Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Summary

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Abstract

Mikrokontaktdruck bietet eine schnelle, reproduzierbare Methode für die Schaffung von gut definierten Muster Substraten. ¹ Während Mikrokontaktdrucken kann zur direkten Drucken einer großen Anzahl von Molekülen, einschließlich Proteinen, ² DNA, ³ und Silane, ⁴ die Bildung von Selbst zu sein Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold bietet eine einfache Möglichkeit, um Proteine ​​und Zellen in bestimmten Mustern mit Klebstoff und beständig Regionen beschränken. Diese Beschränkung kann zur Zellmorphologie zu kontrollieren und ist nützlich für die Prüfung einer Vielzahl von Fragen in Protein-und Zellbiologie. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für die Schaffung von gut definierten Protein-Muster für die zelluläre Studien ⁵ Dieser Prozess umfasst drei Schritte:. Die Herstellung eines gemusterten Master mittels Photolithographie, die Schaffung eines PDMS-Stempel und Mikrokontaktdrucken einer Gold- beschichteten Substrat. Sobald gemustert, sind diese Zellkultursubstraten der Lage beschränken Proteine ​​und / oder Zellen (primäre Zellen oder Zelllinien), um das Muster.

Der Einsatz von selbstorganisierten Monoschicht Chemie ermöglicht eine präzise Kontrolle über die strukturierte Protein / zelladhäsive Regionen und nicht klebend Regionen, dies kann nicht erreicht werden durch direkte Protein Stanzen werden. Hexadecanthiol, die lange Kette Alkanthiol in der Mikrokontaktdrucken Schritt verwendet, erzeugt eine hydrophobe Oberfläche, die leicht adsorbiert Protein aus der Lösung. Der Glykol-terminierten Thiol, zur Verfüllung der nicht bedruckten Bereichen des Substrats verwendet, schafft eine Monoschicht, die resistent gegen Proteinadsorption und damit das Zellwachstum ist. ⁶ Diese Thiol Monomere produzieren stark strukturierten Monolagen, die genau definieren Bereiche des Substrats, die unterstützen können Proteinadsorption und Zellwachstum. Als Ergebnis werden diese Substrate für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich aus dem Studium der interzellulären Verhalten ⁷ zur Erstellung der Mikroelektronik. ⁸

Obgleich auch andere Arten von Mono-Chemie für Zellkultur-Studien, darunter Arbeiten aus unserer Gruppe mit Trichlorsilanen um Muster direkt auf Glassubstraten erstellen verwendet wurden, sind ⁹ gemusterten Monoschichten aus Alkan Thiolen auf Gold gebildet geradlinig, sich vorzubereiten. Darüber hinaus sind die Monomere für Monoschicht Präparation im Handel erhältlich, stabil und erfordern keine Lagerung oder Handhabung unter einer inerten Atmosphäre. Gemusterte Substrate aus Alkanthiole vorbereitet können auch recycelt und mehrfach wiederverwendet werden, die Aufrechterhaltung Zelle Gefangenschaft. ¹⁰

Protocol

1. Vorbereitung der Patterned Master (Abbildung 1)

1. Zentrum der Silizium-Wafer auf dem Spin-Coater und spülen Sie die Wafer mit Aceton in der ersten Stufe des zweistufigen Spin-Programm in Tabelle 1. Das Aceton wird im zweiten Schritt des Spin-Programm hinterlässt eine saubere, trockene Wafer verdampfen.
2. Wenden Sie ca. 1 mL AZ9245 Fotolack / in (im Durchmesser) auf den Wafer-und Spin-Mantel mit den in Tabelle 1 beschrieben.
3. Soft-backen der Fotolack beschichtete Wafer bei 110 ° C für 2 m mit einem High-Uniformität Kochplatte.
4. Photopattern das Substrat entweder mit einem direkten Schreib-Photolithographie-System oder ein Mask Ali....

Discussion

Eine Reihe von Fragen kann in die lithographische Herstellung des Masters für PDMS-Stempel-Erstellung verwendet entstehen. Unterbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in verschwommen und undeutlich Muster und Überbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in einer vergrößerten oder fehlende Funktionen. Im Allgemeinen sind die Meister mit großen Strukturgrößen (> 10 um) relativ leicht zu Muster und entwickeln, während Meister mit kleineren bietet umfangreiche Optimierung der Photostrukturierung.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Silizium-Wafer	Wafer Reclaim Dienstleistungen		2 Zoll
Spin Coater / Heizplatte	Brewer Science	Cee 200CB Spin-Bake-System
AZ9245 Fotolack	Mays Chemical Company	105880034-1160
Direct-schreiben Photolithographie-System	Microtech srl	LW325 LaserWriter-System
Mask Aligner	HTG	3HR
AZ 400K Entwickler	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Silikon-Elastomer-Kit	Dow Corning
25 mm nicht. 1 Runde Deckgläser	VWR	16004-310
Plasma Oxidizer	Diener	Femto
Titanium Stücke Kamis	Incorporated		99,95% reinem
Gold-Pellets	Kamis Incorporated		99,999% reines
Elektronenstrahl-Verdampfer	Kurt J. Lesker	PVD 75 Thin Film Deposition System	mit Elektronenstrahl-Zubehör
Hexadecanthiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-yl) Tetra (Ethylenglykol)	Sigma Aldrich	674508
Ethanol	Pharmco-aaper	111000200	200 Proof, absolute
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Ohne Kalzium und Magnesium
Maus Laminin I	VWR	95036-762
Humanem Plasma Fibronectin	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 Carbonsäure, Succinimidylester	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 Carbonsäure, Succinimidylester	Invitrogen	A-10168
Anti-Laminin-Antikörper	Fisher Scientific	AB2034MI