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Bioengineering

Simple Dispositifs microfluidiques pour Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit

Abstract

Micro fabriqués dispositifs fluidiques fournir un accès micro-environnement pour les études in vivo sur de petits organismes. Procédés de fabrication simples sont disponibles pour dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie douce 1-3. Dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour les sous-imagerie cellulaire 4,5, in vivo microchirurgie au laser et imagerie cellulaires 2,6 4,7. L'imagerie in vivo nécessite l'immobilisation des organismes. Ceci a été réalisé en utilisant une aspiration 5,8, 6,7,9 canaux coniques, des membranes déformables, 2-4,10 aspiration avec refroidissement supplémentaire 5, gaz anesthésique 11, gels sensibles à la température 12, 13 et colle cyanoacrylate anesthésiques tels que le lévamisole 14 , 15. Anesthésiques couramment utilisés influencer la transmission synaptique 16,17 et sont connus pour avoir des effets néfastes sur la sous-cellulaire 4 transport neuronal. Dans cette èreudy nous démontrons une membrane à base de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) dispositif qui permet l'immobilisation sans anesthésie intactes organismes modèles génétiques telles que Caenorhabditis elegans (C. elegans), larves de drosophile et les larves de poisson zèbre. Ces organismes modèles sont adaptés pour des études in vivo dans des dispositifs microfluidiques en raison de leurs faibles diamètres et des organismes optiquement transparents ou translucides. Diamètres de corps vont de ~ 10 um à 800 um ~ pour les premiers stades larvaires de C. larves elegans et le poisson zèbre et nécessitent des dispositifs microfluidiques de tailles différentes pour atteindre une immobilisation complète pour la résolution imagerie time-lapse élevé. Ces organismes sont immobilisés en utilisant la pression appliquée par l'azote gazeux comprimé à travers une colonne de liquide et imagée à l'aide d'un microscope inversé. Animaux libérés du piège de revenir à la locomotion normale dans les 10 min.

Nous démontrons quatre applications imagerie time-lapse en C. elegansnommément imagerie mitochondriale de transport dans les neurones, le transport vésiculaire présynaptique dans un transport défectueux mutant, le transport des récepteurs du glutamate et de la division cellulaire Q neuroblastes. Les données obtenues à partir de ces films montrent que l'immobilisation microfluidique est un moyen utile et précise de l'acquisition de données in vivo d'événements cellulaires et sub-cellulaires par rapport aux animaux anesthésiés (figure 1J et 3C-F 4).

Dimensions de l'appareil ont été modifiées pour permettre imagerie time-lapse de différents stades de C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre. Transport de vésicules marquées par synaptotagmine marqués à la GFP (syt.eGFP) dans les neurones sensoriels montre mouvement dirigé des marqueurs de vésicules synaptiques cholinergiques exprimés dans les neurones sensoriels de larves de premier stade intacte chez la drosophile. Un dispositif similaire a été utilisée pour effectuer imagerie time-lapse de battement de coeur dans ~ 30 heures après la fécondation (HPF)poisson-zèbre larves. Ces données montrent que les dispositifs simples que nous avons développées peuvent être appliquées à une variété de systèmes modèles pour étudier les phénomènes cellulaires plusieurs biologiques et de développement in vivo.

Protocol

1. SU8 Fabrication Maître

  1. Concevoir les structures microfluidiques utilisant le logiciel Clewin et l'imprimer en utilisant 65.024 traceur laser DPI avec taille minimum de 8 um sur le film du circuit imprimé.
  2. Nettoyer 2 cm X 2 cm de plaquettes de silicium avec oxyde natif dans 20% KOH pour 1 min et rincer à l'eau déminéralisée; une plaquette pour chaque couche de l'écoulement et sa couche de contrôle correspondant.
  3. Sécher les pièces avec de l'azote gazeux et déshydrater sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 4 heures. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l'étape suivante.
  4. Morceaux de silicium lieu une à la fois sur le métier à filer et tourner mandrin sur le vide. Couvrir les surfaces de silicium avec ~ 20 pl hexaméthyldisilazane (HMDS) et les enrober à l'aide d'un. SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 3.000 tours par minute pendant 30 sec
  5. Couvrir des tranches de silicium complètement avec ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) et des plaquettes en utilisant le manteau SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 sec. Ce protocole de filage produit une épaisseur de photoréserve ~ 40 um qui est approprié pour la commande d'écoulement et les couches pour les premiers stades larvaires de C. elegans.
  6. ~ 1,5 ml de spin SU8-2050 en utilisant SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 2.000 tours par minute pendant 30 secondes pour obtenir une épaisseur de résine photosensible ~ 80 um qui est adapté à la fabrication de la couche d'écoulement de fin stades larvaires de C. elegans, la couche basale de débit pour Drosophila / poisson zèbre larves et leurs niveaux de contrôle correspondants.
  7. Placez les morceaux de silicium sur plaque chauffante avec la couche SU8 couché sur le dessus. Souple cuire les morceaux de silicium recouvertes à 65 ° C pendant 1 min, puis 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir à la température ambiante avant de procéder à l'étape suivante.
  8. Placez les morceaux de silicium soft-cuits sur la scène d'exposition avec SU8-2025 sur enduitface sur la face supérieure de la lampe UV. Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) pour la couche d'écoulement et motif de couche de contrôle respectivement pour les premiers stades larvaires de C. elegans. Placer le masque photo sur le dessus de la couche de SU8 et assurer le masque est à plat contre la couche de revêtement. Ouvrez le volet de la lampe UV et d'exposer les SU8 soft-cuits plaquettes à 200 Watt Lampe UV à travers le masque photo pendant 15 sec.
  9. Utilisez le masque de photo avec la conception I (L1, figure 1B) et de la conception II (L2, figure 1B) sur SU8-2050 pièces revêtues (préparé à l'étape 1.6) pour la fabrication de la couche d'écoulement et de la couche de contrôle pour fin stades larvaires de C. elegans. Utiliser le masque photo avec le motif (L1, figure 1C) I et II de conception (L2, figure 1C) pour le débit de la couche basale et la couche de contrôle respectivement pour la drosophile / poisson zèbre larves sur des plaquettes revêtues de SU8-2050 (i préparéEtape n 1,6). Exposer les surfaces SU8 à travers le masque photo pour la lampe UV de 200 watts pendant 15 secondes.
  10. Placer les morceaux de silicium exposées sur une plaque chauffante avec la couche enduite sur le dessus. Déposer cuire les tranches à 65 ° C pendant 1 min suivie de 95 ° C pendant 10 min. Permettre aux pièces de se refroidir avant de procéder à l'étape suivante.
  11. Développer les pièces en utilisant la solution SU8 développeur pendant 20 min. Rincer les morceaux dans de l'alcool isopropylique (IPA) et sécher à l'aide de l'azote gazeux.
  12. Placer les morceaux de silicium dans un dessicateur avec le motif sur le dessus SU8. Enduire les morceaux avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures.

Précautions: Prendre les précautions pour manipulation des produits chimiques au cours du traitement KOH, revêtement de résine photosensible et en développement. Silane revêtement en phase vapeur doit être effectué à l'intérieur d'un dessiccateur dans un endroit aéré. Protéger résine SU8 de plus de l'exposition à la lumière. Utilisez des lunettes de protection UV avec une ligsource de ht.

2. Fabrication de moules PDMS

  1. Préparer 10:01 PDMS en combinant 50 g de Sylgard 184 de base avec 5 g de durcisseur dans un gobelet en plastique. Mélanger manuellement le contenu de ~ 3 min. Dégazer le mélange à l'intérieur d'un dessiccateur pour éliminer toutes les bulles d'air formées pendant le mélange.
  2. Versez un mélange de 5 mm d'épaisseur PDMS sur les plaquettes de silicium avec SU8 modèle de conception II, pour la couche de contrôle, doucement pour éviter la formation de bulles d'air. Dans le cas où des bulles se forment lors de la coulée, dégazer le PDMS sur le modèle SU8 dans le vide bas pour enlever toutes les bulles.
  3. Placer les tranches de silicium avec SU8-2025 modèle de conception que j'ai, pour la couche d'écoulement, sur le mandrin spinner et allumez le vide pour les retenir. Couvrir les plaquettes avec ~ 1 ml de mélange PDMS et enrober les pastilles à l'aide SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.500 tours par minute pendant 30 sec.
  4. ~ 1 ml manteau PDMS mélange sur des tranches de silicium avec l'um 80 SU8-2050 modèle de conception I (L1, figure 1B), pour lacouche d'écoulement pour fin stades larvaires de C. elegans en utilisant la centrifugeuse SPIN150 à 500 tours par minute pendant 5 secondes puis 1.000 tours par minute pendant 30 sec. Enduire une couche épaisse de mélange PDMS sur les morceaux de silicium avec SU8-2050 modèle de flux de couche de dessin I (L1, figure 1C) pour Drosophila / poisson-zèbre, en utilisant des larves SPIN150 centrifugeuse à 500 tours par minute pendant 35 sec.
  5. Cuire des morceaux de PDMS avec revêtement en silicone de conception I et plaquettes avec un design correspondant II pour le contrôle de la couche contenant PDMS pour C. larves elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre dans un four à convection d'air chaud à 50 ° C pendant 6 heures.
  6. Découper la pièce à partir de PDMS contenant le substrat de silicium du motif de SU8 C. II elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves à l'aide d'une lame tranchante. Percer un trou de petit diamètre de ~ 1 mm au-dessus du réservoir principal reliant le piège dans le moule PDMS en utilisant un perforateur Harris.
  7. Placez le poing PDMS bloc (contenant le moule 40 um d'épaisseur pour le contrôlecouche L2) sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez la tranche de silicium revêtue PDMS contenant des 40 um d'épaisseur SU8 conception que j'ai sur le même plateau, avec le PDMS surface enduite orientée vers le haut. Insérez le bac dans la chambre de nettoyeur à plasma et mettez le vide pendant 2 min. Par la suite, la mise sous tension du plasma et abaisser la pression dans la chambre jusqu'à ce que la chambre vire au rose pâle. Exposer les deux surfaces à 18 Watt air par plasma sous vide basse pendant 2 min.
  8. Placez le bloc de poing PDMS retiré les 80 um d'épaisseur SU8 maître modèle contenant II pour la fin stades larvaires de C. elegans ou larves de Drosophila / poisson zèbre sur un plateau en matière plastique, moulé avec le côté de la couche de commande vers le haut. Placez le correspondant de spin cuite couche de PDMS déposé sur la plaquette de silicium contenant 80 um d'épaisseur conception I pour plus tard C. étapes elegans ou la drosophile / poisson zèbre larves simultanément sur ​​le même plateau avec le plat recouvert PDMS surface vers le haut. Utiliser le même protocole mentionné ci-dessus pour les exposer à l'air plasma.
  9. Placez les deux surfaces de plasma traités pour C. elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves avec une légère pression et faites cuire au four les convection d'air chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
  10. Découper les dispositifs asservis du substrat de silicium avec SU8 conception de C. I elegans et / ou la drosophile / poisson zèbre larves. Perforation des trous d'accès à des réservoirs d'entrée et de sortie du canal d'écoulement.
  11. Placer le moule PDMS collé sur un plateau en plastique pour C. elegans, avec le côté moulé de la conception de la couche d'écoulement vers le haut. Clean lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) et le placer sur le même plateau en plastique. Insérez le bac contenant moule PDMS et lamelle de verre à l'intérieur de la chambre à plasma. Exposer la surface inférieure du dispositif de PDMS et lamelle de verre de 18 Watt plasma d'air à basse pression pendant 2 min. Placez les deux surfaces de plasma traités avec gentle la pression et faire cuire au four les convection d'air chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
  12. Stocker l'appareil dans un environnement propre pour une utilisation future.

3. Étapes supplémentaires pour la drosophile / Zebrafish périphérique

  1. Exposer la surface de verre propre de taille 2 cm x 2 cm avec 50 pl de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane vapeur dans un dessiccateur pendant 2 heures.
  2. Spin ~ 1 ml de 10:1 mélange PDMS préparé à l'étape 2.1, la surface du verre silanisé utilisant SPIN150 spinner à 500 tours par minute pendant 35 sec. Cuire les substrats de verre revêtus PDMS dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 6 heures avec la surface revêtue vers le haut. Permettre à la couche de PDMS refroidir à température ambiante avant de procéder à l'étape suivante.
  3. Poinçon la couche de revêtement à l'aide d'un perforateur personnalisé construit en métal pointu au milieu du PDMS, pour former la couche d'espacement PDMS. La forme du poinçon métallique est conçu semblable à la conception de flux de Drosophila / poisson zèbre (L1, figure 1C
  4. Exposer la couche d'espacement PDMS et l'unique lié bloc (débit de la couche et la couche de contrôle, effectuée à l'étape 2.9 pour Drosophila / poisson zèbre larves) à 18 watts d'air plasma en utilisant nettoyeur à plasma à faible vide. Placez les deux surfaces de plasma traités ensemble et les faire cuire dans un four à air chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
  5. Couper le dispositif lié à partir de la vitre, les trous d'accès à poinçonner les réservoirs d'entrée et de sortie et elle liaison à une lamelle de verre (22 X 22 mm, épaisseur n ° 1) en utilisant un filtre à plasma tel que mentionné dans l'étape 2,11. Cela permettrait de produire un dispositif d'immobilisation pour les larves de premier stade drosophile avec une hauteur de canal de ~ 500 um. Pour embryons de poisson zèbre, dupliquez le calque entretoise PDMS procédé de fabrication d'une étape de liaison supplémentaire. La double couche de PDMS-S produit une hauteur de canal de 900 um pour 30 hfp poisson zèbre larves.

Précautions: Eviter les particules de poussière lors de la fabrication du dispositif. Deux plasma nettoyé la surfaces doivent être complètement exempte de poussière pour une bonne adhérence. Stocker les appareils dans un dessiccateur dans les situations où une salle spéciale propre n'est pas disponible de manière à minimiser l'accumulation de particules de poussière dans les appareils.

4. Utilisation PDMS Membrane

  1. Connecter une extrémité d'un tube de micro-flex (diamètre intérieur ~ 1,6 mm, diamètre extérieur 4,8 mm ~) à un régulateur d'alimentation en azote gazeux sous pression et l'autre extrémité au réservoir principal de collecteur à travers une aiguille de calibre 18 (diamètre extérieur ~ 1,25 mm) collé au tube. Un robinet 3-voies utilisées dans le milieu de la connexion du tube permet l'application ou la libération de la pression sur la membrane.
  2. Remplir le tube relié au dispositif de PDMS avec une colonne de 10 cm d'eau distillée avant de le raccorder au réservoir de la trappe principale d'un C. elegans et / ou de larves de drosophile / poisson zèbre.
  3. Activer la soupape de la fourniture d'azote à 14 psi lire et contrôler la membrane du piège principal de déviation vers èmee canal d'écoulement à faible grossissement d'un microscope inversé. Longueur de la colonne d'eau dans le tube de micro-flex est comprimé lorsque le robinet à 3 voies est ouverte. Bords de la membrane dévié, sont visibles en lumière transmise (figure 1I et 1J). Déviation membrane provoque un déplacement des particules de poussière / bulles sous la membrane de PDMS et les pousse aux limites du canal.
  4. Attendez que le liquide remplit avant le microcanal complètement sans bulles d'air.
  5. Relâcher la pression à l'aide du robinet 3-voies pour détendre la membrane à sa position de repos.

5. Insertion C. Les larves elegans, la drosophile et le poisson-zèbre dans l'appareil et les immobiliser sous la membrane flexible PDMS

  1. Remplir le canal d'écoulement avec un tampon M9 [3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O à 1 L, stériliser par autoclaving] pour C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O à 1 L, stériliser à l'autoclave] pour Drosophila / 19 pour le poisson-zèbre larves 10 min avant un expérience.
  2. Localiser un seul C. elegans de passage obligé sur une plaque NGM 18 (ou larves de premier stade drosophile de la plaque de gélose oeuf ou manuellement dechorionated 30 larves du poisson zèbre hpf en milieu liquide 20) à l'aide d'un microscope stéréo à faible grossissement. Choisissez un seul animal en utilisant un petit volume de solution tampon dans un embout micro. Utiliser un embout de micro avec son extrémité coupée pour accueillir plus la drosophile ou poisson zèbre dans le tampon.
  3. Poussez le seul organisme à travers l'entrée du canal d'écoulement. Régler la pression de pipetage pour positionner l'animal individuel dans le piège principal.
  4. Augmenter la pression de la membrane de PDMS lentement à la position de l'animal contre la chanfrontière nel et l'immobiliser avec 14 psi pour C. elegans, 7 psi pour la drosophile et 3 psi pour les larves de poisson zèbre.
  5. Positionner l'animal immobilisé au centre du champ de vision microscopique. Utiliser un microscope inversé au niveau désiré pour le champ lumineux haute résolution ou l'imagerie par fluorescence. Acquérir une ou time-lapse images de fluorescence à la cadence prédéfinie.
  6. Relâcher la pression piège et contrôler la locomotion de l'animal pendant 5-10 min à faible grossissement.
  7. Rincer l'animal et insérer un animal frais de répéter les étapes ci-dessus.
  8. Lavez tous les animaux à partir du réservoir de déchets en utilisant de l'eau distillée appliqué à l'aide d'une seringue. Sécher le canal en poussant l'air à l'aide d'une seringue pour une réutilisation ultérieure.

Précautions: Animaux nécessitant une pression élevée de pipetage à l'écoulement à l'intérieur du canal principal tendent à montrer locomotion pauvre / santé après la libération du piège et doivent être évités pour imaGing. Nettoyer le canal d'écoulement pour toute trace de tampon pour éviter le colmatage du canal par les cristaux. Si l'huile est utilisée pour l'imagerie haute résolution, nettoyer la lamelle de verre pour être en mesure de maintenir un bon signal sur bruit pour les expériences ultérieures.

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Representative Results

Le dispositif d'immobilisation est un bloc bicouche PDMS fabriqué par collage de deux couches: une couche d'écoulement (couche 1) et une couche de commande (couche 2) comme le montre la Figure 1. Le piège principal est connecté à une bouteille de gaz azote à travers un détendeur et une vanne d'arrêt 3-voies nécessaires pour appliquer (3-14 livres par pouce carré) de pression sur la membrane à travers une colonne de liquide (figure 1A). La membrane dévié immobilise C. larves elegans, la drosophile ou le poisson-zèbre dans le canal d'écoulement conçus avec des dimensions différentes (figure 1B et 1C). Photo masques sont utilisés pour concevoir couches du dispositif d'immobilisation avec des géométries différentes pour C. elegans (figure 1D), les larves de drosophile (Figure 1F) et les larves de poisson zèbre (figure 1G). La hauteur du canal d'écoulement de la couche (H1 de la figure 1E, 1K) a été modifiée à l'aide des vitesses différentes pour s'adapter à revêtir par centrifugation ouganismes de diamètres différents à l'intérieur du canal d'écoulement. Hauteurs couche d'écoulement ont été fabriqués à 40 um, 80 um, 500 um et 900 um pour C. elegans stades larvaires, adulte C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre, respectivement (tableau 1). Le dispositif d'une hauteur de canal d'écoulement de 40 micromètres, est approprié de L1 à L4 début C. larves elegans. Un appareil avec une hauteur de 80 um de débit en canal est utilisé pour la fin de larves L4 et adultes de C. elegans lorsque la vulve commence à faire saillie. Les dispositifs de poisson zèbre grands peuvent également être utilisés pour les larves de drosophile plus. L'épaisseur de la membrane de PDMS (m) a été fabriqué à 40 um et 300 um pour C. elegans et Drosophila / poisson zèbre dispositifs respectivement. La hauteur du canal microfluidique dans la couche 2 a été fabriqué à 40 um pour les premiers stades larvaires de C. elegans et 80 um pour fin stades larvaires de C. elegans et Drosophila/ Embryons de poisson zèbre. La hauteur du canal d'écoulement, la membrane et le canal de contrôle ont été mesurées dans les dispositifs fabriqués en plusieurs lots indépendants et ont été jugés conformes à ± 5 um de l'autre. Le dispositif utilise une technique de déformation de membrane (figure 1H-J) pour immobiliser les organismes dans le canal d'écoulement.

Organismes Le canal d'écoulement (PDMS-1) Spin conditions de canal d'écoulement Spacer PDMS (PDMS-S) Conditions de spin pour entretoise PDMS Immobilisation pression (psi)
C. elegans (L1 à L4 début) 40 pm (SU8-2025) 500 rpm (5 sec), 2.000 tours par minute (30 sec) NA NA 14
C. elegans (L4 fin et les adultes) 80 &mu, m (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2.000 tours par minute (30 sec) NA NA 14
Drosophila (premier stade) 80 pm (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2.000 tours par minute (30 sec) 400 um (PDMS) 500 tours par minute (35 sec) 7
Le poisson zèbre (30 hpf) 80 pm (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2.000 tours par minute (30 sec) 2X 400 um (PDMS) 500 tours par minute (35 sec) 3

Dimensions de la table de périphériques 1. Du canal d'écoulement (PDMS-1) et l'entretoise PDMS couche (PDMS-S) en C. elegans et Drosophila / poisson zèbre appareils.

C. elegans larves L4 ont été immobilisés dans les années 80 um canal de hauteur PDMS dispositif microfluidique utilisant 14 l'azote gazeux psi (figure 2A). Time-lapse images de fluorescence wavant l'acquisition, à la vitesse de 2 images par seconde (fps) en utilisant un objectif 60x (ouverture numérique 1.4, objectif huile) pour le transport des mitochondries imagerie visualisée à l'aide d'une matrice mitochondriale GFP ciblée dans les neurones récepteurs tactiles 21. Tous les 400 images ont été converties en utilisant kymographs ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) et les mitochondries ont été classés comme anterogradely dirigé (à partir du corps cellulaire), dirigé par voie rétrograde (vers le corps cellulaire) ou stationnaire (figure 2E). Nous avons observé mitochondriale de transport jusqu'à 21 psi de pression d'immobilisation, mais le flux était un peu plus grande à la plus basse pression d'immobilisation. Le flux antérograde et rétrograde des mitochondries ont été mesurées à 1,1 ± 0,23 et 1,6 ± 0,22 à 7 psi, alors que 0,8 ± 0,25 et 1,2 ± 0,34 à 14 psi de pression d'immobilisation. Les valeurs ne sont pas statistiquement différente entre 1,1 et 1,3 ± 0,33 et plusmn; 0,42 provenant d'animaux immobilisés en utilisant 3 lévamisole mM (valeurs p> 0,45, n = 30 animaux).

Les plus grands modules avec hauteur 500 um peut être utilisé pour immobiliser les larves de premier stade drosophile (Figure 2B) et 28-30 hpf poisson zèbre larves (figure 2D). Dissection du premier stade larvaire chez la drosophile larves peut être difficile. En revanche dispositifs microfluidiques fournir une méthode pour effectuer champ lumineux haute résolution et / ou l'imagerie par fluorescence à l'aide d'organismes intacts. Individuel larves de drosophile ont été immobilisés à l'aide de 7 psi azote gazeux comprimé (figure 2B, tableau 1) et des images de fluorescence de transport synaptotagmin.eGFP dans les neurones sensoriels ont été acquises (figure 2C). Time-lapse films ont montré des marchandises synaptotagmine mobile et stationnaire marquée dans les neurones sensoriels (figure 2F). Vitesse moyenne antérograde et rétrograde a été mesurée à partir de kymographs de 0,92 ± 0,04 mm / s et 1,00 ± 0,05 um / s respectivement (n = 6 animaux, n> 40 segments). Ceux-ci sont comparables à des vitesses de vésicules de transport transportant des Synaptotagmin mesurées dans disséqués neurones moteurs de drosophile en mouvement à la fois anterogradely (0,84 ± 0,05 mm / s) et rétrograde (0,76 ± 0,03 mm / s) 22.

Des dispositifs similaires avec 900 Hauteur um ont été utilisés pour immobiliser les différents stades de larves de poisson zèbre (figure 2D, tableau 1). Embryons de poisson zèbre au cours de ses premiers stades de développement retourne sa queue toutes les 10 sec à 15 et sont généralement immobilisées en utilisant 0,02% tricaïne (MS-222) en solution ou sur un support de montage pour imagerie à haute résolution 23. Notre dispositif de PDMS fournit un autre moyen d'immobilisation rapide et élimine le besoin d'un support de montage fiable dans le chemin optique au cours d'imagerie haute résolution 24. Nous manuellement dechorionated 28-30 hpf larves et les immobilisé individuellement dans un dispositif PDMS en utilisant 3 de l'azote gazeux psi d'acquérir time-lapse films de battements de cœur larvaire. Le rythme cardiaque a été mesurée à 136,8 ± 1,6 par minute (n = 8 films) et était similaire à d'autres rapports publiés 25.

Notre dispositif simple microfluidique avait déjà été démontrée pour mesurer une variété d'événements cellulaires et sous-cellulaires de type sauvage C. elegans 4. Dans notre dispositif microfluidique, sauvage de type C. elegans montrent un plus grand nombre de cargaison telles que des vésicules synaptiques qui se déplacent dans les neurones par rapport aux animaux qui sont immobilisées sous anesthésie. Cependant, nous n'avions pas testé nos appareils pour animaux de mutant pour voir si ces conclusions restent vraies. Pour tester cela nous avons utilisé un mutant forte hypomorphes dans le kinesin3 / UNC-104 moteur moléculaire, unc-104 (E1265), qui transporte des vésicules présynaptiques 26. Nous avons comparé le flux de la GFP :: RAB-3 marquée pré-synaptique vesicles en latéral antérieur neurones mécano en anesthésie et d'appareils immobilisés immobilisé aniamls mutants (figure 3A). Flux de vésicules présynaptiques est plus grande chez les animaux flux dispositif immobilisées par rapport à des données acquises à partir unc-104 animaux anesthésiés à 1 mM lévamisole (figure 3B, 3C) 27. Cela montre que les mutants d'imagerie de transport fortes défectueux dans des dispositifs microfluidiques est susceptible d'être un moyen plus efficace de collecte de données. Nous montrons également que d'autres le transport de fret dendritique par exemple des récepteurs du glutamate dans les neurones URY peuvent être visualisées dans les animaux d'appareils immobilisés (figure 3D, 3E). Le dispositif peut également être utilisé pour des traitements d'image cellulaires au début du mois C. développement elegans comme la division des neuroblastes Q chez les animaux L1. La cellule QR a été imagé de diviser pour former deux cellules filles QR.a et QR.p ~ 3 h après l'éclosion (figure 3F) compatible avecobservations antérieures 28.

Dimensions de la table de périphériques 1. Du canal d'écoulement (PDMS-1) et l'entretoise PDMS couche (PDMS-S) en C. elegans et Drosophila / poisson zèbre appareils.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique des dispositifs microfluidiques en PDMS pour des organismes modèles génétiques. (A) l'organisme est chargé à l'aide d'une pointe de micro dans le canal d'écoulement et immobilisé à l'aide d'azote gazeux comprimé contrôlé à l'aide d'un régulateur et vanne. L'appareil est conçu pour fond clair / imagerie de fluorescence dans un microscope inversé. La construction se compose d'un canal d'écoulement 10 mm de long (conception I, L1) et un canal de contrôle (conception II, L2) pour C. larves elegans (B) et la drosophile / poisson zèbre (C). Les dimensions sont indiquées sur le dessin (B et C). (D, F, G) Schéma de Various de couches PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membrane, PDMS-S et en verre) présents dans un C. elegans, la drosophile et le poisson-zèbre dispositif d'immobilisation. Représentation schématique (E) d'une section transversale du dispositif montrant le nombre PDMS couche (PDMS-2), une couche appliquée par centrifugation PDMS (PDMS-1) pour former une membrane flexible et une entretoise PDMS couche (PDMS-S) pour ajouter hauteur au canal d'écoulement (pour Drosophila / poisson zèbre dispositif). Toute la structure est liée de façon irréversible à un feuillet de verre optique de qualité de couverture pour accueillir l'organisme (cercle en marron). Le schéma indique la hauteur de 'h2' le canal de contrôle, "h1" de débit en canal, couche intercalaire poing 's' et la membrane d'épaisseur «m». (H) indique la déformation de membrane vers le canal d'écoulement dans la colonne de présence de liquide sous pression dans le canal de commande. Images de champ lumineux sont représentés d'une membrane libre (I) et dévié (J) sous zéro et 14 psi pression colonne de liquide, respectivement. La flèche et la flèche indiquent bulle uelon l'extérieur de la membrane dans le canal d'écoulement, respectivement. (K) Croix image en coupe de la C. Dispositif elegans prise à l'emplacement de la zone d'immobilisation. La barre d'échelle est de 50 um (K) et 200 um (I, J). (D, F, G) Schémas ne sont pas à l'échelle. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Imagerie organismes modèles génétiques immobilisé dans un dispositif microfluidique. L'image en champ clair d'une immobilisation C. elegans (A), un premier stade de Drosophila larves (B) et un filtre passe-haut 30 larves poisson zèbre (D) dans un dispositif microfluidique PDMS. L'analyse des kymographe imagerie time-lapse de jsIs609, un C. souche elegans, exprimant une GFP matrice mitochondriale ciblée dans un neurone antérieure latérale mécano (ALM) d'un dispositif immobilized animale (E). Les mitochondries sont classés comme antérograde (tête "bas" flèche), rétrograde (tête de flèche «haut») et stationnaires (marque «star») dans le kymographe. (C) l'image de fluorescence d'une larve de premier stade intacte chez la drosophile. La boîte indique l'emplacement où une grande résolution laps de temps de formation d'image syt.eGFP transport est effectué dans un neurone cholinergique. Montage de cinq images acquises à 5 Hz avec numéros de châssis indiqué sur chaque image et du fret GFP marquée montré que antérograde, rétrograde et stationnaire dans le montage (F). La boîte à (D) indique la zone qui a été suivie pour le calcul du rythme cardiaque des larves de poisson zèbre. La barre d'échelle est de 5 um (F), 10 um (E), 100 um (A, B) et 200 um (D).

Figure 3
Figure 3. Imagerie cellulaire et sub-cellulaire de C. elegans en utilisant des dispositifs microfluidiques en PDMS. (A) Schéma d'une fourmierior mécano latérale (ALM) neurone avec les directions antérograde et rétrograde marqué. Le cadre en pointillé montre la région imagée pour le transport axonal. 350 trames sont acquises à l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif 5 images par seconde avec le corps de cellule (CB) sur l'anneau de droite et de nerf (NR) sur la gauche. Les données sont analysées en utilisant kymographs pour animaux immobilisés dans un appareil ou avec 1 mM de levamisole (C). Cargo déplaçant dans des directions antérograde et rétrograde sont indiqués par des flèches pointant vers le «bas» et «haut» respectivement. (B) flux antérograde et rétrograde des particules observées dans unc-104 (E1265) les animaux dans une zone de 20 um du neurone ALM plus de 350 time-lapse cadres. (D) Schéma d'un neurone URY utilisé pour l'image GFP marquée glutamate de transport récepteurs. 350 à intervalles de temps sont converties en trames qui présentent kymographs cargaison se déplaçant dans les directions antérograde et rétrograde chez les animaux immobilisés en utilisant dispositif de PDMS ou 1 mM de levamisole (E). Time-lapse images acquises au cours des neuroblastes Q dila vision et de la migration dans les premiers stades larvaires de C. elegans. (F) Trois time-lapse images qui montrent QR division en cours pour former sa fille cellules QR.a et QR.p. La barre d'échelle est de 5 um (C, E et F). Données représentées dans (B) est la moyenne ± SEM (n> 4). Des comparaisons sont faites par rapport aux valeurs obtenues en anesthésie et signalés par un * (p <0,05) et ** (p <0,005).

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Discussion

Dispositifs microfluidiques en PDMS sont optiquement transparents peuvent donc être utilisés pour une grande résolution imagerie in vivo de tout organisme modèle transparent / translucide. Notre modèle est approprié pour un grossissement spatio-temporelle d'imagerie élevé d'événements cellulaires et sous-cellulaires intactes dans les animaux vivants. En utilisant des techniques de microfabrication de lithographie douce permet une manipulation aisée des dimensions de l'appareil pour les différentes tailles d'organismes modèles. Appareils de différentes tailles sont fabriquées pour les différents stades de C. elegans, Drosophila larves et des larves de poisson zèbre. Les appareils avec différentes hauteurs de 40 um et 80 pm dans leurs canaux d'écoulement de couche montrer immobilisation améliorée et une meilleure post-imagerie de la santé à la fois précoce (L1) et plus tard (fin L4) les stades de C. elegans, respectivement. Nous obtenons un taux de réussite de 100% dans la fabrication de dispositifs pour C. elegans et Drosophila / poisson zèbre sans appareil défectueux. Les appareils peuvent être utilisés plusieurs fois jusqu'à ce quele canal de commande est contaminé par des particules de poussière ou de la croissance bactérienne. Appareil immobilisé C. elegans montrent une plus grande cargaison de flux à la fois de type sauvage et les animaux mutants par rapport aux animaux anesthésiés. Immobilisation dispositif élimine la nécessité pour les protocoles de dissection techniquement difficiles surtout pour les premiers stades de développement de larves de drosophile 29.

Protocoles d'immobilisation instantanées dans des dispositifs microfluidiques en PDMS ont un avantage inhérent de réduire le temps expérimental par rapport aux durées d'exposition généralement plus besoin d'anesthésie appliquées de l'extérieur. Tous les organismes immobilisés revenir à la locomotion normale dans les 5-10 min après le relâchement de la pression sur la membrane déformable PDMS. C. elegans sont immobilisés à la limite du canal d'écoulement et à distance de la partie centrale de la membrane d'immobilisation. Animaux immobilisés au milieu du canal d'écoulement montrent une mauvaise santé post-immobilization et de mourir dans un jour ou deux. Notre dispositif microfluidique a été utilisé pour garder L4 C. stade elegans immobilisé pendant plus d'une heure sous la membrane sans nuire à sa santé ou son développement ultérieur. Animaux immobilisés pour des temps plus courts (jusqu'à 10 min) pourrait être emprisonné plusieurs fois pour l'imagerie. Pour les premiers stades de développement, C. elegans ont été immobilisé avec une pression légèrement inférieure (7 psi) à plus long terme pour time-lapse expériences (~ 3 h). Animaux immobilisées sous la membrane après la libération ont été laissés dans le même appareil dans l'intervalle. Ces animaux sont comparables au type sauvage à la fois dans leur développement et leur santé en général. Adultes de C. elegans immobilisées par basse pression (7 psi) a montré lente dérive à haute résolution lors de time-lapse expériences et nécessitent des outils d'analyse complexes pour l'analyse des transports. Cependant pressions plus faibles ont été utilisés pour réaliser des études à plus long terme tels que la division cellulaire neuroblaste Q / migration sur ~ 3 heures ou semi quantitative mito'hondria transports caractérisation, processus qui ne nécessitent pas une immobilisation complète. Ainsi pressions inférieures d'immobilisation peuvent être utilisés en fonction de l'ensemble de données qui doivent être collectées.

Imagerie time-lapse de L4 C. elegans montre mouvement saltatoire de la GFP marquée mitochondries dans le neurone ALM (souche jsIs609) comme cela a été rapporté pour les neurones dans des systèmes modèles d'autres 30-32. Certains mitochondries dans ces neurones montrent transport bidirectionnel tandis que la majorité d'entre eux sont fixes pendant toute la durée du film. En dépit de petites différences dans les flux de l'aide que nous continuons de pression 14 psi immobilisation en cas de C. elegans pour obtenir une immobilisation complète et d'éviter toute dérive lors de la résolution imagerie time-lapse élevé du transport axonal. Nous vous suggérons d'utiliser 14 psi dans un protocole général et en fonction des besoins expérimentaux cela peut être augmenté ou diminué. Animaux fallu près le même temps pour revenir à la normale locomotion des deux pressions d'immobilisation inférieurs et supérieurs et les animaux immobilisés développé de manière identique à celles qui sont cultivées sans immobilisation.

Lorsque le dispositif fabriqué en utilisant des dimensions plus grandes avec des couches d'espacement peuvent être utilisées pour grands organismes modèles comme la drosophile et les larves de poisson zèbre. Imagerie de transport synaptotagmin.eGFP dans intactes premier neurones sensoriels de Drosophila stade montre transport actif dans les deux directions antérograde et rétrograde. Les vitesses moyennes mesurées chez les larves appareil immobilisé sont plus élevés par rapport aux valeurs mesurées dans les neurones moteurs disséqués 22. Cette différence peut provenir une acquisition plus rapide des données dans nos expériences (5 hz v / s 01.01 à 01.04 Hz), spécifiques des neurones différences dans les organites de transport (sensoriel v / s neurones moteurs) et / ou les effets dus à la dissection.

Nos expériences antérieures ont été réalisées exclusivement chez les animaux de type sauvage 4, donc nous avons déterminé simutants d'imagerie dans des dispositifs microfluidiques est également avantageuse. Imagerie time-lapse de C. elegans L4 animaux montre réduit le flux de la GFP :: RAB-3 marqués vésicules pré-synaptiques dans kinesin3/unc-104 mutants immobilisés dans 1,0 mM de lévamisole par rapport aux mesures de flux obtenus chez les animaux immobilisés à l'aide de notre dispositif de PDMS (figure 3B). Nous avons souvent observé et montrent un exemple (figure 3C) que chez les mutants très peu de transport est observée si les animaux sont immobilisés à l'aide des concentrations anesthésiques qui immobilisent les animaux de type sauvage. Le nombre de vésicules se déplaçant dans unc-104 animaux est significativement plus élevé lorsque l'on utilise des dispositifs microfluidiques. Animaux anesthésiés présentent des caractéristiques similaires de transport lorsqu'elle est placée sous pression 14psi appliquée à la membrane de PDMS (figure 3B). Des observations similaires ont également été réalisés sur des animaux de type sauvage 4. Ces données suggèrent que le flux accru n'est pas susceptible de résulter d'une immobilisation sous atmosphère d'azote, mais en raison d'un protocole qui était moins dommageable pour le transport intra-cellulaire.

En principe, d'autres événements tels que la dynamique du calcium et la division cellulaire peuvent tous être visualisées dans intacts Drosophila / poisson zèbre larves ainsi. Post-formation d'image de récupération des animaux immobilisés dispositif est moins préjudiciable à 4 viabilité organisme et donc de tels dispositifs peuvent également être utilisées pour effectuer l'imagerie à long terme des organismes modèles génétiques génétiques pour les événements qui se produisent sur ​​des échelles de temps plus longues.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Ray Krishanu pour les stocks de drosophile, Tarjani Agarwal pour maintenir un Drosophila cage, Peter Juo pour nuIs25 et CGC pour C. souches elegans. SPK fait jsIs609 dans le laboratoire de Michael Nonet l'. Nous remercions Arpan Agnihotri (BITS Pilani) pour son aide dans imagerie time-lapse de transport mitochondries des animaux jsIs609 dans des dispositifs microfluidiques. Nous sommes reconnaissants au Dr Vatsala Thirumalai et Surya Prakash pour nous fournir des embryons de poisson zèbre. Nous remercions le Dr Krishna et CIFF au SPNE pour l'utilisation du microscope confocal à disque rotatif soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie, Centre de nanotechnologie (n ° SR/55/NM-36-2005). Nous remercions également Kaustubh Rau, V. Venkatraman et Chetana Sachidanand pour les discussions. Ce travail a été financé par la DBT bourse post-doctorale (SM), l'heure d'été accélérée régime (SM) et une subvention de la TCD (SPK). SA a été soutenue par des subventions DST et le CSIR à SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

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References

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Tags

Bioingénierie Numéro 67 Biologie moléculaire les neurosciences la microfluidique, poisson zèbre l'anesthésie le transport vésiculaire présynaptique le transport dendritique des récepteurs du glutamate le transport mitochondrial synaptotagmine de transport rythme cardiaque
Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre
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