制蛋白胶（4&amp;ndash;20%）</td><td>伯乐</td><td>4561094</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>安捷伦</td><td>BioTek Synergy H1</td><td>用于液相色谱-质谱进样前估计肽段浓度</td></tr><tr><td>NanoElute 2</td><td>布鲁克</td><td>https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf</td><td>用于 diaPASEF 工作流程</td></tr><tr><td>Nanospray Flex 离子源</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ES071</td><td>用于纳喷电喷雾电离耦合</td></tr><tr><td>New Objective PicoTip 发射器/PicoFrit SELF/P</td><td>New Objective 公司</td><td>PF360-75-10-N-5</td><td>填充 C18 悬浮液，长度为 20 cm</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Cytiva Amersham</td><td>10600006</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>实验室科学</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Novex 8% Tris-甘氨酸预制胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>XP00080BOX</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>罗氏</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>吉比科</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂</td><td>罗氏</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>派斯蛋白 BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>塑料容器</td><td>费舍尔科技</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>平台式摇床</td><td>康宁</td><td>6705</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP366-1</td><td>白色晶体</td></tr><tr><td>PowerPac 通用电源</td><td>伯乐</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope 预染蛋白标准品</td><td>伯乐</td><td>1610375</td><td></td></tr><tr><td>PU-珠粒</td><td>Chiosis 实验室</td><td>N/A</td><td>Taldone 等（PMID:&amp;nbsp;21459002）</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Orbitrap 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf</td><td>用于 DIA-MS</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ，3 &amp;micro;m</td><td>Dr. Maisch GmbH，德国</td><td>R13.aq</td><td>用于肽段分离的硅胶介质；粉末/甲醇（1:3, v/v）悬浮液</td></tr><tr><td>旋转装置（翻转式旋转器）</td><td>Barnstead&amp;nbsp;国际</td><td>400110</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 小柱（100 mg）</td><td>沃特世公司</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP166-500</td><td>电泳级</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>布鲁森</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigm 多功能微孔板读板仪</td><td>分子器件</td><td>SpectraMax Paradigm</td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut</td><td>Biognosys</td><td>https://biognosys.com/software/spectronaut/</td><td>directDIA 工作流程</td></tr><tr><td>SpeedVac 浓缩仪</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Savant SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>抽吸式真空泵</td><td>康德乐健康</td><td>CDL-65651-320</td><td></td></tr><tr><td>TimsTOF HT 质谱仪</td><td>布鲁克</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html</td><td>用于 diaPASEF 分析</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）Optima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-10AMP</td><td>液相色谱-质谱级（腐蚀性，易燃）</td></tr><tr><td>Tris</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP152-5</td><td>结晶粉末；分子生物学级</td></tr><tr><td>Tris，pH 6.8（1 M）</td><td>Teknova</td><td>T1068</td><td></td></tr><tr><td>Tris，pH 7.5（1 M）</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP1757-500</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐溶液（20x TBS）缓冲液</td><td>VWR，生命科学</td><td>97064-338</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸-SDS（TGS 10x）电泳运行缓冲液</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP13414</td><td>电泳</td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>普洛麦格</td><td>V5111</td><td>测序级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶金</td><td>普洛麦格</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>费舍尔生物试剂</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0631-500G</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>费舍尔科技</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>费舍尔科技</td><td>W6-1</td><td>液相色谱-质谱级</td></tr></tbody></table>

绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

Mapping Dysfunctional Protein-Protein Interactions in Disease

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络在疾病过程中会动态重塑，然而大多数系统生物学方法集中于蛋白质丰度的变化，忽略了在相互作用层面上的关键功能障碍。本文介绍一种稳健的化学蛋白质组学方法——功能障碍蛋白质-蛋白质互作组（dfPPI），该方法可在细胞和原代人组织中实现高通量、系统性、疾病背景相关的PPI网络功能障碍的全面绘制。该方法结合了可选择性捕获基于表伴侣体（epichaperome）互作组复合物的化学生物学探针、无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）以及基于网络的计算分析，揭示仅从转录组或蛋白质组数据中无法察觉的蛋白质网络重构现象。dfPPI平台可广泛应用于不同疾病状态、物种和组织，用于识别可干预的功能障碍节点，并提供高分辨率、系统层面的疾病进展机制见解。在本实验方案中，我们逐步展示了样本制备、化学探针处理、亲和富集、无标记LC-MS/MS分析以及用于生成和解析dfPPI数据集的生物信息学工作流程。本文旨在促进该方法的可重复性和可及性，支持其在更广泛的系统生物学和转化研究领域中的推广应用。

本文介绍了一种利用化学探针和质谱技术从原代细胞和组织中捕获并鉴定疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用的实验方案。通过专用的基于网络的分析平台对获得的相互作用数据集进行分析，以揭示与疾病相关的动态网络功能障碍及通路改变。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络在疾病过程中会动态重塑，然而大多数系统生物学方法仍主要集中于蛋白质表达水平的变化……

我们的研究直接从天然细胞和组织中绘制功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱，揭示疾病如何重构细胞网络。与大多数原子间方法不同，dfPPI 无需基因工程，也无需针对患者队列的特殊技能，每个样本仅需一次多重捕获。首先，配制蛋白提取缓冲液，其中包含 20 毫摩尔 Tris、20 毫摩尔氯化钾、5 毫摩尔氯化镁和 0.01% Nb-40。使用前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并将缓冲液置于冰上。将冷冻的组织样本放入配有研杵的微型组织匀浆管中。加入500–700 µL的天然裂解缓冲液，根据组织的致密程度和匀浆难易程度调整体积。然后，在冰上通过轻轻上下移动研杵并使其接触研磨壁，将样品匀浆至形成均匀的悬浮液。将裂解物置于旋转仪上，在 4 摄氏度孵育 30 分钟。孵育期间通过旋转轻柔混匀样品。使用台式离心机，在 4 摄氏度条件下以 13,000 G 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。小心收集上清液，并将其转移至透明的 1.5 毫升微量离心管中。根据制造商说明书，使用 BCA 检测试剂盒测定上清液中的总蛋白浓度。接下来，直接从异丙醇储存液中取出一份聚氨酯微珠。静置使微珠沉降，以去除保存用溶剂。小心吸除异丙醇，然后加入天然裂解缓冲液，通过轻柔吹打或颠倒充分重悬微珠。为清洗并平衡磁珠，先涡旋混匀管内液体，然后进行离心。随后，使用连接真空泵的移液器吸头小心吸去上清液，注意不要扰动沉淀。按与清洗后磁珠相等的体积比例加入结合缓冲液，混匀以制成均匀的工作用磁珠悬液。使用剪去尖端的移液枪头，将40微升聚氨酯珠悬液分装至1.5毫升微量离心管中，以确保平滑加样。随后，每管加入1毫升天然裂解缓冲液，洗涤珠子三次。涡旋振荡管子以重新悬浮珠子，然后在10,000 G离心1分钟，通过抽吸弃去上清液。最后一次洗涤后，从离心管中移除大部分残留液体，确保沉淀的磁珠不受扰动。将标准化的蛋白质提取物加入含有40 µL对照磁珠悬液的各个1.5 mL微量离心管中。用适量的天然裂解缓冲液将终体积调至250 µL。将样品在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，使用以每分钟 10–15 转旋转的翻转式旋转仪。在 4 摄氏度下以 10,000 G 离心 1 分钟，使对照珠粒以及聚集或不溶性蛋白质沉淀。使用 1 毫升移液器小心收集对照珠粒的上清液，并转移至含有 40 微升洗涤后的聚氨酯珠悬液的新鲜 1.5 毫升离心管中。将样品在 4 摄氏度下孵育 3 小时，同时在翻转摇床（end-over-end rotator）上旋转。离心后小心取出离心管，吸去上清液，并如先前所示方法洗涤磁珠四次。从离心管中去除残留的 PBS。用移液器或短暂涡旋，将洗涤后的磁珠重悬于80微升新鲜配制的2摩尔尿素溶液中，该溶液溶于pH 8.5的50毫摩尔碳酸氢铵缓冲液。然后加入二硫苏糖醇，使其终浓度为1毫摩尔。盖紧管盖后，在37摄氏度下于加热型轨道摇床中以每分钟1,100转的速度振荡孵育30分钟。加入碘乙酰胺，使其终浓度为 3.67 毫摩尔/升。将离心管置于室温避光条件下，以每分钟 1,100 转振荡孵育 45 分钟。随后，加入额外的二硫苏糖醇以淬灭未反应的碘乙酰胺，确保其终浓度为 3.67 毫摩尔/升，并通过移液轻轻混匀。向样品中加入750纳克浓度为0.5毫克/毫升的质谱级Lys-C蛋白酶。将混合物在37摄氏度孵育1小时，同时以每分钟1,150转的速度振荡。接着，向样品中加入750纳克新配制的浓度为0.5毫克/毫升的测序级胰蛋白酶。将混合物在37摄氏度下振荡孵育过夜，转速为每分钟1,150转。次日，在室温下以1,000-5,000 ×g离心1-5分钟。使用移液器小心地将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并弃去珠粒。通过逐滴加入50%三氟乙酸，将消化液的pH值调节至3以下。使用指示试纸验证pH值。PU-磁珠从高表达表型伴侣体的裂解液中强烈捕获HSP90、HSC70和热蛋白，而在低表达表型伴侣体的裂解液中信号极弱，证实了探针的生物学特异性。PU磁珠的载物谱在PU磁珠泳道中显示出丰富且高分子量的信号，而在对照磁珠泳道中背景信号极低，证实了探针的成功活性。考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示，四个胶内处理样本的条带分布一致，证实了在质谱分析前已成功从天然裂解液中富集了蛋白质复合物。通过主成分分析验证了技术重复性，其中重复样本紧密聚类，而不同样本则清晰分离。前体离子强度分布显示，大多数特征的变异系数低于20%，样品间的中位数介于9.7%至11.9%之间，证实了肽段检测与回收的一致性。对经对数转换的蛋白质丰度进行层次聚类分析，显示出明显的样品分离效果，并保留了样品间的差异，蛋白质强度覆盖从低丰度到高度富集的范围。通路富集分析表明，在多个本体数据库中具有广泛的注释覆盖，包括基因本体分类以及Reactome、KEGG和WikiPathways等人工审编数据库。dfPPI 使我们能够揭示其他方法无法触及的机制性和治疗性见解。dfPPI 将跨组学研究提升至真实世界疾病队列和天然条件的水平，从而实现精确的机制与治疗假设。目前，我们正在扩展 dfPPI 的应用，以绘制阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中的网络水平变化图谱。

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基于共识基序的合成蛋白质序列通常忽略共进化残基，而共进化残基意味着残基间的相互依赖性（IPDs）。IPDs 可能对蛋白质活性至关重要，若设计中忽略这些依赖性，可能导致效果欠佳。本实验方案利用 StickWRLD...

合成蛋白质的优化：识别表明结构和/或功能相关残基的残基间依赖性

调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，而且也是在细胞模型中研究蛋白质功能的重要策略。本文介绍的方案展示了抗体干扰技术在哺乳动物细胞（包括原代海马神经元）中的应用，并演示了如何利用三维重建技术研究蛋白质功能。...

通过抗体干扰和三维重建研究蛋白质功能及异常蛋白质表达的作用

本报告介绍了通过蛋白质印迹法或基于荧光的检测方法来测定错误折叠蛋白质降解速率的实验方案。这些方法可应用于其他错误折叠蛋白质的分析，以及高通量筛选。...

细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法

本方案概述了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模型中，针对与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病相关蛋白过表达所引发的组蛋白翻译后修饰（PTM）全基因组水平变化的表征实验流程。经SDS-PAGE分离后，通过特异性识别修饰位点的抗体，利用蛋白质印迹法（Western...

表征酵母神经退行性蛋白病模型中的组蛋白翻译后修饰变化

本实验方案的目的是概述在Drosophila...

利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

蛋白质稳态的衰退是衰老的一个标志，会促进神经退行性疾病的发生。我们提出了一种实验方案，通过异源表达与荧光报告蛋白融合的多聚谷氨酰胺重复序列，定量测量两种不同组织中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

本文介绍了一种计算方法（CaseOLAP...

利用知识图谱方法阐明细胞器通路在疾病中的作用 通过 生物医学报告

我们采用脑磁图（MEG）和脑电图（EEG）来绘制参与简单感觉刺激处理的脑区。...

同步 MEG 与 EEG 的功能定位映射

阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一是形成淀粉样β蛋白阳性的神经炎性斑块。在本方案中，我们描述了两种在转基因AD模型小鼠中检测神经炎性斑块的方法：采用ABC与DAB法进行免疫组织化学检测，以及使用硫黄素S染色法进行荧光检测。...

阿尔茨海默病小鼠模型中神经炎性斑块的检测

了解利用化学探针和质谱技术从原生细胞和组织中捕获疾病特异性蛋白质相互作用的方法。该技术无需基因工程即可揭示疾病如何重塑细胞网络，为神经退行性疾病研究提供机制与治疗新见解。

绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

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