Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

התקני microfluidic פשוטים עבור Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה חופשיה

Abstract

מכשירי fluidic מייקר מפוברק לספק סביבת מייקרו נגישה למחקרי vivo על אורגניזמים קטנים. תהליכי ייצור פשוטים זמינים עבור התקני microfluidic באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות 1-3. התקני microfluidic שמשו במשך הדמית משנה הסלולר 4,5, in vivo ליזר microsurgery 2,6 וסלולרית הדמיה 4,7. בחי ההדמיה דורשת קיבוע של אורגניזמים. זו הושגה באמצעות שאיבה 5,8, ערוצים מחודדים 6,7,9, ממברנות deformable 2-4,10, יניקה עם קירור נוסף 5, הרדמת גז 11, ג'לים רגיש לטמפרטורה 12, דבק cyanoacrylate 13 והרדמה כגון levamisole 14 , בן 15. הרדמה נפוצה להשפיע על הולכה סינפטית 16,17 וידועים יש השפעות מזיקות על 4 הובלה עצביות משנה הסלולר. ברחוב זהג'ודי אנחנו מדגימים קרום בסיס פולי דימתיל-siloxane מכשיר (PDMS) המאפשר קיבוע ללא הרדמה של אורגניזמים מודל גנטיים תקינים כגון elegans Caenorhabditis (סי אלגנס), זחלי דרוזופילה וזחלי דג זברה. אורגניזמים מודל אלו מתאימים למחקרי vivo במכשירי microfluidic בגלל קוטרם הקטן והגופים שקופים אופטי או שקופים. קטרי גוף לנוע בין ~ 10 מיקרומטר ל ~ 800 מיקרומטר לשלבים מוקדמים של זחל ג זחלי elegans ודג זברה ודורש התקני microfluidic בגדלים שונים כדי להשיג קיבוע מלא ל הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות. אורגניזמים אלה משותקים באמצעות לחץ המופעל על ידי גז חנקן דחוס דרך עמודת נוזל וצלם באמצעות מיקרוסקופ הפוך. בעלי חיים ששוחררו מהמלכודת לחזור לתנועה רגילה בתוך 10 דקות.

אנחנו מדגימים ארבעה יישומים של הדמית זמן לשגות בג elegansכלומר, תחבורת הדמית המיטוכונדריה בתאי עצב, תחבורת שלפוחית ​​מראש הסינפטי בתחבורת תחבורה-פגומת מוטציה, קולטן הגלוטמט וחלוקת תא neuroblast ש. נתונים שהתקבלו מסרטים כאלה מראים שקיבוע microfluidic הוא אמצעי שימושי ומדויק של רכישה בנתוני vivo של אירועים הסלולר ומשנה הסלולר בהשוואה לחיות מורדמות (האיור 1J ו3C-F 4).

מידות מכשיר שונו כדי לאפשר הדמית זמן לשגות בשלבים שונים של ג elegans, תחילה זחלי instar דרוזופילה וזחלי דג זברה. הובלה של שלפוחית ​​מסומנים synaptotagmin מתויג עם GFP (syt.eGFP) בנוירונים חושיים תערוכות תנועה מכוונת של סמני שלפוחית ​​סינפטיים לידי ביטוי בתאי עצב תחושתיים כולינרגיות בזחלי תסיסנית שלמים 1 instar. מכשיר דומה כבר נעשה שימוש כדי לבצע הדמית זמן לשגות של פעימות לב ב~ הפרית הודעת שעה 30 (hpf)דג זברת זחלים. נתונים אלו מראים כי מכשירים הפשוטים שפתחנו ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מודל ללמוד כמה תאי תופעות ביולוגיות וההתפתחותי בגוף חי.

Protocol

1. SU8 ייצור מאסטר

  1. עצב את מבני microfluidic באמצעות תוכנת Clewin ולהדפיס אותו באמצעות פלוטר ליזר 65,024 dpi עם גודל תכונת מינימום של 8 מיקרומטר בסרט המעגלים.
  2. נקה 2 X 2 פרוסות סיליקון סנטימטר סנטימטר עם תחמוצת יליד 20% KOH ל1 דקות ולשטוף במי deionized; רקיק כל אחד לשכבה ושכבת זרימת השליטה המתאימה לו.
  3. תייבש את החתיכות עם גז חנקן ומייבש על צלחת חמה ב 120 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לאפשר לחתיכות כדי להתקרר לטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  4. חתיכות סיליקון מקום אחד בכל פעם על צ'אק טווה ולהדליק את הוואקום. מכסה את משטחי סיליקון עם ~ 20-disilazane hexamethyl μl (HMDS) ומעיילם באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 3000 סל"ד למשך 30 שניות.
  5. כיסוי פרוסות סיליקון לחלוטין עם ~ 1.5 מ"ל של SU8-2025 (http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) וופלי מעייל באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 2000 סל"ד למשך 30 שניות. פרוטוקול ספינינג זה מייצר עובי photoresist של ~ 40 מיקרומטר כי הוא מתאים לשליטה ולשכבות זרימה לשלבים מוקדמים של זחל ג elegans.
  6. ספין ~ 1.5 מ"ל SU8-2050 באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 2000 סל"ד למשך 30 שניות כדי להשיג עובי של photoresist ~ 80 מיקרומטר כי הוא מתאים לייצור שכבת זרימה לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans, שכבת זרימת בסיס לזחלי תסיסנית / דג זברה ושליטת השכבות המקבילות שלהם.
  7. הנח את חתיכות סיליקון על צלחת חמה עם השכבה המצופית SU8 על העליונה. לאפות רך את החלקים המצופים סיליקון ב65 ° C לדקות 1 ואחרי 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאפשר לחתיכות כדי להתקרר לטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  8. הנח את חתיכות סיליקון רכים אפויות על הבמה עם חשיפת SU8-2025 sur המצופהעל פניו העליונות פונה מנורת UV. השתמש במסכת התמונה עם עיצוב אני (L1, 1B איור) ועיצוב השני (L2, 1B איור) לשכבת הזרימה ודפוס שכבה מלאת בהתאמה לשלבים מוקדמים של זחל ג elegans. מניח את מסיכת צילום על גבי שכבת SU8 ולהבטיח את המסכה היא שטוחה על שכבת הציפוי. פתח את התריס של מנורת UV ולחשוף את SU8 ופלים רכים אפויים למנורת UV ואט ​​200 דרך מסיכת התמונה במשך 15 שניות.
  9. השתמש במסכת התמונה עם עיצוב אני (L1, 1B איור) ועיצוב השני (L2, 1B איור) בSU8-2050 חתיכות מצופות (מוכן בשלב 1.6) לפברק את השכבה ושכבת שליטת זרימה לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans. השתמש במסכת התמונה עם העיצוב אני (L1, התרשים 1C) ועיצוב השני (L2, התרשים 1C) לשכבת בסיס הזרימה ושליטת שכבת בהתאמה לזחלי תסיסנית / דג זברה על ופלים מצופים SU8-2050 (אני מוכןצעד n 1.6). לחשוף את SU8 משטחים באמצעות מסכת התמונה למנורת UV 200 ואט עבור 15 שניות.
  10. הנח את חתיכות סיליקון שנחשפו על פלטה עם שכבת הציפוי עליון. הודעה אופה את הפרוסות על 65 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 אחרי 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאפשר לחתיכות להתקרר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  11. לפתח את החלקים באמצעות פתרון המפתח SU8 למשך 20 דקות. יש לשטוף את החלקים בIso-Propyl אלכוהול (IPA) ולפוצץ גז חנקן באמצעות יבש.
  12. הנח את חתיכות סיליקון בתא ייבוש עם SU8 דפוס על גבי. מעייל חתיכות עם 50 μl של tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי silane בייבוש ל2 שעות.

אמצעי זהירות: קח את אמצעי בטיחות לטיפול כימי בזמן טיפול KOH, ציפוי photoresist ופיתוח. ציפוי האדים silane צריך להתבצע בתוך תא ייבוש באזור מאוורר. הגן SU8 להתנגד מחשיפת יתר לאור. להשתמש במשקפי מגן עם lig UVמקור HT.

2. ייצור עובש PDMS

  1. הכן 10:01 PDMS על ידי שילוב של 50 גרמו מתוך 184 בסיס Sylgard עם 5 גרם של סוכן ריפוי בכוס פלסטיק. מערבב את התוכן באופן ידני ל~ 3 דקות. דגת התערובת בתוך תא ייבוש כדי להסיר את כל בועות אוויר שנוצרו במהלך הערבוב.
  2. יוצק תערובת PDMS עבה 5 מ"מ מעל את פרוסות סיליקון עם SU8 דפוס של עיצוב השני, לשליטת שכבה, בעדינות, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. במקרה בועות נוצרות בעת השפיכה, דגת PDMS על SU8 הדפוס בואקום נמוך כדי להסיר את כל הבועות.
  3. מניח את פרוסות סיליקון עם דפוס SU8-2025 של עיצוב אני, שכבת הזרימה, על צ'אק טווה ולהפעיל את הוואקום כדי להחזיק אותם. לכסות את הוופלים עם ~ 1 מ"ל של תערובת PDMS ומעייל הוופלים באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 1500 סל"ד למשך 30 שניות.
  4. מעייל ~ 1 מיליליטר תערובת PDMS על פרוסות סיליקון עם 80 מיקרומטר דפוס SU8-2050 של עיצובי (L1, 1B איור), עבורשכבת זרימה לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד למשך 5 שניות אחרי 1000 סל"ד למשך 30 שניות. מעייל שכבה עבה של תערובת PDMS על חלקי סיליקון עם דפוס SU8-2050 של זרימת שכבת עיצובי (L1, התרשים 1C) לזחלי תסיסנית / דג זברה, באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד עבור 35 שניות.
  5. חתיכות אופות PDMS מצופות סיליקון בעיצוב ואני ופלים עם עיצוב השני מקבילה לבקרת שכבה המכילות PDMS לג זחלי elegans ו / או תסיסנית / דג הזברה בתנור הסעת אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
  6. גזור את קטע PDMS ממצע סיליקון המכיל SU8 הדפוס השני לג elegans ו / או זחלי תסיסנית / דג זברה באמצעות סכין חד. נקוב חור קטן בקוטר ~ 1 מ"מ בחלקו העליון של מאגר חיבור המלכודת העיקרית בעובש PDMS באמצעות אגרופן אריס.
  7. הנח את אגרוף PDMS הבלוק (המכיל עובש העבה 40 מיקרומטר לבקרהשכבת L2) על מגש פלסטיק, עם הצד היצוק של שכבת השליטה פונה כלפי מעלה. מניח את פרוסות סיליקון המצופות PDMS מכילים SU8 עיצוב של 40 מיקרומטר עבה שעל אותו המגש, עם המשטח המצופה PDMS פונה כלפי מעלה. הכנס את המגש בתוך החדר של שואב פלזמה ולהפעיל את הוואקום עבור 2 דקות. לאחר מכן, הפעל את כוח הפלזמה ולהנמיך את לחץ החדר עד החדר הופך ורוד בהירה בצבע. לחשוף את שני המשטחים לאוויר ואט פלזמה 18 תחת ואקום נמוך עבור 2 דקות.
  8. הנח את בלוק אגרוף PDMS הוצא מ80 מיקרומטר העבה SU8 אדון מכיל דפוס II לשלבים מאוחרים של זחל ג זחלי elegans או תסיסנית / דג זברה על מגש פלסטיק, עם הצד היצוק של שכבת השליטה פונה כלפי מעלה. הנח את הספין המקביל האפוי PDMS שכבת ציפוי על פרוסות סיליקון המכילות עיצוב עבה 80 מיקרומטר למועד מאוחר יותר ג שלבי elegans או זחלי תסיסנית / דג הזברה בו זמנית על אותו המגש עם ציפוי של PDMS שטוחurface פונה כלפי מעלה. השתמש באותו הפרוטוקול שהוזכר לעיל כדי לחשוף אותם לאוויר פלזמה.
  9. הנח את שני משטחי הפלזמה שטופלו במשך ג elegans ו / או זחלי תסיסנית / דג הזברה יחד עם לחץ עדין ואופה אותם בתנור הסעת אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  10. גזור את המכשירים המלוכדים ממצע סיליקון עם SU8 עיצובי לג elegans ו / או זחלי תסיסנית / דג זברה. חורי גישת Punch במאגרי הכניסה ויציאה של ערוץ הזרימה.
  11. הנח את תבנית PDMS מלוכדות על מגש פלסטיק לג elegans, עם הצד המעוצב של עיצוב שכבת הזרימה כלפי מעלה. תלוש נקי מכסה זכוכית (22 מ"מ X 22, עובי מס '1) ומניח אותו על אותו מגש הפלסטיק. הכנס את המגש המכיל עובש PDMS ותלוש כיסוי זכוכית בתוך חדר הפלזמה. לחשוף את המשטח התחתון PDMS של המכשיר ולהחליק מכסה זכוכית פלזמה עד 18 ואט אוויר בלחץ נמוך עבור 2 דקות. הנח את שני משטחי הפלזמה שטופלו בgenלחץ TLE ואופה אותם בתנור הסעת אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  12. תאחסן את המכשיר בסביבה נקיה לשימוש עתידי.

3. צעדים נוספים למכשיר תסיסנית / דג הזברה

  1. לחשוף את משטח זכוכית נקיה בגודל 2 סנטימטר 2 סנטימטר עם 50 μl של tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי silane בייבוש ל2 שעות.
  2. ספין ~ 1 מ"ל של תערובת 10:01 PDMS המוכן בשלב 2.1 על משטח זכוכית silanized באמצעות SPIN150 טווה ב500 סל"ד עבור 35 שניות. אופה את מצעי זכוכית המצופות PDMS בתנור אוויר חם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות עם המשטח המצופה פונה כלפי מעלה. אפשר שכבת PDMS להתקרר לטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
  3. אגרוף המצופית השכבה באמצעות אגרופן מתכת מותאמת אישית נבנה חד באמצע PDMS, כדי ליצור שכבת spacer PDMS. הצורה של אגרופן המתכת מיועדת דומה לעיצוב הזרימה לדרוזופילה / דג זברה (L1, התרשים 1C
  4. לחשוף את שכבת spacer PDMS ואחת מלוכדות בלוק (שכבת זרימה ושכבת שליטה, בצעה בשלב 2.9 עבור זחלי תסיסנית / דג זברה) לאוויר ואט פלזמה 18 באמצעות שואב פלזמה בואקום נמוך. הנח את שני משטחי הפלזמה שטופלו יחד ואופה אותם בתנור חם באוויר 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  5. חותך את המכשיר המלוכד מהזכוכית, חורי גישת ניקוב במאגרי הכניסה ויציאה והאג"ח זה למעידת כיסוי זכוכית (22 מ"מ X 22, עובי מס '1), תוך שימוש בשואב פלזמה כאמורה בשלב 2.11. זה היה לייצר מכשיר קיבוע לזחלי תסיסנית instar הראשונים עם גובה של ערוץ ~ 500 מיקרומטר. לזחלי דג זברה, לשכפל את תהליך ייצור שכבת spacer PDMS עם מליטת צעד נוסף. השכבה הכפולה של PDMS-S מייצרת ערוץ גובה של 900 מיקרומטר לזחלי 30 HFP דג זברה.

אמצעי זהירות: הימנע מחלקיקי אבק בייצור מכשיר. שתי פלזמה ניקתה משטחזה צריך להיות לגמרי אבק חופשי לקשירה נאותה. אחסן את המכשירים בתא ייבוש במצבים שבי חדר נקי מיוחד אינו זמין במטרה למזער הצטברות של חלקיקי אבק במכשירים.

4. שימוש PDMS ממברנה

  1. חבר קצה אחד של שפופרת מייקרו-Flex (קוטר פנימי ~ 1.6 מ"מ, קוטר חיצוני ~ 4.8 מ"מ) לרגולטור לחץ חנקן אספקת גז ואת הקצה השני למאגר המלכודת העיקרי באמצעות מחט 18 מד (קוטר חיצוני ~ 1.25 מ"מ) דבוק לצינור. ברזלים 3-דרך השתמשו באמצע חיבור הצינור מאפשרים יישום או שחרור של לחץ בקרום.
  2. מלא את הצינור מחובר למכשיר PDMS עם עמודת 10 סנטימטרים של מים מזוקקים לפני חיבורו למאגר של המלכודת העיקרית של ג מכשיר זחלי תסיסנית / דג זברת elegans ו / או.
  3. לסגור את השסתום של אספקת החנקן לקרוא 14 psi ולפקח על הממברנה של המלכודת העיקרית להסיט לכיוון הדואר ערוץ זרימה בהגדלה נמוכה של מיקרוסקופ הפוך. אורכה של עמודת המים בצינור מייקרו-Flex נדחס כל פעם הברזלים 3-הדרך פתוח. קצוות של הקרום הסיט נראים באור מועבר (איור 1 ט ו1J). סטיית ממברנה גורמת תזוזה של חלקיקי אבק / בועות תחת קרום PDMS ודוחפת אותם לגבולות הערוץ.
  4. חכה עד לפני הנוזל ממלא microchannel לחלוטין ללא כל אוויר לכוד.
  5. לשחרר את הלחץ על ידי שימוש בברזלים 3-דרך להירגע הקרום למצב ההמנוח שלו.

5. הכנסת ג זחלי elegans, דרוזופילה ודג זברה לתוך המכשיר ולשתק אותם מתחת לממברנה PDMS הגמישה

  1. מלאו ערוץ הזרימה עם M9 חיץ [3 גרמו KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 ז MgSO 4, H 2 O ל 1 ליטר, לעקר ידי autoclaving] לג PBS elegans 18 או 1X [8 גרם NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 גרם Na 2 4 HPO, 0.24 גרם KH 2 PO 4, H 2 O ל 1 ליטר, לעקר ידי מעוקר] לזחלי תסיסנית / 19 דג זברה למשך 10 דקות לפני ניסוי.
  2. אתר יחיד ג elegans של שלב הנדרש על צלחת NGM 18 (או זחלי תסיסנית instar ראשונים מצלחת אגר ביצה או הזחלים ידניים dechorionated 30 hpf דג זברה בנוזל 20) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו הגדלה נמוכה. בחר חיה יחידה באמצעות נפח קטן של חיץ לפתרון קצה מייקרו. השתמש בקצה מייקרו עם סיומה לחתוך כדי להתאים תסיסנית הגדולה או זחלי דג זברה במאגר.
  3. דחוף את האורגניזם הבודד דרך כניסת ערוץ הזרימה. התאם את לחץ pipetting כדי למקם את חית הפרט תחת המלכודת העיקרית.
  4. להגביר את הלחץ של PDMS הקרום לאט כדי למקם את החיה נגד צ'אןגבול nel ולשתק אותו עם לחץ 14 psi לג elegans, 7 psi לדרוזופילה ו3 psi לזחלי דג זברה.
  5. מקם את החיה המשותקת במרכז השדה המיקרוסקופי של תצוגה. השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדרות רצויות עבור שדה ברזולוציה גבוהה בהיר או דימות פלואורסצנטי. לרכוש תמונות בודדות או קרינת זמן לשגות בקצב מסגרת מוגדר מראש.
  6. שחרר את לחץ המלכודת ולפקח על התנועה של בעלי החיים לדקות 5-10 בהגדלה נמוכה.
  7. יש לשטוף את החיה ולהכניס בעלי חיים טריים לחזור על השלבים לעיל.
  8. שטוף את כל החיות ממאגר הפסולת באמצעות מים מזוקקים מיושמים באמצעות מזרק. ייבש את הערוץ על ידי דחיפת אוויר באמצעות מזרק לשימוש חוזר בעתיד.

אמצעי זהירות: בעלי חיים הדורשים לחץ גבוה pipetting לזרום בתוך הערוץ העיקרי נוטה להראות תנועה / בריאות לקויה לאחר שחרורו מהמלכודת ויש להימנע לimaגינג. נקה את ערוץ זרימה לכל שמץ של חיץ כדי למנוע סתימה של ערוץ על ידי גבישים. אם שמן משמש להדמיה ברזולוציה גבוהה, לנקות את תלוש כיסוי הזכוכית כדי להיות מסוגל לשמור על אות טובה יחס רעש לניסויים באים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מכשיר הקיבוע הוא בלוק bilayer PDMS המפוברק על ידי שתי שכבות מליטות: שכבת זרימה (שכבה 1) ושכבת שליטה (שכבה 2) כפי שמוצג באיור 1. המלכודת הראשית מחוברת לבלון גז חנקן באמצעות רגולטור וזין תחנה 3-דרך ליישם את הלחץ דרוש (3-14 psi) על גבי הקרום דרך עמודת נוזל (איור 1 א). הקרום הסיט immobilizes ג זחלי elegans, דרוזופילה או דג זברה בערוץ הזרימה מתוכננת עם ממדים שונים (התרשים 1B ו1C). מסכות תמונה משמשות לעצב שכבות מכשיר קיבוע בגיאומטריות שונות לג elegans (1D איור), זחלי דרוזופילה (האיור 1F) וזחלי דג זברה (האיור 1G). הגובה של שכבת ערוץ הזרימה (H1 באיור 1E, 1K) היה מגוון באמצעות מהירויות ציפוי ספין שונות כדי להתאים אוganisms בקטרים ​​שונים בתוך ערוץ הזרימה. גבה שכבת זרימה היו מפוברקים ב40 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 500 מיקרומטר ו 900 מיקרומטר לג שלבי elegans זחל הבוגר, ג elegans, תחילה זחלי instar דרוזופילה וזחלי דג זברת בהתאמה (טבלה 1). המכשיר עם גובה ערוץ זרימה של 40 מיקרומטר הוא מתאים מL1 לתחילת L4 ג זחלי elegans. מכשיר עם גובה ערוץ זרימת מיקרומטר 80 משמש לזחלי L4 מאוחר והמבוגר ג elegans כאשר הפות מתחילה לבלוט. מכשירי דג הזברה הגדולים יכולים לשמש גם לזחלי תסיסנית מבוגרות. עובי קרום PDMS (מ ') היה מפוברק ב40 מיקרומטר ו 300 מיקרומטר לג elegans ומכשירים תסיסנית / דג זברת בהתאמה. גובו של ערוץ microfluidic בשכבה 2 היה מפוברק ב40 מיקרומטר לשלבים מוקדמים של זחל ג elegans ו80 מיקרומטר לשלבים מאוחרים של זחל ג elegans ותסיסניתזחלים / דג זברה. גובו של ערוץ הזרימה, הקרום וערוץ שליטה נמדד במכשירים המפוברקים בקבוצות עצמאיות מרובות ונמצאו להיות עקבי בתוך ± 5 מיקרומטר אחד של השני. המכשיר משתמש בטכניקת הסטת קרום (איור 1H-J) כדי לשתק אורגניזמים בערוץ הזרימה.

אורגניזמים זרימה בתעלות (PDMS-1) ספין תנאים לערוץ זרימה Spacer PDMS (PDMS-S) תנאי ספין לspacer PDMS לחץ Immobilization (psi)
סי אלגנס (L1 לתחילת L4) 40 מיקרומטר (SU8-2025) 500 סל"ד (5 שניות), 2000 סל"ד (30 שניות) NA NA 14
סי אלגנס (L4 ומבוגרים המאוחרים) 80 μ מ '(SU8-2050) 500 סל"ד (5 שניות), 2000 סל"ד (30 שניות) NA NA 14
דרוזופילה (1 instar) 80 מיקרומטר (SU8-2050) 500 סל"ד (5 שניות), 2000 סל"ד (30 שניות) 400 מיקרומטר (PDMS) 500 סל"ד (35 שניות) 7
דג זברה (30 hpf) 80 מיקרומטר (SU8-2050) 500 סל"ד (5 שניות), 2000 סל"ד (30 שניות) 2X 400 מיקרומטר (PDMS) 500 סל"ד (35 שניות) 3

לוח 1. מידות מכשיר של ערוץ הזרימה (PDMS-1) וspacer PDMS השכבה (PDMS-S) בשימוש בג elegans ומכשירים תסיסנית / דג זברה.

L4 זחלי אלגנס היו משותקים במכשיר 80 מיקרומטר ערוץ גובה PDMS microfluidic שימוש בגז חנקן psi 14 (איור 2 א). זמן לשגות פלואורסצנטי התמונות wפה רכש במהירות של 2 מסגרות לשנייה (fps) באמצעות אובייקטיבית 60x (צמצם מספרי 1.4, אובייקטיבי שמן) להובלת הדמיה של המיטוכונדריה דמיין באמצעות GFP ממוקד מטריקס המיטוכונדריה בתאי העצב הקולטני המגע 21. כל 400 המסגרות הומרו לkymographs באמצעות ImageJ (www.rsbweb.nih.gov / ij) והמיטוכונדריה סווגו כמכוון anterogradely (הרחק מגוף התא), retrogradely בימוי (לכיוון גוף התא) או נייח (2E איור). אנו הבחנו תחבורת המיטוכונדרי עד 21 psi של לחץ קיבוע, אבל השטף הוא קצת יותר בלחץ הקיבוע הנמוך ביותר. שטף האנטרוגרד והמדרדר של המיטוכונדריה נמדד להיות 1.1 ± 0.23 ו -1.6 ± 0.22 ב 7 PSI ואילו 0.8 ± 0.25 ו -1.2 ± 0.34 בגיל 14 לחץ קיבוע psi. הערכים לא היו שונים סטטיסטית מ1.1 ± 0.33 ו -1.3 & plusmn; 0.42 מתקבל מחיות משותקת באמצעות levamisole 3 מ"מ (P-ערכים> 0.45, n = 30 בעלי חיים).

המכשירים הגדולים עם גובה 500 מיקרומטר ניתן להשתמש כדי לשתק זחלים ראשונים instar דרוזופילה (איור 2 ב ') וזחלי דג זברת hpf 28-30 (האיור 2D). נתיחה של זחלי תסיסנית instars הראשונים יכולה להיות מאתגרת. בניגוד למכשירי microfluidic לספק שיטה לביצוע שדה ברזולוציה גבוה בהיר ו / או דימות פלואורסצנטי באמצעות אורגניזמים שלמים. זחלי תסיסנית פרט היינו משותקים באמצעות 7 psi של גז חנקן דחוס (התרשים 2B, טבלת 1) ותמונות של קרינת תחבורת synaptotagmin.eGFP בתאי עצב תחושתיים נרכשו (האיור 2C). סרטי זמן לשגות הראו מטען ניכר synaptotagmin נע ונייח בתאי עצב תחושתיים (האיור 2F). מהירות הממוצעת האנטרוגרד ומדרדר נמדדה מKymographs להיות 0.92 ± 0.04 מיקרומטר / s ו 1.00 ± 0.05 מיקרומטר / s בהתאמה (n = 6 חיות, n> 40 קטעים). אלה הם דומים למהירויות של שלפוחית ​​תחבורה נשאה synaptotagmin נמדדה בתאי עצב מוטורי גזורים תסיסנית הנעים הן anterogradely (0.84 ± 0.05 מיקרומטר / s) וretrogradely (0.76 ± 0.03 מיקרומטר / s) 22.

מכשירים דומים עם גובה 900 מיקרומטר שמשו כדי לשתק שלבים שונים של זחלי דג זברה (האיור 2D, טבלת 1). זחלי דג זברה בשלבי ההתפתחות המוקדמים שלה מניפים את הזנב שלה כל 10 עד 15 שניות והם בדרך כלל משותקים באמצעות 0.02% tricaine (MS-222) בפתרון או בתקשורת גוברת לרזולוציה גבוהה 23 הדמיה. מכשיר PDMS מספק אמצעי חלופי לקיבוע מהיר ומבטל את הצורך של מדיום הרכבה לא אמין בנתיב האופטי ברזולוציה גבוהה 24 הדמיה. אנחנו באופן ידני dechorionated 28-30 זחלי hpf וקבע אותם באופן אישי במכשיר PDMS שימוש בגז חנקן psi 3 לרכוש סרטי זמן לשגות של פעימות לב זחל. קצב פעימות הלב נמדד להיות 136.8 ± 1.6 לדקות (N = 8 סרטים) והיה דומים לדיווחים שהתפרסמו אחרים 25.

מכשיר microfluidic הפשוט שלנו כבר הוכיח למדידת מגוון אירועים תת סלולריים וסלולריים בסוג C. הפראי elegans 4. במכשיר microfluidic, הפראי הסוג ג elegans להראות מספר גדול יותר של מטען, כגון שלפוחית ​​סינפטיים הנעות בתאי עצב בהשוואה לבעלי חיים שהם חסרי יכולת תנועה באמצעות הרדמה. עם זאת, אנו לא נבדקנו המכשירים שלנו לבעלי חיים מוטנטים כדי לראות אם ממצאים אלה נכונים גם. כדי לבחון זאת הייתי מוטצית hypomorphic חזקה בkinesin3 / UNC-104 מנוע מולקולרי, UNC-104 (e1265), שמעביר שלפוחית ​​מראש סינפטיים 26. אנחנו לעומת השטף של ה-GFP :: ראב-3 מראש הסינפטי vesi הניכרcles בנוירונים קדמיים צדדיים mechanosensory בהרדמה המשותק ומכשיר משותק aniamls מוטציה (איור 3 א). שטף של שלפוחית ​​מראש סינפטיים היה שטף גדול יותר בבעלי חיים חסרי יכולת תנועת מכשיר בהשוואה לנתונים שנרכשו מבעלי חי UNC-104 מורדמים בlevamisole mM 1 (האיור 3B, 3C) 27. זה מראה כי מוטציות הדמיה חזקות תחבורה פגומות במכשירי microfluidic עשויה להיות אמצעי יעיל יותר לאיסוף נתונים. אנו גם מראים כי הובלת מטענים אחרות כגון הדנדריטים של קולטני גלוטמט בתאי עצב אורים ניתן הדמיה במכשיר חסר יכולת תנועת בעלי חיים (האיור 3D, 3E). מכשיר יכול לשמש גם לתהליכי תמונה סלולריים במהלך המוקדם ג פיתוח elegans כגון חלוקת neuroblast Q בחי L1. תא QR שצלם לחלק כדי ליצור שני תאים הבת QR.a וQR.p ~ 3 שעות לאחר בקיעה (איור 3F) עולה בקנה אחד עםתצפיות קודמות 28.

לוח 1. מידות מכשיר של ערוץ הזרימה (PDMS-1) וspacer PDMS השכבה (PDMS-S) בשימוש בג elegans ומכשירים תסיסנית / דג זברה.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של מכשירי PDMS microfluidic לאורגניזם מודל גנטי. () האורגניזם נטען באמצעות מייקרו טיפ לערוץ הזרימה ומשותקת באמצעות גז חנקן דחוס נשלט באמצעות רגולטור ושסתום. המכשיר מתאים להדמית שדה / פלואורסצנטי בהיר במיקרוסקופ הפוכה. העיצוב מורכב מערוץ 10 מ"מימ ארוכי זרימה (עיצובי, L1) וערוץ בקרה (עיצוב השני, L2) בהתאמה לג זחלי elegans (B) ותסיסנית / דג זברה (C). המידות מצוינות בעיצוב (B ו-C). (D, F, G) סכמטי של variouשכבות s של PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS הקרום, PDMS-S וזכוכית) תצגנה בג elegans, דרוזופילה ומכשיר קיבוע דג זברה. (ה) ייצוג סכמטי של חתך של המכשיר מראה PDMS שכבת התפזורת (PDMS-2), ספין מצופת שכבת PDMS (PDMS-1) לטופס קרום גמיש וspacer PDMS שכבה (PDMS-S) כדי להוסיף גובה לערוץ הזרימה (למכשיר תסיסנית / דג זברה). המבנה כולו הוא קשור באופן בלתי הפיך לפליטה אופטית כיתת מכסה זכוכית כדי להתאים את האורגניזם (העיגול בצבע חום). סכמטי מציין גובה של 'h2' ערוץ הבקרה, 'h1' זרימה בתעלות, של 'שכבת spacer אגרופים ועובי הקרום' מ '. (H) מציין את הסטייה לכיוון קרום ערוץ הזרימה בנוכחות עמודת נוזל בלחץ בערוץ הבקרה. תמונות שדה בהירות מוצגות בקרום חופשי (אני) ומוסח (J) תחת אפס ו14 psi בלחץ עמוד נוזל בהתאמה. החץ וראש החץ מצביעים על הבועה under ומתוך הקרום בערוץ זרימת בהתאמה. (K) תמונת חתך צלב של ג מכשיר elegans נלקח במיקום של אזור הקיבוע. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר (K) ו 200 מיקרומטר (אני, J). Schematics (D, F, G) הם לא בקנה מידה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. אורגניזמים מודל גנטיים הדמיה משותקת במכשיר microfluidic. תמונת שדה בהירה של ג משותק elegans (), הזחלים ראשונים instar דרוזופילה (B) וזחלי 30 hpf דג זברה (ד ') במכשיר microfluidic PDMS. ניתוח רשם גלים של זמן לשגות הדמיה של jsIs609, ג מתח elegans, המבטא GFP ממוקד מטריקס המיטוכונדריה בmechanosensory נוירון רוחב קדמי (ALM) של המכשיר immobilבעלי חי ized (E). המיטוכונדריה מסווגת כאנטרוגרדית (ראש 'מטה' חץ), מדרדר (ראש 'מעלה' חץ) ונייח (סימן "כוכב") ברשם הגלים. (ג) תמונת קרינה של זחל תסיסנית שלמה 1 instar. התיבה מציינת את המיקום שבו הדמיה ברזולוציה גבוהה של זמן לשגות syt.eGFP תחבורה מתבצעת בנוירון כולינרגית. מונטאז' של חמישה פריימים שנרכשו בשעת 5 רץ עם מספרי מסגרת הצביע על כל תמונה ומטען GFP ניכר מוצגת כהאנטרוגרד, מדרדר ונייח במונטאז' (F). התיבה ב( ד ') מציינת את האזור שהיה פיקוח לחישוב שיעור של פעימות לב של זחלי דג זברה. סרגל קנה מידה הוא 5 מיקרומטר (F), 10 מיקרומטר (E), 100 מיקרומטר (A, B) ו 200 מיקרומטר (ד ').

איור 3
איור 3. הדמיה ניידת ומשנה הסלולר בג elegans באמצעות מכשירי PDMS microfluidic. () סכמטי של נמלהmechanosensory נוירון רוחב erior (ALM) עם כיווני האנטרוגרד ומדרדר מסומן. התיבה המקווקות מראה את האזור צלם עבור הובלת אקסונלית. 350 מסגרות נרכשות באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב ב 5 fps עם גוף תא (CB) על הטבעת הנכונה ועצבים (ע"נ) בצד השמאל. נתונים נותחו באמצעות kymographs לבעלי החיים המשותקים במכשיר או באמצעות levamisole 1 מ"מ (C). מטען נע בכיווני האנטרוגרד ומדרדר מוצג באמצעות חצים בכיוון 'למטה' ו 'עד' בהתאמה. (ב) שטף האנטרוגרד ומדרדר של חלקיקים שנצפו בUNC-104 (e1265) בעלי חיים באזור 20 מיקרומטר של ALM נוירון מעל 350 מסגרות זמן לשגות. (ד) סכמטי של נוירון אורים משמש לתמונת GFP מסומן תחבורה קולטנית גלוטמט. 350 מסגרות זמן לשגות מומרות לkymographs שמראה מטען נע בכיווני האנטרוגרד ומדרדר בבעלי החיים חסרי יכולת תנועה במכשיר PDMS או באמצעות levamisole 1 מ"מ (E). זמן לשגות תמונות שנרכשו במהלך ש neuroblast דיחזון והגירה בשלבים מוקדמים של זחל ג elegans. (F) שלוש מסגרות זמן לשגות שמראות חלוקה עוברת QR על מנת לייצר תאי הבת שלה QR.a וQR.p. סרגל קנה מידה הוא 5 מיקרומטר (C, E ו-F). נתונים המוצגים ב( B) ממוצע ± SEM (n> 4). השוואות נעשות ביחס לערכים שהתקבלו בהרדמה וכונו על ידי * (p <0.05) ו** (p <0.005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התקני microfluidic PDMS הם שקופים אופטי ולכן ניתן להשתמש בו לרזולוציה גבוהה בתחום הדמית vivo של כל אורגניזם מודל שקוף / שקוף. התכנון שלנו הוא מתאים להדמית הגדלה גבוהה זמנית spatio של אירועים הסלולר ומשנה הסלולר בבעלי חיים שלמים. Microfabrication באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות מאפשר מניפולציה קלה של מידות מכשיר לגדלים שונים של אורגניזם מודל. מכשירים בגדלים שונים מיוצרים עבור שלבים שונים של ג elegans, זחלי דרוזופילה וזחלי דג זברה. התקנים עם גבהים שונים של 40 מיקרומטר ו 80 מיקרומטר בערוצי שכבת זרימתם להראות קיבוע משופר ובריאות טובה יותר לאחר הדמיה של שניהם מוקדם (L1) ומאוחר יותר (מאוחר L4) שלבי ג elegans בהתאמה. אנו להשיג 100% הצלחה בייצור המכשיר לג elegans ותסיסנית / דג זברה ללא כל מכשירים פגומים. מכשירים ניתן להשתמש מספר פעמים עדערוץ הבקרה מזוהם עם חלקיקי אבק או צמיחת חיידקים. מכשיר משותק ג elegans להראות שטף מטען גדול יותר הוא בסוג פראי וחיות מוטנטים בהשוואה לבעלי חי anesthesized. קיבוע מכשיר מבטל את הצורך בפרוטוקולי נתיחה טכנית מאתגרים במיוחד לשלבי התפתחות מוקדמים של זחלי תסיסנית 29.

פרוטוקולי קיבוע מיידיים במכשירי PDMS microfluidic יש יתרון גלום בהפחתת זמן ניסוי, בהשוואה לזמני החשיפה הארוכים יותר בדרך כלל נדרשים לחומרי הרדמה לשימוש חיצוני. כל היצורים חסרי יכולת התנועה לחזור לתנועה נורמלית תוך דקות 5-10 לאחר שחרורו של לחץ על קרום PDMS העיוות. ג elegans הם משותק בגבול של ערוץ הזרימה והרחק מהחלק המרכזי של קרום הקיבוע. בעלי החיים חסרי יכולת תנועה באמצע ערוץ הזרימה להראות בריאות לקויה לאחר immobilization ומתים תוך יום או ימים. מכשיר microfluidic נעשה שימוש כדי לשמור L4 השלב ג elegans משותק עד שעה תחת הקרום מבלי להשפיע על בריאותו או התפתחות המאוחרת יותר. בעלי החיים חסרי יכולת תנועה לזמנים קצרים (עד 10 דקות) יכולים להיות לכוד מספר פעמים להדמיה. לשלבי התפתחות מוקדמים, ג elegans הייתי משותק עם לחץ נמוך במעט (7 psi) לניסויי זמן לשגות טווח ארוכים (~ 3 שעות). בעלי החיים משותקים תחת לאחר שחרור הקרום נשארו באותו המכשיר בזמן להתערב. בעלי חיים אלה הם דומים לסוג פראי בשניהם התפתחותם ועל הבריאות כללית. המבוגרים ג elegans משותק עם לחץ נמוך (7 psi) הראה סחיפה איטית במהלך ניסויים ברזולוציה גבוהה זמן לשגות ודורש כלי ניתוח מורכבים לניתוח תעבורה. עם זאת לחצים נמוכים שמשו לביצוע מחקרים לטווח ארוך יותר כגון חטיבה ש neuroblast תא / הגירה על ~ 3 שעות או mitoch כמותית למחצהאפיון תחבורת ondria; תהליכים שלא זקוק לקיבוע מלא. לחצים כך נמוכים יותר של קיבוע ניתן להשתמש בהתאם לערכת הנתונים שצריכה להיות שנאסף.

הדמית זמן לשגות של L4 ג elegans תערוכות תנועה קופצנית של ה-GFP מסומן במיטוכונדריה ALM נוירון (זן jsIs609) כפי שכבר דיווח לנוירונים במערכות מודל אחרות 30-32. חלק המיטוכונדריה בנוירונים אלה מראה תחבורה דו כיוונית בעוד שרובם הם נייחים על משך הזמן של הסרט. למרות ההבדלים הקטנים בשטף אנו ממשיכים באמצעות לחץ קיבוע psi 14 במקרה של ג elegans להשיג קיבוע מלא ולהימנע מכל סחף בהדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות בתחבורת אקסונלית. אנו מציעים להשתמש ב14 psi בפרוטוקול כללי ובהתאם לצרכי ניסוי זה יכול להיות מוגבר או מופחת. בעלי חיים לקחו כמעט באותו הזמן לחזור לlocomotio הנורמליn משני לחצי קיבוע נמוכים יותר וגבוהים יותר ובעלי חיים חסרי יכולת תנועה פתח זהה לאלה גדלו ללא קיבוע.

מכשיר כאשר מפוברק באמצעות ממדים גדולים יותר עם ​​שכבות spacer יכול לשמש לאורגניזם מודל גדול כגון דרוזופילה וזחלי דג זברה. הדמיה של תחבורת synaptotagmin.eGFP בנוירונים שלמים 1 instar תסיסנית חושיים מראה תחבורה פעילה בכיוונים הן האנטרוגרד ומדרדר. המהירויות הממוצעות שנמדדו במכשיר זחלים משותקים הן גבוהה יותר בהשוואה לערכים שנמדדו בתאי עצב מוטוריים גזורים 22. הבדל זה עשוי לנבוע מרכישה מהירה יותר של נתונים בניסויים שלנו (5 ההרץ v / s 1.1-1.4 הרץ), הבדלי נוירון ספציפיים באברון תחבורה (חושיים v / s מנוע נוירונים) ו / או את ההשפעות עקב נתיחה.

הניסויים הקודמים שלנו בוצעו באופן בלעדי בחיות מסוג פרא 4, ובכך קבענו האםמוטנטים הדמיה במכשירי microfluidic היה גם יתרון. זמן לשגות הדמיה של ג elegans L4 בעלי החיים מראים מופחת שטף של ה-GFP :: ראב-3 שלפוחית ​​מסומנת מראש סינפטיים בkinesin3/unc-104 מוטנטים המשותקים בlevamisole mM 1.0 בהשוואה למדידות שטף המתקבלים בבעלי חיים חסרי יכולת תנועה באמצעות מכשיר PDMS (איור 3 ב '). לעתים קרובות אנו רואים ולהראות דוגמה (האיור 3C) כי במוטנטים מאוד הובלה קטנה הוא ציינה אם בעלי חיים משותקים באמצעות ריכוזי הרדמה ומנטרלים חיות מסוג ברה. המספרים של שלפוחית ​​נעה ב- 104 UNC בעלי חיים הם גבוה באופן משמעותי כאשר אנו משתמשים במכשירי microfluidic. חיות מורדמות להראות מאפייני תחבורה דומים, כאשר הניחו תחת לחץ 14psi להחיל PDMS הקרום (איור 3 ב '). תצפיות דומות גם נעשו בחיות מסוג פרא 4. נתונים אלה מראים כי השטף המוגבר לא סביר שנובע מimהתגייסות תחת חנקן אך בשל פרוטוקול שהיה מזיק פחות להובלת תוך התאית.

באופן עקרוני, אירועים אחרים כגון דינמיקת סיד וחלוקת תא יכולים להיות צלמו בכל זחלים שלמים תסיסנית / דג הזברה גם כן. התאוששות שלאחר ההדמיה של בעלי חיים חסרי יכולת תנועת מכשיר היא פחות מזיקה לכדאיות האורגניזם 4 ובכך מכשירים כאלה יכולים לשמש גם לביצוע הדמיה לטווח הארוך של אורגניזמים גנטיים מודל גנטיים לאירועים המתרחשים על פני טווחי זמן ארוכים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר Krishanu ריי למניות תסיסנית, Tarjani Agarwal לשמירת תסיסנית כלוב, פיטר Juo לnuIs25 וCGC לג זני elegans. SPK עשה jsIs609 במעבדתו של מייקל התשיעייה. אנו מודים Arpan Agnihotri (Pilani BITS) על עזרתו בזמן לשגות הדמיה של תחבורת מיטוכונדריה של jsIs609 בעלי חיים בהתקני microfluidic. אנו מודים לד"ר Vatsala Thirumalai וסורייה פראקאש שספק לנו עוברי דג זברה. אנו מודים לד"ר קרישנה וCIFF בבנק המרכזי לאומי לשימוש במיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב נתמך על ידי משרד מדע וטכנולוגיה, המרכז לננוטכנולוגיה (מס SR/55/NM-36-2005). אנו מודים גם לKaustubh ראה, ו 'Venkatraman וChetana Sachidanand לדיונים. עבודה זו מומנה על ידי מלגת DBT פוסט הדוקטורט (SM), ערכת מסלול מהיר DST (SM) וDBT מענק ל( SPK). SA נתמך על ידי מענקי DST וCSIR לSPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Bioengineering גיליון 67 ביולוגיה מולקולרית מדעי המוח מיקרופלואידיקה, זחלי דג זברה הרדמה תחבורת שלפוחית ​​מראש הסינפטי תחבורת הדנדריטים של קולטני גלוטמט תחבורת המיטוכונדרי synaptotagmin תחבורה פעימות לב
התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter