Explantationskultur von neuralem Gewebe

Die Explantationskulturen dienen als eine Technik, um die Entwicklung von spezifischen Zellpopulationen und Nervenstrukturen zu untersuchen. In den entwicklungsneurowissenschaftlichen Experimenten werden Explantate von Nervengewebe aus einem Embryo für die weitere Entwicklung in vitro herausgeschnitten. Diese Kulturen geben Forschern die Fähigkeit, das entwickelnde Gewebe zu manipulieren und die Entwicklung von Gewebe zu visualisieren, in einer Weise, die in vivo nicht möglich ist. Dieses Video zeigt einige wichtige Grundlagen hinter der Arbeit mit explantiertem Gewebe, Schritt-für-Schritt-Verfahren für zwei Ansätze zur Explantation von Kulturen sowie Anwendungen dieser Technik.

Vor dem Eintauchen in die Methoden wollen wir einige Grundprinzipien besprechen. Die Explantate können aus einer Reihe von Modellorganismen und einer Vielzahl von Gewebetypen hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Kulturen durch vorsichtiges Entfernen des Nervengewebes aus einem Embryo erzeugt durch das Sezieren wird ein Bereich von Interesse entfernt und in eine künstliche Umgebung platziert. Die Gewebe können auch in dünne Schichten geschnitten und in "Schnittkulturen" gezüchtet werden. Weil die Kulturumgebung so konzipiert ist, dass sie die in vivo-Bedingungen des gesamten Organs nachahmt, wird diese Kulturstrategie häufig als "organotypisch" bezeichnet.

Bevor wir beginnen, sollten die Instrumente mit 70 % Ethanol sterilisiert werden. Als Nächstes wird eine schwangere Maus mit der bevorzugten Methode des Labors eingeschläfert. Dann wird chirurgisch die Gebärmutter herausgeschnitten und in eiskaltem Puffer platziert. Die Schale wird zu einem Stereomikroskop transferiert und die einzelnen Embryonen werden aus ihrem Dottersack entfernt. Anschließend wird das Gehirn isoliert, sorgfältig wird die Region von Interesse herausgeschnitten und zu einer Kulturschale transferiert, die Kulturmedium enthält. Die Explantate können in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 für einige Wochen mit dem Ersetzen von 50% des Mediums alle 2-3 Tage gehalten werden.

Die Schnittkultur von Gehirngewebe erfordert einige zusätzliche Schritte. Vor dem Schneiden wird das Gewebe in Agarose eingebettet, die dem Gewebe Unterstützung bietet, sodass es, während es in Scheiben geschnitten wird, intakt bleibt. Um dies zu tun, wird eine 1,5% niedrigschmelzende Agaroselösung erwärmt, bis die Agarose gelöst ist. Als Nächstes wird die Agarose in Einbettschälchen transferiert und zum Abkühlen gelassen um eine Beschädigung des Gewebes zu verhindern. Das Gewebe kann dann sorgfältig untergetaucht werden und die Agarose wird zum Aushärten gelassen. Die resultierenden Blöcke werden geschnitten und dann zu einem Probentisch geklebt und mit einem Vibratom geschnitten, welches ein Instrument ist, das eine vibrierende Klinge verwendet, um dünne Scheiben von lebendem Gewebe zu schneiden. Wenn die Scheiben erzeugt sind, werden sie vorsichtig zu einer beschichteten Platte transferiert, die Kulturmedien enthält und kultiviert, wie zuvor erwähnt.

Es gibt eine Reihe von Vorteilen für die Verwendung von Explantationskulturen über in vivo und anderen in vitro-Verfahren. Als Erstes, Zellen in explantiertem Gewebe sind besser zugänglich für experimentelle Instrumente. Zweitens, die Tatsache, dass Explantate die komplexe zelluläre Architektur für die Entwicklung von Nervengewebe behalten bedeutet, das Zell-Zell-Interaktionen untersucht werden können. Drittens, da sie die chemische Zusammensetzung des Kulturmediums steuern können, können Wissenschaftler Explantate verwenden, um die Wirkung bestimmter Substanzen bei der Gewebeentwicklung zu testen.

Da es trotzdem aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wird, muss besonders darauf geachtet werden, um glückliches und gesundes Gewebe in vitro aufrechtzuerhalten. Zum Beispiel hat die Anwesenheit von extrazellulärer Matrix oder ECM einen erheblichen Einfluss auf das Zellverhalten, deshalb werden gereinigte ECM-Proteine häufig zum Beschichten von Kulturschalen verwendet. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Lösung, in der die Explantate gebadet werden. Während herkömmliches Zellkulturmedium oft verwendet wird, erfordern einige Experimente Lösungen, die dem zirkulierendem Medium im Zentralnervensystem sehr ähnlich sind: die Zerebrospinalflüssigkeit ist ein entscheidendes Reagenz in Experimenten wie die, die wir zeigen werden.

Da wir nun über die Methoden der Explantationskultur gesprochen haben, wollen wir sehen, wie diese Techniken eingesetzt werden.

Zellmigrationsassays verwenden explantiertes Gewebe, um die abstoßenden und anziehenden Signale zu untersuchen, die in neuronaler Zellbewegung beteiligt sind. In diesem Experiment werden Perlen, die vorher in Wachstumsfaktoren eingeweicht wurden, in Hinterhirn-Explantate implantiert, um neuronale Zellwanderung zu untersuchen. Nach 3-4 Tagen Exposition wurden die Neuronen mit einem Konfokalmikroskop abgebildet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Motoneuronen in Richtung der Perlen, die in dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor getränkt wurden, wandern, aber nicht bei Kontrollperlen, die in Puffer getränkt wurden.

Die Co-Kultur-Assays werden oft verwendet, um die Zell-Zell-Interaktionen während der Entwicklung zu untersuchen. In diesem Beispiel wurden Teile des Rückenmarks auf der Oberseite einer Schicht von Muskelzellen kultiviert, um zu untersuchen, wie die Verbindungen zwischen spinalen Motorneuronen und dem Skelettmuskel gemacht werden. Bereits 2 Tage nach der Inkubation werden die Vorsprünge von den Neuronen, die auch als Neuriten bekannt sind, aus dem Explantat gesehen. Innerhalb von 5 Tagen wird die funktionelle Innervierung durch die Kontraktion der Muskelzellschicht beobachtet.

Während der Entwicklung des Nervensystems müssen Nervenzellen ihre Axone verlängern, um eine Verbindung zwischen dem Zielgewebe und des zentralen Nervensystems herzustellen. Eine Möglichkeit, um diesen komplexen Prozess zu untersuchen, ist durch Axonlenkungs-Assays. Die Forscher nutzen explantiertes Gewebe, um die Faktoren innerhalb der Nervenzellen und in der näheren Umgebung zu untersuchen, die helfen, das Axon an den richtigen Ort zu lenken.

Das war der JoVE Leitfaden zur Explantationskultur von Nervengewebe. Dieses Video enthält einen Überblick über die Vorteile von Explantationskulturen, Kultur Strategien, Schritt-für-Schritt-Protokolle von zwei häufig verwendeten Explantationsverfahren und Möglichkeiten, wie diese Techniken in den heutigen Laboren verwendet werden. Danke für das Aufpassen!