Transgene Würmer werden häufig in Verwendung C. elegans Forschung. Beschrieben wird eine einfache, aber effektive, Protokoll Transgene in Würmer mit biolistischen Bombardierung mit DNA-beschichteten Goldpartikeln einzuführen. Der Aufwand und die Ergebnisse der Bombardierung den Vergleich mit Mikroinjektion für die Erzeugung von transgenen Tieren.
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Methodenartikel
Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation
In diesem Artikel
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Anzahl der Laboratorien, die die frei lebenden Nematoden C. elegans wächst rasant. Die Popularität dieser biologischen Modell ist eine schnelle Erzeugung und kurze Lebensdauer, einfache und kostengünstige Wartung, vollständig sequenzierten Genoms und Array von RNAi Ressourcen und mutierten Tieren zugeschrieben. Zusätzlich Analyse der C. elegans Genoms ergab eine große Ähnlichkeit zwischen Würmern und höheren Wirbeltieren, die die Forschung in Würmer könnten eine wichtige Ergänzung zu Studien in ganze Mäuse oder kultivierten Zellen durchgeführt werden, schlägt. Ein leistungsfähiger und wichtiger Bestandteil der Wurm Forschung ist die Fähigkeit, transgene Tiere zu verwenden, um Gen-Lokalisation und Funktion zu untersuchen. Transgene Tiere können entweder über Mikroinjektion der Wurm Keimbahn oder durch den Einsatz von biolistischen Bombardement erstellt werden. Bombardment ist eine neuere Technik und weniger vertraut ist, eine Reihe von Laboren. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, um transgene Würmer biolistischen Beschuss mit Goldpartikeln mit dem Bio-Rad PDS-1000-System zu generieren. Im Vergleich mit DNA-Mikroinjektion in Hermaphrodit Keimbahn, hat dieses Protokoll den Vorteil, dass keine besonderen Fähigkeiten des Betreibers im Hinblick auf die Identifizierung Wurm Anatomie oder die Durchführung Mikroinjektion. Weitere mehreren transgenen Linien sind in der Regel aus einer einzigen Bombardierung erhalten. Ebenfalls im Gegensatz zu Mikroinjektion, produziert biolistischen Bombardement transgene Tiere mit sowohl extrachromosomale Arrays und integrierte Transgene. Die Fähigkeit, integrierte transgenen Linien zu erhalten kann die Verwendung von mutagenen Protokolle Fremd-DNA zu integrieren. Zusammenfassend kann biolistischen Bombardement eine attraktive Methode für die Erzeugung von transgenen Tieren, vor allem für die Ermittler nicht in der Anlage der Zeit und den Aufwand, sich geschickt in Mikroinjektion interessiert.
Protokoll
Überblick
Traditionell transgenen Würmer wurden durch Mikroinjektion transgene DNA in die C erzeugt elegans Keimbahn 1,2,3,4. Während erfolgreich, benötigt dieser Ansatz spezialisierte Ausrüstung und der Entwicklung von Erfahrungen mit Wurm Anatomie und Mikroinjektionstechnik. In jüngerer Zeit biolistischen Bombardement als ein alternativer Ansatz, die DNA-beschichtete Goldpartikel verwendet, um Fremd-DNA in die Keimbahn 5,6 einführen entwickelt worden. Dieser Ansatz erfordert weniger Zeit Investitionen in Bezug auf die Praxis erfolgreich zu werden.
Die biolistischen Bomba....
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Diskussion
Biolistic Bombardement ist eine einfache Methode, um Fremd-DNA in vielen Organismen einzuführen, einschließlich C. elegans 1,5,6,7,16. Es stützt sich auf Goldpartikel Bildung eines Komplexes mit DNA in Gegenwart von CaCl 2. Kationische Polyamine wie Spermidin, schützen DNA aus Nucleaseabbau in vivo. Da Spermidin ist ein instabiles Molekül, ist es wichtig, sie in kleinen Portionen bei -20 ° C, und nehmen Sie die Lösung direkt vor der Durchführung des Bombardements. Wie wir in der Bombardier.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Seed-Fonds von der University of Pittsburgh und NIH AG028977 zu ALF unterstützt
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Goldpartikel | Inbio gold | BD021 | 1 µm |
| Midiprep-Kit | Qiagen | 12143 | |
| Spermidin | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamin | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macroträger | Bio-Rad | 165-2335 | |
| PDS-1000/He Hepta-System | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Reißscheibe | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 |
Referenzen
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
