卒中临床前评估网络多中心实验室溶栓治疗血栓性脑卒中模型：TE-MCAo

本研究的目的是开发一种可进行可控溶栓的血栓栓塞性卒中模型，用于严格的多实验室临床前治疗测试。我们的方案解决了目前缺乏一种能够模拟临床溶栓过程、简单且可重复的血栓栓塞性卒中模型，以及支持多中心临床前试验的问题。首先，通过将PE-50导管末端切成斜角，使其端部变钝。

使用显微剪刀剪去斜面尖端的最顶端部分。在完成麻醉大鼠的手术准备后，于大腿内侧沿腹股沟与腿部自然褶皱处做一长约1.5至2厘米的垂直切口。该切口应垂直于股动脉的预期解剖走行方向。

采用钝性分离，小心地分离至股血管。随后将股动脉与同束走行的股静脉及神经分离。尽可能向近端游离股动脉，沿动脉走向追踪至其腹膜后起源处。

在股动脉上松松地放置一个5-0丝线环，并利用线尾对动脉近端施加轻柔张力。然后用5-0丝线结扎远端股动脉，并利用缝线线尾通过止血钳对远端施加轻微张力。在距近端缝线环约三分之二距离处，将一段丝线缝线置于动脉下方，并使用显微剪刀在松绕缝线远端做一小切口（动脉切开）。

使用锐利的镊子提起动脉切口的顶端开口，将钝头斜面的PE-50导管插入切口。尽可能向近端推进导管，使结扎线松绕的环在收紧后能包绕导管。轻轻收紧缝线，确保其既不阻塞导管，也不压在导管的斜面上。

松开带橡胶护套的夹子，导管应立即充满血液。用血液填充三支1.5毫升离心管，并在4°C下保存。

将导管充满后，从股动脉移除PE-50导管，结扎近端，并用间断的5-0 Prolene缝线关闭切口。为制备血栓，取500微升新鲜或储存的供体血液转移至1.5毫升微量离心管中，加入1毫升氯化钙以逆转抗凝作用。随后立即使用轻柔负压将血液从微量离心管吸入100厘米长的PE-50导管中，并将盘绕的导管置于预热的PBS中，在37摄氏度的台式烘箱中孵育2小时。

将血栓排出至含有 PBS 的培养皿后，使用剃刀片将其切成约六厘米长的片段。用 PE-50 导管轻柔地抽吸每个血栓，并完全推出五次以进行洗涤。再用 PE-10 导管轻柔地抽吸血栓，并完全推出 15 次，进行再次洗涤。

在含有 10 毫升 PBS 的培养皿中加入 200 微升 4% 伊文思蓝溶液，配制稀释液 1。然后用移液器将 400 微升稀释液 1 转移至另一个含有 20 毫升 PBS 的培养皿中，配制稀释液 2。将血凝块置于浓度较高的伊文思蓝培养皿溶液中 1 秒，随后转移至稀释的伊文思蓝培养皿溶液中。

采用湿对湿法将一个经洗涤的血栓无气泡地装入预制的微导管中。当血栓完全装入后，推出部分血栓，使微导管内恰好剩余五厘米。用剃刀片切除多余部分。

从微导管尖端起16毫米处做标记，以标示导管应进入管腔内的推进距离。预装的血栓栓子被注入六个研究实验室共135只受试动物的颈内动脉，以验证血栓栓塞性大脑中动脉闭塞模型的可行性。在102只动物中于术后3天进行了磁共振成像检查，扫描完成率为75%。

在成像前的动物损耗在所有六个实验室中保持一致。所有实验点的平均病灶体积占同侧半球的13%，六个实验室之间存在一定差异。我们的方案模拟了人类血栓及溶栓过程，减少了动物使用量，标准化了手术操作，并实现了可靠的多中心可重复性。

作为本研究的一项重要成果，我们建立了一种可扩展且可重复的TE-MCAo模型，该模型可在多个实验室中使用，并获得一致的结果，同时具备结构化的质量控制体系。该模型可稳定应用于单中心和多中心脑卒中研究，有助于提高治疗方案的筛选效率，并加速潜在脑保护疗法的转化应用。