Summary
一个简单的微流体装置已经发展到进行麻醉免费
Abstract
微机电制流体设备提供一个可访问的微环境中的小型生物体内研究。简单的制造工艺可用于微流体装置使用软光刻技术1-3。亚细胞成像4,5，微流体器件已被用于在体内激光显微2,6和细胞成像4,7 在体内成像需要固定的生物体。取得这样的成绩使用吸力5,8，锥形通道6,7,9，变形膜2-4,10，吸气额外的冷却5，麻醉气体，温度敏感凝胶12，氰基丙烯酸酯胶13和麻醉剂如左旋咪唑14 ，15。常用麻醉药影响突触传递16,17和是已知的亚细胞神经传输4上有不利影响。在这种ST乌德我们展示了一个基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的装置，可以让完整的遗传模式生物，如线虫线虫 ， 果蝇和斑马鱼幼虫的麻醉剂无固定膜。这些模式生物在体内研究微流体装置，因为他们小的直径和光学透明或半透明的机构适合。体直径范围从〜10微米〜800微米的早期幼虫阶段C.线虫和斑马鱼幼虫和要求的不同尺寸的微流体装置，实现完整的固定的高分辨率时间的推移成像。这些生物体被固定使用施加的压力由压缩氮气通过液体柱和成像使用倒置显微镜。从陷阱释放的动物在10分钟之内返回到正常运动。
我们演示了四个应用程序时移成像C.线虫即，成像线粒体运输中的神经元，突触前囊泡运输中的运输缺陷的突变体，谷氨酸受体运输和Q神经母细胞分裂。从这样的电影中获得的数据，表明微流的固定化是一个有用的和准确的方法，麻醉动物（ 图1J和3C-F 4）相比时， 在体内细胞和亚细胞事件的数据的获取。
设备外形尺寸进行修改，以允许时间推移成像的不同阶段C.的一龄果蝇和斑马鱼幼虫。运输标记GFP（syt.eGFP）在感觉神经元的突触小泡的基本完整的一龄果蝇幼虫表达的胆碱能神经的感觉神经元中的突触囊泡的标记显示定向运动。一个类似的装置已经被用来进行时间推移成像的心跳在受精后30小时（HPF）斑马鱼幼虫。这些数据表明，我们已经开发的简单的设备可以适用于各种各样的模型系统，以研究几个细胞在体内的生物和发育的现象。
Protocol
1。 SU8主制造
- 设计的微流体的结构使用Clewin软件和打印它使用65,024 DPI激光绘图仪与最小特征尺寸为8μm的对电路板膜。
- 清洁2厘米×2厘米的硅晶片，与在20％的KOH，持续1分钟，并在去离子水中冲洗，每一个晶片的流动层和其相应的控制层的原生氧化层。
- 件用氮气吹干，4小时，脱水，在120℃的热板上。允许的作品冷却至室温，然后再进行下一个步骤。
- 将硅块在时间上的微调夹头，打开真空。量的硅表面与〜20微升的六甲基二硅氮烷（HMDS）和涂层使用SPIN150喷丝在500rpm下5秒，持续30秒，然后3,000 rpm下。
- 完全覆盖硅晶片〜1.5毫升SU8-2025（ 包含http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm）和大衣晶片使用SPIN150喷丝在500rpm下，持续5秒，30秒，然后2,000 rpm转速。该纺丝的协议产生〜40微米的光致抗蚀剂的厚度是适合的C.早期幼虫阶段的控制和流量层线虫 。
- 自旋〜1.5毫升的SU8-2050使用SPIN150喷丝在500rpm下5秒，然后2,000 rpm转速，持续30秒，得到的光致抗蚀剂的厚度约为80微米，后期幼体阶段C 的适合用于流层制造线虫 ， 果蝇 /斑马鱼幼虫及其相应的控制层的基流层。
- 放置在硅基片上热板与SU8涂布层的顶部上。软烘烤涂覆的硅片在65℃下进行1分钟，然后95℃10分钟。允许的作品冷却至室温，然后再进行下一个步骤。
- 将曝光舞台上SU8-2025涂层表面的软出炉的硅块面对面临的UV灯的顶部。流层和控制层模式使用的光掩膜设计I（L1， 图1B）和设计（二）（L2， 图1B）分别为早期幼虫阶段C.线虫 。 SU8层的顶部上，并放置在光掩模，确保掩模对涂布层是平坦的。打开快门的UV灯和200瓦特的UV灯，持续15秒，通过光掩模暴露软烘烤SU8晶片。
- 使用的光掩膜设计I（L1， 图1B）和设计（二）（L2， 图1B）上涂SU8-2050件（准备步骤1.6）制作的流程层和控制层C.为后期幼体阶段线虫 。使用的光掩膜的设计I（L1， 图1C）和设计（二）（L2， 图1C）为基础的流层和控制层分别为果蝇 /斑马鱼幼虫的晶圆上涂SU8-2050（准备我n步1.6）。揭露SU8表面，通过光掩模，以200瓦，持续15秒的UV灯。
- 将暴露的硅片与涂覆层的顶部上的热板上。发布为1分钟，然后95℃下10分钟，在65℃下烘烤晶片。允许件冷却下来，然后再进行下一个步骤。
- 开发件使用的SU8显影剂溶液20分钟。清洗件在异丙醇（IPA），并用氮气吹干气体。
- 放置在干燥器中的硅片与的SU8图案上顶部。大衣件tricholoro（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷2小时，在干燥器中的蒸气用50μl。
注意事项：在KOH治疗期间，光阻涂布和发展，采取安全预防措施，对化学品的处理。硅烷的蒸气涂料应在通风良好的地方干燥器内进行。保护SU8抵制过度暴露在光线下。使用防护眼镜UV韧带羟色胺的来源。
2。 PDMS模具制造
- 准备10:1 PDMS通过组合用5克在塑料杯中的固化剂50克Sylgard的184碱。手动混合的内容〜3分钟。德加的干燥器内，以除去所有的气泡混合过程中形成的混合物。
- 以上的硅晶片用SU8图案设计II，倒入5毫米厚的聚二甲基硅氧烷的混合物，用于控制层，轻轻地避免形成气泡。如果气泡形成过程中浇注，脱气PDMS SU8在低真空模式，以除去所有的气泡。
- SU8-2025模式的设计，我将在硅片，流层，微调夹头和，打开真空保持。量晶片以〜1毫升的PDMS混合物和涂覆的晶片使用在500rpm喷丝SPIN150 5秒后跟1,500 rpm下，持续30秒。
- 大衣〜1毫升PDMS与80微米的SU8-2050设计I（L1， 图1B）的图案，对于硅晶片上的混合流层C.为后期幼体阶段线虫使用SPIN150喷丝在500rpm下，持续5秒，随后以1000rpm，持续30秒。涂上一层厚厚的聚二甲基硅氧烷混合硅块SU8-2050的流层设计I（L1， 图1C）， 果蝇 /斑马鱼幼虫的模式，在500转每分钟为35秒SPIN150微调。
- 烘烤PDMS涂硅块的设计和相应的设计（二）控制层的晶圆含有PDMS为C.线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫在热空气对流烘箱中在50℃下进行6小时。
- 切出含有SU8图案II 用于 C从硅衬底的PDMS片线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫用锋利的刀片。 〜1毫米直径的储层的顶部连接的主要陷阱在PDMS模具使用哈里斯打孔器打一个小孔。
- 将打孔PDMS块（含40微米厚的模具控制层L2）上的塑料托盘，与成型体的控制层侧的面朝上。将PDMS涂层的硅晶片载有40微米厚的SU8的设计，我在同一个托盘，PDMS涂层表面朝上。插入托盘等离子体清洁器腔室的内部，开启真空，持续2分钟。随后，打开等离子电源，降低腔室压力，直到将光粉红色。两个表面暴露至18瓦特空气等离子体，在低真空下，持续2分钟。
- C.为后期幼体阶段，将打孔的PDMS块从80微米厚的含SU8主模式II 线虫或果蝇 /斑马鱼幼虫上的塑料托盘，与成型体的控制层侧的面朝上。将相应的焙烤PDMS层旋涂在硅晶片上，含有80微米厚的设计，我购买C.线虫阶段或果蝇的 /斑马鱼幼虫同时在同一托盘上的平板PDMS涂层的小号urface朝上。上述使用相同的协议，将其暴露在空气等离子切割。
- 将两个等离子体处理后的表面为C.线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫连同温和的压力和烘烤它们在热空气对流烘箱中在50℃下2小时。
- 切出的硅衬底C. SU8的设计，我为保税设备线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫。打孔水库的流路的入口和出口的通道孔。
- 将保税PDMS模具在塑料托盘C.线虫 ，与模制侧的面朝上的流动层设计。清洁玻璃盖片（22 X 22毫米，厚度1号），并把它放在同样的塑料托盘。将PDMS模具和玻璃盖片的等离子腔体内部装有。公开的底部的PDMS表面的装置和盖玻片至18瓦特空气等离子在低的压力，持续2分钟。将两个等离子体处理的表面，与根幔压力和烤它们在热空气对流烘箱中在50℃下2小时。
- 将装置存放在一个清洁的环境，以备将来使用。
3。其他果蝇的 /斑马设备的步骤
- 公开清洁的玻璃表面的尺寸，2厘米×2厘米用tricholoro50μl的（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷2小时，在干燥器中的蒸气。
- 自旋〜1毫升在步骤2.1制备使用SPIN150喷丝在500rpm，35秒的硅烷化的玻璃表面上的10:1的PDMS组合。烘烤的PDMS涂覆的玻璃基板在热空气烘箱中，在50℃6小时，与涂覆的表面朝上。允许PDMS层冷却至室温，然后再进行下一个步骤。
- 打孔机使用一个定制的尖锐的金属打孔器的PDMS的中间，以形成隔离物的PDMS层的涂敷层。类似果蝇 /斑马鱼（L1， 图1C中的流程设计的形状设计的金属打孔器
- 公开的PDMS间隔层和单键合的嵌段（流动层和控制层， 果蝇 /斑马鱼幼虫在步骤2.9）至18瓦特空气等离子体，使用在低真空度的等离子体清洁器。一起放置两个等离子体处理的表面，他们在一个热空气烘箱中于50℃下2小时和烘烤。
- 从玻璃剪切键合设备，冲头进入孔的入口和出口的水库和债券使用的等离子体清洁器，提到在步骤2.11，玻璃盖片（22×22毫米，厚度1号）。这将产生一个固定装置为一龄果蝇幼虫〜500微米的通道高度。斑马鱼幼虫，重复的的PDMS间隔层制造工艺与一个额外的键合工序。双层的PDMS-S生产900微米的高度为30 HFP斑马鱼幼虫的渠道。
注意事项：避免设备制造过程中的粉尘颗粒。两个等离子清洗的表面的需要是完全无尘适当的结合。存储设备，在干燥器中在一个特殊的洁净室的情况下是不可用的，以尽量减少设备中的灰尘颗粒的积累。
4。使用硅橡胶膜
- 通过18号针（外径〜1.25毫米的微柔性管（内径〜1.6毫米，外径为〜4.8毫米）的一端连接到一个加压的氮气气体供给调节器和另一端连接到主陷阱储层）粘到管。 A 3路活塞用于在中间管连接允许应用程序或在膜上的压力释放。
- 填充管的PDMS的移动设备连接到蒸馏水中，用10厘米柱，然后再连接到储存器的主要的C.陷阱线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫的移动设备。
- 转动阀的供氮读取14 psi和监察次偏转朝向主陷阱膜Ë流道倒置显微镜在低倍。的水柱在微柔性管的长度的3路活塞打开时，被压缩。偏转膜的边缘是在透射光中（ 图1I和1J）可见。膜偏转导致的PDMS膜下的尘埃颗粒/气泡的位移，并推压它们的信道边界。
- 等待，直到填补了微通道液体前，完全没有任何气体。
- 释放压力，通过使用的3路活塞放松到其静止位置的膜。
5。插入C.线虫 ， 果蝇和斑马鱼幼虫侵入设备，固定在灵活的PDMS膜
- 填充M9的缓冲液的流路与[3克KH 2 PO 4，6克Na 2 HPO 4，5克NaCl，1毫升1M的用MgSO 4，H 2 O至1升，由引渡消毒oclaving] C.线虫 18或1X PBS [8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na 2 HPO 4，0.24克KH 2 PO 4，H 2 O至1 L，灭菌果蝇 /斑马鱼幼虫19之前的10分钟的高压灭菌]实验。
- 找到一个单一的C.线虫所需的阶段NGM板18上一个（或一龄果蝇幼虫琼脂鸡蛋板或手动dechorionated的30斑马鱼斑马鱼幼虫在液体培养基中20），使用低倍率体视显微镜。选择一个单一的动物，使用小体积的缓冲溶液成一个微小费。使用微尖，其最终削减，以适应更大的果蝇或斑马鱼幼虫在缓冲。
- 推入单一的有机体通过流道的入口处。调整移液压力定位下的动物个体的主要陷阱。
- 慢慢地增加压力的PDMS膜定位议员动物对的NEL边界和固定用14 psi的压力C.线虫 ， 果蝇 ，斑马鱼幼虫和3磅7磅。
- 固定的动物放置在显微镜的视场的中心。使用倒置显微镜，高分辨率明场或荧光成像所需的设置。获得单或时间推移荧光图像在预定义的帧速率。
- 释放陷阱的压力和监管的动物在低放大倍率为5-10分钟的运动。
- 冲洗动物，并插入一个新的动物，以重复上述步骤。
- 清洗所有的动物从废液池，用蒸馏水采用注射器。干的推动空气通道的使用注射器以备将来使用。
注意事项：动物移液压力要求较高的内流的主要通道从陷阱中释放后，往往表现出的运动/健康欠佳，应避免为IMA晋。清洁的流路的任何痕量的缓冲液，以防止堵塞的通道晶体。如果液压油用于高分辨率成像，清洁玻璃盖片是随后的实验中，能保持良好的信噪比。
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Representative Results
固定装置是一个通过粘接两层制成的双层PDMS块：的流动层（第1层）和一个控制层（第2层），如在图1中所示。的主要的陷阱被连接到氮气瓶通过一个调节器和一个三路停止旋塞应用必要的（3-14磅）的压力通过液体柱（ 图1A）到膜上。偏转膜固定C。线虫 ， 果蝇或斑马鱼幼虫在具有不同尺寸（ 图1B和1C）的流动通道设计。 C.不同的几何形状，照片口罩是用来固定设备层设计线虫 （ 图1D）， 果蝇幼虫（ 图1F）和斑马鱼幼虫（ 图1G）。流层的通道高度（h1的图1E，1K），使用不同的旋涂速度，以适应变化或ganisms直径不同的流路的内部。制造流动层高度在40微米，80微米，500微米和900微米的用于 C 线虫幼虫阶段，成人C.线虫 ，第一龄果蝇幼虫和斑马鱼幼虫分别为（ 表1）。与流道的高度为40μm的装置是适当的从L1到L4的C.线虫幼虫。流道高度为80微米的设备用于后期L4幼虫和成虫C.线虫时，外阴开始突出。较大的斑马鱼器件也可用于年龄较大的果蝇幼虫。 用于 C在40微米和300微米的PDMS膜的厚度（m），制作线虫和果蝇 /斑马鱼设备。制作第2层中的微流体通道的高度为40微米的C.早期幼虫阶段C.为后期幼体阶段的线虫和80微米线虫和果蝇/斑马鱼幼虫。的流动通道，膜和控制信道的高度，测定在多个独立的批次制造的设备和被发现彼此±5μm的范围内一致。该装置使用的膜偏转技术（ 图1H-J），在流道固定生物体。
| 生物 | 流动通道（PDMS-1） | 自旋流道的条件 | 间隔件：聚二甲基硅氧烷（PDMS-S） | 自旋条件间隔PDMS | 固定压力（psi） |
| 线虫 （L1早L4） | 40微米（SU8-2025） | 500rpm下（5秒），2000转每分钟（30秒） | NA | NA | 14 |
| C.线虫 （L4和后期成年人） | 80＆万亩;米（SU8-2050） | 500rpm下（5秒），2000转每分钟（30秒） | NA | NA | 14 |
| 果蝇 （一龄） | 80微米（SU8-2050） | 500rpm下（5秒），2000转每分钟（30秒） | 为400μm（PDMS） | 500转每分钟（35秒） | 7 |
| 斑马鱼（30 HPF） | 80微米（SU8-2050） | 500rpm下（5秒），2000转每分钟（30秒） | 2倍400微米（PDMS） | 500转每分钟（35秒） | 3 |
表1中。C 中使用的移动设备尺寸的流道（PDMS-1）和隔板PDMS层（PDMS-S） 线虫和果蝇 /斑马鱼设备。
线虫 L4幼虫被固定在80微米的通道高度的PDMS微流体装置，使用14 psi的氮气（ 图2A）。时间推移荧光影像W趁着线粒体的成像运输用60X物镜（数值孔径1.4，油物镜）的速度的2的帧每秒（fps）的获取可视化，使用面向线粒体基质GFP在触摸受体神经元21。全部400帧转换成kymographs使用ImageJ（ www.rsbweb.nih.gov / IJ ）和线粒体被归类为顺行定向（远离细胞体），逆行指示（朝向细胞体）或固定的（ 图2E）。我们观察到线粒体运输至21 psi的固定压力，但磁通是在最低的固定压力稍大。经测定为1.1±0.23和1.6±0.22 0.8±0.25和1.2±0.34在14 psi的固定压力7磅，而顺行和逆行助焊剂线粒体。的值均无统计学差异由1.1±0.33和1.3＆Plusmn 0.42从动物身上获得的固定使用3毫米左旋咪唑（p值> 0.45，N = 30只）。
用500μm的高度较大的器件可以用来固定第一龄果蝇幼虫（ 图2B）和28-30高倍视野斑马鱼幼虫（ 图2D）。第一龄果蝇幼虫的解剖是具有挑战性的。通过对比微流体器件提供了一个方法来执行高分辨率明场和/或荧光成像技术，使用完整的有机体。个人果蝇幼虫被固定使用7 psi的压缩氮气（ 图2B，表1）和荧光图像的synaptotagmin.eGFP运输购入在感觉神经元（ 图2C）。时间推移电影表现出运动和静止突触显着货物在感觉神经元（ 图2F）。平均顺行和逆行速度测定KYMographs是0.92±0.04微米/秒和1.00±0.05μm/ s时分别为组（n = 6只动物中，n> 40段）。这些突触承载运输囊泡在解剖果蝇运动神经元移动两个anterogradely（0.84±0.05μm/ s时）和逆行（0.76±0.03μm/ s时）22的测量的速度相媲美。
与900微米的高度相似的设备被用来固定斑马鱼幼虫的不同阶段（ 图2D，表1）。在其早期发展阶段的斑马鱼幼虫翻转它的尾巴，每10至15秒，通常使用固定0.02％三卡因（MS-222）在溶液中或安装媒体的高分辨率成像23。我们的PDMS的移动设备提供了一个备用的装置，用于快速固定化，并且消除了需要一个不可靠的安装介质中的光路在高分辨率成像24期间 。我们手动dechorionated 28-30斑马鱼幼虫和他们单独固定在一个的PDMS设备使用3 psi的氮气获得的幼虫心跳的时间推移电影。心跳率进行测量，为136.8±1.6分钟（N = 8电影）和类似的其他已发表 的报告25。
我们简单的微流体装置已经被证明为测量各种亚细胞和细胞事件，在野生型C.线虫 4。在我们的微流体装置，野生型C.线虫显示较大数量的货物中，如移动使用麻醉剂被固定的动物相比，在神经元突触小泡。但是，我们没有对我们的设备进行测试突变的动物，看看这些研究结果成立。为了测试这一点，我们用了一个强大的亚效等位基因突变体中，UNC-104 kinesin3 / UNC-104分子马达（e1265），突触前囊泡运输26。我们比较了流量GFP :: RAB-3显着突触前囊泡在麻醉前外侧mechanosensory神经元固定和设备的CLES在固定的突变aniamls（ 图3A）。磁通前突触小泡的时间是从UNC-104动物麻醉在1mM左旋咪唑（ 图3B，3C）27获得的数据中的移动设备固定的动物相比更大的通量。这表明，成像强大的运输缺陷突变体中的微流体装置很可能是一个更有效的方式收集数据。我们还表明，URY神经元的谷氨酸受体在树突状运输其他货物，例如可以进行成像装置固定的动物（图3D，3E）。该设备还可以用于图像的细胞过程，在早期C.如Q神经母细胞分裂的L1动物线虫发展。 QR的成像细胞分裂形成两个子细胞QR.a和QR.p〜3小时孵化后（ 图3F）符合早期的观测28。
表1中。C 中使用的移动设备尺寸的流道（PDMS-1）和隔板PDMS层（PDMS-S） 线虫和果蝇 /斑马鱼设备。
图1。的遗传模式生物的PDMS微流体装置的示意图。 （A）的生物体被加载到所述流动通道，并使用微尖固定利用压缩氮气使用的调节器和阀的控制，。该设备适用于在倒置显微镜明场/荧光成像。该设计包括一个10毫米长的流道（设计I，L1）和一个控制通道（II设计，L2）分别为C. （B） 线虫 ， 果蝇 /斑马鱼幼虫（C）。的设计上的尺寸表示（B和C）。 （D，F，G）的各种原理图s的聚二甲基硅氧烷（PDMS-1，PDMS-2，PDMS膜，PDMS-S和玻璃）的层中存在的是 C。 线虫 ， 果蝇和斑马鱼的固定装置。 （E）的示意图的横截面的装置，表示批量PDMS层（PDMS-2），旋涂PDMS层（PDMS-1），以形成柔性膜和一个间隔件PDMS层（PDMS-S）添加的流路的高度（ 果蝇 /斑马鱼的移动设备）。被不可逆地接合到一个光学等级的玻璃盖片，以适应生物体（圈在棕色）的整体结构。的示意图表示高度的控制通道'H2'，流道“H1”，冲间隔层's'和膜厚度'M'。 （H）表示的流路中存在的液体柱的压力下在控制信道向膜偏转。明场图像是免费的（I）和偏转膜（J）所示，零和下加压14 psi的液体柱分别。箭头和箭头指示泡沫ü'下'和分别在所述流动通道的膜。 （K）横断面图像的C.线虫的移动设备的位置处的固定区域。比例尺为50μm（K）和200微米（I，J）。 （D，F，G）的 原理图是不进行缩放。 点击此处查看大图 。
图2。成像遗传模型生物体固定在微流体设备。明亮视场图像的固定化C.线虫 （A）中，第一龄果蝇幼虫（B）和30高倍视野斑马鱼幼虫（D）中的PDMS微流器件。 Kymograph分析时间推移显像的jsIs609的 ， 是 C。 线虫应变，表达了线粒体基质针对GFP的前的横向mechanosensory神经元（ALM）的设备immobil化动物（E）。线粒体被列为顺（“向下”箭头），逆行（“向上”箭头）和静止（“明星”标志）在kymograph。 （C）的荧光图像的一个完整的第一龄果蝇幼虫。框指示的位置中的胆碱能神经元进行高分辨率成像syt.eGFP运输时间推移。蒙太奇五帧与帧序号为5 Hz获取表示显示顺行，逆行在蒙太奇（F）和固定在每个图像和GFP标记的货物。 （D）中的方块表示的面积计算斑马鱼幼虫的心跳率监测。比例尺为5微米，10微米（E），（F）的100微米（A，B）和200μm（D）。
图3 C 中的细胞和亚细胞成像。 线虫使用PDMS微流体装置。 （A）蚂蚁示意图erior的横向mechanosensory（ALM）神经元的顺行和逆行方向标。虚线框表示该地区的轴突运输的成像。使用旋转盘共聚焦显微镜在细胞体（CB）的权利和神经环（NR）在左侧的5幅获得350帧。使用kymographs动物固定在一个设备，或使用1mM的左旋咪唑（C）的数据进行了分析。顺行和逆行方向的货物用箭头分别指向“向下”和“向上”。 （B）顺行和逆行的粒子通量在20μm区域的ALM神经元的超过350个时间推移帧UNC-104（e1265）动物的观察。 （D）URY神经元的示意图用于图像GFP标记的谷氨酸受体运输。 350时间推移成kymographs表明货物动物固定在PDMS中的移动设备中的顺行和逆行方向移动，或使用1mM的左旋咪唑（E）的帧被转换。时间推移获得的图像在问答神经母细胞二在早期幼虫阶段C.如何运用自己的眼光与迁移线虫 。 （F）三个时间推移框架的QR发生分裂，形成其的子细胞QR.a和QR.p.比例尺为5微米（C，E和F）。 （B）为代表的数据平均±SEM（N> 4）。比较与就在麻醉获得的值，并记为*（P <0.05），**（P <0.005）。
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Discussion
PDMS微流体装置是光学透明的，因此，可用于任何透明/半透明的模型生物体在体内成像的高分辨率。我们的设计是适合高倍率完整的活的动物细胞和亚细胞事件的时空成像。微细加工用软光刻技术，可轻松操作的模式生物的各种尺寸的设备尺寸。 C.不同阶段制造各种尺寸的移动设备线虫 ， 果蝇和斑马鱼幼虫。移动设备具有不同的高度为40μm和80μm，在其流层通道，可以显示出改进的固定化和更好的成像后的早期（L1）和购买健康（后期L4）的阶段C。线虫 。我们实现了100％的成功率，设备制造C.线虫和果蝇 /斑马鱼没有任何缺陷的设备。移动设备可以使用多次，直到控制信道被污染的灰尘颗粒或细菌的生长。设备固定C.线虫表现出更大的货物通量相比，麻醉动物在野生型和突变型的动物。设备固定，无需技术上具有挑战性的解剖协议，尤其是对早期发育阶段的果蝇幼虫29。
PDMS微流体装置中的瞬时固定协议有一个固有的优点，减少实验时间相比通常需要较长的曝光时间对从外部施加的麻醉药。所有固定生物体恢复到正常的运动后5-10分钟内释放压力的变形硅橡胶膜。C.线虫的边界处的流道和远离的固定化膜的中央部分被固定。动物固定在中间的流道健康状况不佳，后immobilizaTION，一两天内死亡。我们的微流器件已经被用来保持L4阶段C。线虫固定下长达一个小时的膜，而不会影响其健康或后续发展。固定为更短的时间（最多10分钟）的动物可以被困多次的成像。对于早期发育阶段，C.线虫固定稍低的压力较长期的时间推移实验（约3小时）（7 PSI）。固定膜下释放后的动物被留在干预的时间在同一装置中。这些动物是他们的发展和一般健康的野生型相媲美。成人C.线虫固定压力较低（7 PSI）呈缓慢漂移的高分辨率时间推移实验和运输分析需要复杂的分析工具。但较低的压力下被用来进行长期的研究，如Q神经母细胞分裂/迁移过来〜3小时或半定量细胞线粒体ondria运输特性，并不需要完整的固定的过程。根据需要被收集的数据集，所以在较低的压力，可使用的固定化。
L4 C.时间的推移成像线虫跳跃运动的GFP标记线粒体在ALM神经元（株jsIs609）的为已报道的其他模型系统的神经元在30-32。一些在这些神经元线粒体双向传输，而其中大部分是固定的持续时间的电影。尽管小的差异在不断变化，我们将继续使用14 PSI固定的压力情况下，C.线虫获得完整的固定，避免时间的推移高分辨率成像的轴突运输过程中的任何漂移。我们建议您使用一个通用的协议，并根据实验的需要，这可以增加或减少14磅。动物几乎相同的时间恢复到正常locomotio的n从更低和更高的固定化的压力和固定动物开发相同的生长不进行固化。
时，采用较 大的尺寸与间隔层的装置可用于诸如果蝇和斑马鱼幼虫更大的模型生物体。成像synaptotagmin.eGFP运输在完整的一龄果蝇感觉神经元顺行和逆行方向的主动运输。测量中的移动设备固定幼虫的平均速度高 于解剖运动神经元22中测得的值。这种差异可能产生更快的采集数据在我们的实验中（5赫兹V / S的1.1-1.4赫兹），神经元特异性的差异在细胞器运输（感官V / S的运动神经元的）和/或由于夹层的影响。
我们事先的实验进行了专门在野生型动物4，因此，我们确定是否在微流控设备的成像突变是有利的。时间的推移成像C.线虫 L4动物显示减少磁通GFP :: RAB-3标记的突触前囊泡在kinesin3/unc-104突变体固定在1.0mM的左旋咪唑相比，在动物中得到的固定化使用我们的PDMS的移动设备（ 图3B）的光通量的测量。我们经常观察到显示的一个例子（ 图3C），突变体中观察到很少的运输如果动物被固定使用麻醉剂的浓度固定野生型动物。泡在UNC-104动物显著较高时，我们使用微流体装置。麻醉动物表现出类似的传输特性时，放置在14psi压力下向的PDMS膜（ 图3B）。也可以观察到类似的现象在野生动物4。这些数据表明，增加的通量是没有可能产生即时动员下氮，但由于一个协议，这是破坏细胞内的运输。
其他活动，如钙动力学和细胞分裂的原则，都可以拍摄到完整的果蝇 /斑马鱼幼虫。成像后的恢复的装置固定动物生物体生存能力4是具有较少的危害，因此，这样的设备也可以被用来执行的事件发生在较长的时间尺度的遗传模型遗传生物体长期成像。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢果蝇股，Tarjani阿加瓦尔博士Krishanu雷为保持果蝇笼，彼得·若为nuIs25和CGC为C.的菌株。 SPK取得jsIs609在迈克尔·九重实验室。我们感谢他的帮助下，在微流体装置jsIs609动物的线粒体运输时间的推移成像Arpan Agnihotri（BITS Pilani的）。我们非常感谢博士瓦沙拉Thirumalai和Surya普拉卡什为我们提供了与斑马鱼的胚胎。我们感谢博士奎师那和CIFF NCBS支持部科学和技术中心的纳米技术（第SR/55/NM-36-2005）的旋转盘共聚焦显微镜的使用。我们也感谢Kaustubh劳，V. Venkatraman和雀塔那Sachidanand的进行讨论。这项工作是由DBT博士后研究（SM），DST快车道计划（SM）和DBT授予（SPK）。 SA的支持由DST和CSIR SPK补助金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
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