In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen farbricate.
Methodenartikel
Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen herzustellen. Zuvor war ein Silizium-Wafer mit dem Entwurf für das Neuron Mikrofluidikvorrichtung mit SU-8 und Photolithographie zu einem Master-Werkzeug zu schaffen, oder das, was wir uns einfach als "Master"-Muster. Anschließend gießen wir das Silizium-Polymer PDMS auf der Oberseite des Meisters, die dann durch Erhitzen des PDMS zu 80 ° C für 1 Stunde ausgehärtet. Die PDMS bildet eine Negativform des Gerätes. Das PDMS wird dann sorgfältig geschnitten und weg von der Master-gehoben. Löcher gestanzt werden, wo die Lagerstätten werden und der überschüssige PDMS getrimmt vom Gerät weg. Stickstoff wird verwendet, um wegblasen überschüssige Ablagerungen aus dem Gerät. An diesem Punkt sind die Geräte jetzt einsatzbereit und kann entweder nach Corning Nr. 1 Deckglas mit einem Plasma-Sterilisator / Reiniger oder reversibel an das Deckglas, indem Sie einfach das Gerät auf der Oberseite des Deckglases gebunden gebunden. Die reversible Bindung des Gerätes an Glas wird in einem separaten Video abgedeckt und erfordert zunächst, dass das Gerät entweder mit 70% Ethanol oder durch Autoklavieren sterilisiert werden. Plasma Behandlung sterilisiert die Geräte, so dass keine weitere Behandlung notwendig ist. Es ist jedoch wichtig, wenn Plasma-Behandlung der Geräte, um die Flüssigkeit hinzufügen, um die Geräte innerhalb von 10 Minuten die Plasma-Behandlung, während die Oberflächen noch hydrophil sind. Warten länger als 10 Minuten, um Flüssigkeit hinzufügen, um das Gerät macht es schwierig für die Flüssigkeit auf das Gerät gelangen. Das Neuron-Geräte sind typischerweise Plasma-bound auf Glas und 0,5 mg / ml Poly-L-Lysin (PLL) in pH 8,5 Boratpuffer Abdeckung wird sofort an das Gerät hinzugefügt. Nach mindestens 3 Stunden Inkubation mit PLL, sind die Geräte mit dH2O Wasser mindestens 3-mal mit mindestens 15 Minuten zwischen jeder Wäsche gewaschen. Als nächstes wird das Wasser entfernt und frisches Medium ist, um das Gerät hinzugefügt. An dieser Stelle ist das Gerät einsatzbereit. Es ist wichtig, an dieser Stelle daran erinnern, niemals entfernen Sie alle Medien aus dem Gerät. Lassen Sie immer Medien in den Hauptkanal.
Protokoll
Teil 1: Vorbereiten des mikrofluidischen Neuron Gerät
- A 3 "Silizium-Wafer mit einem Muster aus der SU-8 durch Photolithographie hergestellt wird verwendet, um die Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen gegossen. Wir verweisen auf die SU-8 gemusterten Silizium-Wafer als Master Formen, oder" Meister ".
- PDMS mit Härter bei aw / w-Verhältnis von 10:1 vermischt wird, das heißt, für 10 Gramm PDMS ist 1 Gramm Härter dazugegeben.
- Die PDMS ist dann gut gemischt und gegossen auf den Silizium-Wafer. Die Silizium-Wafer ist in einem 10 cm Polystyrol-Petrischale enthalten. Es dauert etwa 12 g bis 15 g PDMS an den Master mit einer Dicke von ca. 4 mm abdecken.
- Der Meister mit dem PDMS wird dann in einem Vakuumexsikkator mit dem Deckel der Petrischale gelegt, und Vakuum angelegt. Dies geschieht zur Beseitigung von Luftblasen aus der PDMS, dass beim Rühren in der Härter eingeführt wurden. Es dauert etwa 15 Minuten für die Luftblasen zu entfernen.
- Der Meister mit PDMS ist aus dem Exsikkator entfernt. Ein Luftgewehr mit einem 0,45 um Filter verwendet wird, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen.
- Der Master ist dann auf einer 80 ° C heißen Platte für 1 Stunde zu heilen platziert.
Hinweis: Wenn einem Vakuumexsikkator nicht verfügbar ist, kann der Master bei Raumtemperatur für mehrere Stunden verlassen werden. Die Luftblasen verschwinden dann schließlich auf eigene Faust zu zerstreuen. Wenn eine heiße Platte nicht verfügbar ist, wird die PDMS bei Raumtemperatur nach 24 Stunden aushärten.
Hinweis: Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass der Master-Ebene wird während der Aushärtung.
Teil 2: Ausschneiden des Neurons Mikrofluidikvorrichtung
- Sobald die PDMS auf dem Master geheilt ist, ist es zu einer sauberen Haube genommen.
- Mit einem Skalpell wird ein Kreis um den Umfang der Geräte senken. Wenn man fügt die Klinge in den PDMS, ist es wichtig, den Kontakt mit dem Silizium-Wafer zu machen, sondern um nicht zu viel Druck auf den Wafer, sonst wird der Meister zu knacken.
- Mit einem Kreis schneiden den ganzen Weg um die Geräte (es gibt 4 Geräte pro 3 "Silicon Master), wird die PDMS vorsichtig von der Master-gehoben. Das durch vorsichtiges Drehen des Skalpells gestartet werden kann, wie es in den vorherigen Schnitt eingeführt wird .
- Als nächstes werden Reservoirs in das Gerät mit einem 8 mm Gewebebiopsie gestanzt.
- Die Geräte werden dann geviertelt und überschüssiges PDMS getrimmt, so dass das Gerät ordentlich fit zu Corning Deckglas (Nr. 1) 24 mm x 40 mm. Stickstoff Luft wird verwendet, um wegblasen überschüssige Ablagerungen. Hartnäckige Verschmutzungen können auch unter Verwendung von 3M Scotch Brand 471 Vinylband werden.
Teil 3: Plasma Bindung der Geräte an Glasdeckgläschen.
- Plasma Cleaner ist zur Bindung A Harrick das Neuron Geräte an die Deckgläser verwendet. Kurz gesagt, werden die Geräte in der Plasma-Reiniger montiert und eine Vakuumpumpe wird verwendet, um Luft aus der Kammer zu evakuieren.
- Nach der Vakuum-Druck 300 milliTorr erreicht hat, ist die Macht an die elektrische Spule eingeschaltet und auf hoch.
- Die elektrische Spule erzeugt Plasma ", ein teilweise ionisiertes Gas aus Elektronen, Ionen und neutralen Atomen oder Molekülen" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , aus der restlichen Luftmoleküle in der Kammer links. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und das Gerät, das bei platziert zusammen eine dauerhafte Verbindung bilden. Das Plasma dreht sich auch die Oberflächen hydrophil, was erleichtert die Zugabe von Flüssigkeiten hilft. Zudem sterilisiert der Plasma-Reiniger der Geräte.
Die Oberfläche des PDMS-Gerät, das die Mikrofluidikvorrichtung enthält, ist offen ausgelegt in die Plasma-Reiniger zusammen mit dem Glasträger.
Das Plasma behandelten Oberflächen der Glas-und Mikrofluidik-Gerät sind in Kontakt miteinander auf einer sauberen Werkbank montiert, dann in sterile 60 mm Schalen gelegt. Die behandelten Oberflächen bilden einen dichten irreversible Bindung. - Innerhalb von 10 Minuten von Plasma-Bindung der Geräte an Glas, Poly-L-Lysin (PLL) mit dem Gerät aufgenommen. Nach 10 Minuten wird die Hydrophilie des Gerätes verringern so dass es schwierig für die PLL auf das Gerät gelangen.
Hinweis: Es ist wichtig, auf Luftblasen in das Gerät nach der Zugabe von PLL überprüfen. Luftblasen in den Hauptkanal sind unerwünscht, da sie Zellen würden oxidieren. Eine einfache Methode, um alle vorhandenen Luftblasen zu entfernen ist es, ein P200-Pipette mit 150 ul der Flüssigkeit (in diesem Fall PLL) gefüllt verwenden, legen Sie die Spitze direkt an der Eröffnung der Hauptkanal, und drücken Sie den P200 mit Nachdruck. Diese müssen eventuell mehrmals wiederholt werden, aber schließlich die Kraft aus der Pipette wird die Blasen austreiben. - Die Geräte mit PLL dürfen inkubieren über Nacht in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Am nächsten Tag, dem deLaster sind zweimal schnell hintereinander mit autoklaviertem dH2O gespült. Während dieses Prozesses wird die Flüssigkeit nie ganz aus der Hauptkanäle entfernt, nur aus den Reservoirs. Entfernen von Flüssigkeit aus den wichtigsten Kanäle einführen Blasen. Nach 2 schnellen spült, sind die Geräte mit autoklaviertem dH2O gefüllt und wieder in den Inkubator für ein Minimum von 3 Stunden gesetzt, oder über Nacht.
- Am nächsten Tag sind die Geräte wieder 2 mal schnell mit autoklaviert dH2O gespült. Dann wird neuronalen Basalmedien, enthält die notwendigen Ergänzungen B27 und Glutamax zur Kultivierung von primären Ratten-Neuronen, die Geräte hinzugefügt. Die Geräte sind zurück in den Inkubator für die zukünftige Verwendung platziert. Die Geräte sind nun bereit für die Aussaat von Neuronen.
Diskussion
In diesem Video haben wir gezeigt, wie man und bereiten eine PDMS Mikrofluidik-Gerät, das wir verwenden, um Kultur Neuronen in. Das Gerät ermöglicht es uns, eine reine axonalen Fraktion durch Mikrorillen aus dem Fach mit einer Mischung aus Zellkörper, Dendriten und Axone getrennt zu erhalten . Diese Geräte ermöglichen dem Forscher die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen Studie sowie eine Plattform für die Durchführung des Körpers auf die Axone und beobachten, welche Auswirkungen diese Behandlungen sind auf die Neuronen. Das Gerät bietet auch ein Niveau von um Kultivierung Neuronen, erleichtern den Transport Studien hilft. Darüber hinaus ermöglicht die Mikrorillen, die die Zellkultur-Fach getrennt von der Axon-Fach, für fluidische Trennung zwischen den beiden Kammern macht es möglich, eine Seite des Geräts, ohne die andere Seite des Geräts direkt mit der Behandlung zu behandeln. Diese Eigenschaft erlaubt es dem Forscher, um Effekte wie Signaltransduktion und Transport, die sich aus der Behandlung zu untersuchen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | Reagenz | Dow Corning | Sylgard 184 mit Härter. Bitte wenden Sie sich an Dow Corning, um einen Händler in Ihrer Nähe zu finden | |
| Plasma-Reiniger | Werkzeug | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neuronales Basalmedium | Reagenz | Invitrogen | 21103-049 | Das neuronale Basalmedium wird von Invitrogen im Rahmen ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien bezogen. |
| B27 | Reagenz | Invitrogen | 17504-044 | B27 ist ein proprietäres Supplement, das über Invitrogen im Rahmen ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien erhältlich ist. |
| Glutamax | Reagenz | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax ist über Invitrogen im Rahmen ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien erhältlich. |
| Cornig No. 1 Deckglas | Deckglas | Corning | Corning No. X2935 244 | Erhältlich über Fisher Scientific, Fisch-Katalognummer 12-531D |
| 60-mm-Petri-Schale | Werkzeug | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60-mm-Polystyrol-Steril-Petri-Schalen dienen zur Aufnahme der an Glas gebundenen Vorrichtung. |
| BD Falcon 50-ml-Röhrchen | Werkzeug | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Erhältlich über Fisher Scientific, Katalognummer 14-959-49A |
| BD Falcon 15-ml-Röhrchen | Werkzeug | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Erhältlich über Fisher Scientific, Katalognummer 14-959-70C |
| Poly-L-Lysin | Reagenz | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
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Referenzen
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
Nachdrucke und Genehmigungen
