Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.
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Methodenartikel
Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikrokontaktdruck bietet eine schnelle, reproduzierbare Methode für die Schaffung von gut definierten Muster Substraten. 1 Während Mikrokontaktdrucken kann zur direkten Drucken einer großen Anzahl von Molekülen, einschließlich Proteinen, 2 DNA, 3 und Silane, 4 die Bildung von Selbst zu sein Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold bietet eine einfache Möglichkeit, um Proteine und Zellen in bestimmten Mustern mit Klebstoff und beständig Regionen beschränken. Diese Beschränkung kann zur Zellmorphologie zu kontrollieren und ist nützlich für die Prüfung einer Vielzahl von Fragen in Protein-und Zellbiologie. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für die Schaffung von gut definierten Protein-Muster für die zelluläre Studien 5 Dieser Prozess umfasst drei Schritte:. Die Herstellung eines gemusterten Master mittels Photolithographie, die Schaffung eines PDMS-Stempel und Mikrokontaktdrucken einer Gold- beschichteten Substrat. Sobald gemustert, sind diese Zellkultursubstraten der Lage beschränken Proteine und / oder Zellen (primäre Zellen oder Zelllinien), um das Muster.
Der Einsatz von selbstorganisierten Monoschicht Chemie ermöglicht eine präzise Kontrolle über die strukturierte Protein / zelladhäsive Regionen und nicht klebend Regionen, dies kann nicht erreicht werden durch direkte Protein Stanzen werden. Hexadecanthiol, die lange Kette Alkanthiol in der Mikrokontaktdrucken Schritt verwendet, erzeugt eine hydrophobe Oberfläche, die leicht adsorbiert Protein aus der Lösung. Der Glykol-terminierten Thiol, zur Verfüllung der nicht bedruckten Bereichen des Substrats verwendet, schafft eine Monoschicht, die resistent gegen Proteinadsorption und damit das Zellwachstum ist. 6 Diese Thiol Monomere produzieren stark strukturierten Monolagen, die genau definieren Bereiche des Substrats, die unterstützen können Proteinadsorption und Zellwachstum. Als Ergebnis werden diese Substrate für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich aus dem Studium der interzellulären Verhalten 7 zur Erstellung der Mikroelektronik. 8
Obgleich auch andere Arten von Mono-Chemie für Zellkultur-Studien, darunter Arbeiten aus unserer Gruppe mit Trichlorsilanen um Muster direkt auf Glassubstraten erstellen verwendet wurden, sind 9 gemusterten Monoschichten aus Alkan Thiolen auf Gold gebildet geradlinig, sich vorzubereiten. Darüber hinaus sind die Monomere für Monoschicht Präparation im Handel erhältlich, stabil und erfordern keine Lagerung oder Handhabung unter einer inerten Atmosphäre. Gemusterte Substrate aus Alkanthiole vorbereitet können auch recycelt und mehrfach wiederverwendet werden, die Aufrechterhaltung Zelle Gefangenschaft. 10
Protokoll
1. Vorbereitung der Patterned Master (Abbildung 1)
- Zentrum der Silizium-Wafer auf dem Spin-Coater und spülen Sie die Wafer mit Aceton in der ersten Stufe des zweistufigen Spin-Programm in Tabelle 1. Das Aceton wird im zweiten Schritt des Spin-Programm hinterlässt eine saubere, trockene Wafer verdampfen.
- Wenden Sie ca. 1 mL AZ9245 Fotolack / in (im Durchmesser) auf den Wafer-und Spin-Mantel mit den in Tabelle 1 beschrieben.
- Soft-backen der Fotolack beschichtete Wafer bei 110 ° C für 2 m mit einem High-Uniformität Kochplatte.
- Photopattern das Substrat entweder mit einem direkten Schreib-Photolithographie-System oder ein Mask Aligner und geeignete Maske. Masken können aus einer Reihe von kommerziellen Quellen bezogen werden. Darüber hinaus können Folien mit UV-absorbierenden Druckfarbe, mit Klebeband an eine optische flache, gedruckte verwendet, um Muster mit großen Zügen zu produzieren.
- Entwickeln Sie die strukturierten Wafer in 1:2 400K Entwickler: Halbleiter-grade VE-Wasser für 1 m 45 s unter leichtem Schütteln. Gründlich mit Halbleiter-grade deionisiertem Wasser abspülen und mit einem Strom von Stickstoff (N 2) Gas. Pattern Entwicklung kann mit Hilfe eines Mikroskops mit einem UV-Filter sein. Wenn das Muster nicht vollständig entwickelt ist, kann der Wafer in die Entwicklungsländer für zusätzliche Zeit zurückgegeben werden.
Hinweis: Für beste Ergebnisse Photostrukturierungsverfahren sollte in einem Reinraum durchgeführt werden.
2. Vorbereitung der PDMS-Stempel (Abbildung 2)
- Bereiten Sie eine 10:1 Gewichtsteile Harz: Härter Mischung aus Sylgard 182 (PDMS) und vollständig zu bedecken den Master (photostrukturierten Wafer) mit der Mischung in einem Einweg Petrischale.
- De-gas die PDMS-bedeckten Master in einem Vakuumexsikkator bis keine Luftblasen mehr sichtbar sind und lassen Sie den Stempel, um in einem Ofen bei 65 ° C aushärten für 1,5 h. Vor dem Härten, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Meister ist an der Unterseite der Schale, wie sie an der Oberfläche während der Entgasung Schritt ansteigen kann.
- Schneiden Sie die PDMS-Stempel aus dem Master-und trimmen, um die richtige Größe. Bewahren Sie den Stempel in einen Behälter (Feature Seite nach oben), um sie vor Staub und Schmutz zu schützen.
3. Vorbereitung der Patterned Gold-Substrat (Abbildung 3)
- Bereiten 25 mm nicht. 1 Runde Deckgläser für die Metallabscheidung durch Behandlung mit Sauerstoff-Plasma für 10 m. Spülen Sie zweimal mit 18,2 MOhm entionisiertes Wasser durch zweimal mit Ethanol, Trocknen mit einem Strom von N 2-Gas zwischen jedem Schritt.
- Mit einer Multi-Pocket-Elektronenstrahl-Abscheidung System, gefolgt Anzahlung 50 Å Titan von 150 Å Gold. Nicht vent des Verdampfers zwischen Abscheidung der Titan-Schicht und Goldschicht. Alternativ, gold-beschichtete Deckgläser aus einer Vielzahl von Anbietern erworben werden kann, ist es jedoch wichtig, dass die Metallschichten durch Elektronenstrahl-Verdampfung und nicht thermische Verdampfung vorbereitet sind. 11 vor Gebrauch: Wenn aus einer externen Quelle erworben haben, können Goldsubstraten durch Plasma-Oxidation oder "piranha" (. 30% H 2 O 2 7.03 Conc H 2 SO 4) gereinigt werden.
Hinweis: "Piranha"-Lösung ist explosiv in der Gegenwart von organischen Verbindungen.
- Bereiten Sie die Stanz-Lösung, 10 mM Hexadecanthiol in absolutem Ethanol, und die Verfüllung Lösung, 1 mM Glykol-terminierten Thiol in absolutem Ethanol.
- Spülen Sie den Stempel mit Ethanol und gründlich trocknen mit N 2-Gas. Bewerben Stanzen Lösung für die PDMS-Stempel tropfenweise bis zur vollständigen beschichtet. Trocknen Sie die Stempel gründlich mit N 2-Gas. Fahren Sie mit 5a oder 5b gegebenenfalls auf die Eigenschaften des PDMS-Stempel auf.
- Drücken Sie den Stempel auf die Gold-Substrat und ermöglichen die Monoschicht für 15 bilden s.
- Legen Sie die Gold-Substrat in eine Petrischale mit 18,2 MOhm entionisiertes Wasser, wodurch das Substrat eingetaucht ist. Drücken Sie den Stempel auf die Gold-Substrat und ermöglichen die Monoschicht für 15 bilden s.
- Spülen Sie den Stempel Substrat zweimal mit Ethanol, Trocknen mit N 2-Gas nach jedem Spülen und Ort des Substrats in einer Petrischale.
- Abdeckung des Substrats mit Verfüllung Lösung und Dichtung die Schale mit Parafilm, um Verdunstung zu verhindern.
- Lassen Sie den Hintergrund Monoschicht im Dunkeln für 12-14 h. Form
- Entfernen Sie die gemusterten Deckglas aus der Verfüllung und spülen Sie zweimal mit Ethanol, Trocknen mit N 2-Gas nach jedem spülen.
4. Anwenden von Protein und Zellen, um das strukturierte Substrat
- Legen Sie die gemusterten Deckglas in einer kleinen Petrischale oder Zellkulturkammer und decken mit 500 ul zu 1 ml Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). Die DPBS muss vollständig bedecken das Substrat während Protein Inkubation auch Protein Abdeckung zu gewährleisten.
- Fügen Sie eine konzentrierte Lösung von Protein an die DPBS und mischen Sie die Lösung durch das Rohrting mehrmals. Inkubieren Sie die Protein-Mischung mit dem Substrat bei 37 ° C für 1 h. Endkonzentrationen für Laminin und Fibronektin sind in der Regel 12 ug / ml und 20 pg / ml. Protein kann mit einem Amin reaktiven Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, um für die einfache Muster Visualisierung zu ermöglichen. Allerdings sollte markierten Proteins 1:1 gemischt mit unmarkiertem Protein-Protein Beschriftung kann mit biologischer Aktivität beeinträchtigt wird.
- Nach der Inkubation spülen Sie das Substrat gründlich mit DPBS (4-5x), um ungebundene Protein zu entfernen, dabei nicht auf das Substrat trocken oder bringen Sie es durch die Luft-Wasser-Grenzfläche. Nach den ersten drei Spülungen, fügen Sie etwa 500 ul von kompletten Zellwachstum Medien zu einem nassen Untergrund zu erhalten.
- Ersetzen Sie den Nährmedien verwendet werden, um das Substrat mit frischem Medium spülen.
- Distanzieren und Zählen von Zellen für die Beschichtung auf das Substrat. Entweder dissoziiert primäre Zellen, wie Neuronen im Hippocampus oder immortalisierten Zelllinien, wie CHO-K1-Zellen, verwendet werden können.
- Platte dissoziierten Zellen auf das Substrat. In der Regel 30 bis 200 Zellen / mm 2 verwendet werden.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Allgemeine schematische für die Photolithographie Vorbereitung eines strukturierten Master. In diesem Prozess wird ein Silizium-Wafer mit Aceton gereinigt, beschichtet mit Fotolack, ausgesetzt, um das Muster des Interesses, und das Muster entwickelt.
Abbildung 2. Allgemeine schematische für PDMS-Stempel Vorbereitung. In diesem Prozess, der gemusterten Master mit Sylgard (10:1 Harz: Härter) abgedeckt ist, in einem Vakuum-Exsikkator, in einem Ofen bei 60 ° C gehärtet entgast und auf Maß geschnitten.
Abbildung 3. Allgemeine schematische für Substrat Musterung. In diesem Prozess werden Glassubstrate mit Titan (50a) und Gold (150a) beschichtet mit einem Elektronenstrahl Verdampfer, durch Mikrokontaktdrucken Hexadecanthiol mit einem PDMS-Stempel gemustert, mit Glykol beendet Alkanthiole verfüllt und beschichtet mit fluoreszenzmarkierten Protein.
Abbildung 4. Patterned-Master (A) und PDMS-Stempel (B) unter Verwendung der beschriebenen Methoden. Scale-Bars sind 100 um.
Abbildung 5. Gemusterte SAMs visualisiert AlexaFluor 647-markiertem Fibronektin (A) und CHO-K1 Zellen Entbindung (B). Scale-Bars sind 100 um.
Abbildung 6. Patterned Laminin ausgesät mit E18 Maus Hippocampus-Neuronen an 4 Tagen in vitro. AlexaFluor 350-konjugierten anti-Laminin-Antikörper ist für Muster-Visualisierung (A) verwendet und E18 Maus Hippocampus-Neuronen sind mit MitoTracker Red 580 (B) gefärbt. Scale-Bars sind 100 um.
Abbildung 7. Potenzielle Fallstricke in strukturierten Substrat Vorbereitung visualisiert AlexaFluor 647-konjugierten Fibronektin Adsorption. (A) Unzureichende Durchmischung führt zu einer ungleichmäßigen Proteinadsorption. (B) Ungleiche Anwendung von Druck beim Stanzen führt zu teilweiser Patten übertragen. (C) Übermäßiger Druck beim Stanzen kann zum Zusammenbruch führen Stempel. (D) Belichtung der strukturierten Oberfläche, die Luft-Wasser-Schnittstelle beim Spülen kann im Hintergrund Proteinadsorption führen. Scale-Bars sind 100 um.
Abbildung 8. Submerged Strukturierung kann Muster mit kleinen Features, die nur schwer mit herkömmlichen Mikrokontaktdrucken in Luft gedruckt werden produzieren. Bilder (A) und (B) zeigen unterschiedliche Regionen des gleichen Muster, mit dem gleichen PDMS-Stempel in Luft (A) oder VE-Wasser (B) gedruckt. 10 um-breite Unterstützung Linien, die das Muster (hinzugefügt, um zu verhindern Stempel Kollaps) umgeben, sind in (A), aber die kleineren dot Funktionen wie in (B) nicht gesehen wird. Dies zeigt, dass der Druck in der Luft eignet sich gut für größere Features, aber der Druckvorgang in Wasser kann es notwendig sein für Muster mit kleineren Features. Scale-Bars sind 20 um.
| Zyklus | Beschleunigung (rpm / s) | Endgeschwindigkeit (rpm) | Time (s) |
| 1 | 500 | 1000 | 5 |
| 2 | 3800 | 3800 | 30 |
Tabelle 1.Zwei-Takt-Spin-Programm verwendet, um eine 4,5 um dicke Beschichtung von AZ9245 auf einem Silizium-Wafer zu erzeugen.
Zur Vorbereitung PDMS-Stempel für die Bildung von gemusterten Substrate, ein Meister in Fotolack wird zunächst hergestellt (Abb. 1 und 4A). Der Master ist der Kehrwert des Stempels und erstellt entweder mit einem direkten Schreib-Lithographie-System oder ein Mask Aligner. Wenn eine positive Photoresist, wie AZ9245, für Master-Produktion verwendet wird, wird der Resist-beschichteten Wafer, um Licht mit dem gleichen Muster, die auf das endgültige Substrat erscheint ausgesetzt. Zwar ist es nicht immer möglich ist, ist berichtet worden, dass die ideale Seitenverhältnis (Strukturgröße zu Dicke widerstehen) für PDMS-Stempel Meister 1:2 ist. 13 Wir haben festgestellt, dass Seitenverhältnisse von 1:40 möglich sind, abhängig von der Natur des Musters. AZ9245 beschichteten Silizium-Wafern unter den hier beschriebenen Bedingungen geben Photoresist mit einer nominalen Dicke von 4,5 um. Wir haben festgestellt, dass diese Dicke AZ9245 verwendet werden, um PDMS Meister mit Features von> 100 um bis 2 um zu produzieren.
PDMS-Stempel sind aus Sylgard 182 (oder Sylgard 184) mit dem Meister aus Fotolack (Abbildung 2) hergestellt gegossen. Photoresist Meister kann mehrfach verwendet werden, um viele Kopien der gleichen Marke zu schaffen. Nach dem Aushärten des PDMS, sind Briefmarken aus der Master mit einer Rasierklinge und der daraus resultierenden Stempel kann unter dem Mikroskop sichtbar gemacht, indem Stempel-Funktion unten auf einem Deckglas (Abbildung 4B) entfernt
Proper Stanzen ergibt sich eine scharfe, klare Proteinmuster, die durch Anwendung von fluoreszenzmarkierten Protein (Abb. 3 und 5) sichtbar gemacht werden können. Alternativ kann die Immunhistochemie verwendet werden, um das Proteinmuster nach Zellfixierung (Abbildung 6) zu visualisieren. Das Wachstum der Zellen ist gut mit dem Protein-Muster für beide immortalisierten Zelllinien und Primärzellen (Abbildungen 5 und 6) beschränkt.
Während diese Technik leicht zu beherrschen ist, können mehrere gemeinsame Probleme auftreten. Die Anwendung von Protein ohne ausreichende Durchmischung der konzentrierten Proteinlösung in die DPBS kann zu einer ungleichmäßigen Protein-Muster (Abb. 7A) führen. Unsachgemäße Stanzen kann zu einer teilweisen Pattern-Transfer oder Stempel Zusammenbruch (7B-C) führen. Darüber hinaus Freilegung der strukturierten Substrat mit adsorbiertem Protein an der Luft der Monoschicht verursachen verringerte Widerstand in den Hintergrund (Abbildung 7D) stören können. Patterns von sehr kleinen Features (<5 um) und hohen Aspektverhältnissen umfasste erfordern oft den Einsatz von getauchten Mikrokontaktdrucken. In diesem Verfahren (3.5b) Wasser als Barriere zur Verhinderung von Ablagerungen auf dem Substrat außerhalb der Muster (Abbildung 8) Hexadecanthiol verwendet. 14
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Diskussion
Eine Reihe von Fragen kann in die lithographische Herstellung des Masters für PDMS-Stempel-Erstellung verwendet entstehen. Unterbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in verschwommen und undeutlich Muster und Überbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in einer vergrößerten oder fehlende Funktionen. Im Allgemeinen sind die Meister mit großen Strukturgrößen (> 10 um) relativ leicht zu Muster und entwickeln, während Meister mit kleineren bietet umfangreiche Optimierung der Photostrukturierung...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten die gesamte Maurer Gruppe an der Washington University, deren kollektives Wissen hat dieses Protokoll möglich anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Arbeit wird durch das National Institute of Mental Health (1R01MH085495) zur Verfügung gestellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Silizium-Wafer | Wafer Reclaim Dienstleistungen | 2 Zoll | |
| Spin Coater / Heizplatte | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake-System | |
| AZ9245 Fotolack | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-schreiben Photolithographie-System | Microtech srl | LW325 LaserWriter-System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Entwickler | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silikon-Elastomer-Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm nicht. 1 Runde Deckgläser | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium Stücke Kamis | Incorporated | 99,95% reinem | |
| Gold-Pellets | Kamis Incorporated | 99,999% reines | |
| Elektronenstrahl-Verdampfer | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | mit Elektronenstrahl-Zubehör |
| Hexadecanthiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl) Tetra (Ethylenglykol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 Proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Ohne Kalzium und Magnesium |
| Maus Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Humanem Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor ® 647 Carbonsäure, Succinimidylester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor ® 350 Carbonsäure, Succinimidylester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-Laminin-Antikörper | Fisher Scientific | AB2034MI |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
