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Bioengineering

Simples dispositivos de microfluidos para Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre

Abstract

Micro fabricadas dispositivos fluídicos proporcionar un micro-entorno accesible para estudios in vivo de pequeños organismos. Procesos de fabricación sencillos están disponibles para los dispositivos de microfluidos con técnicas de litografía blanda 1-3. Los dispositivos microfluídicos se han usado para la sub-celular de imagen 4,5, in vivo microcirugía láser 2,6 y 4,7 celular formación de imágenes. Imágenes in vivo requiere la inmovilización de los organismos. Esto se ha logrado mediante succión 5,8, 6,7,9 canales cónicos, membranas deformables 2-4,10, succión con refrigeración adicional 5, anestésico gas 11, geles sensibles a la temperatura 12, 13 y pegamento de cianoacrilato anestésicos tales como levamisol 14 , 15. Anestésicos usados ​​comúnmente influir en la transmisión sináptica 16,17 y se sabe que tienen efectos perjudiciales sobre la sub-celular neuronal transporte 4. En este study demostramos una membrana basada poli-dimetil-siloxano (PDMS), dispositivo que permite la inmovilización anestésico libre de organismos modelo intactas genéticos tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans), larvas de Drosophila y larvas de pez cebra. Estos organismos modelo son adecuados para estudios in vivo en los dispositivos de microfluidos a causa de sus pequeños diámetros y cuerpos ópticamente transparentes o translúcidos. Diámetros del cuerpo van desde ~ 10 ~ 800 micras para micras para los primeros estadios larvales de C. elegans y larvas de pez cebra y requieren dispositivos de microfluidos de diferentes tamaños para lograr una inmovilización completa de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo. Estos organismos se inmovilizan mediante presión aplicada por gas nitrógeno comprimido a través de una columna de líquido y fotografiado usando un microscopio invertido. Animales liberados de la trampa de volver a la locomoción normal dentro de 10 min.

Demostramos cuatro aplicaciones de time-lapse en C. elegansa saber, el transporte mitocondrial de imágenes en las neuronas, presináptica transporte de vesículas en un transporte defectuoso de transporte mutante del receptor de glutamato y la división Q neuroblast celular. Los datos obtenidos de tales películas muestran que la inmovilización de microfluidos es un medio útil y exacta de la adquisición de los datos in vivo de eventos celulares y subcelulares en comparación con los animales anestesiados (Figura 1J y 4 3C-F).

Las dimensiones del dispositivo se han alterado para permitir imágenes a intervalos de tiempo de las diferentes etapas de C. elegans, Drosophila primer instar de larvas y larvas de pez cebra. El transporte de vesículas marcados con sinaptotagmina etiquetado con GFP (syt.eGFP) en las neuronas sensoriales muestra un movimiento dirigido de marcadores vesículas sinápticas colinérgicas expresados ​​en las neuronas sensoriales intactas larvas de primer instar Drosophila. Un dispositivo similar se ha utilizado para llevar a cabo el tiempo de imágenes a intervalos de latido del corazón en ~ 30 horas después de la fertilización (hpf)pez cebra larvas. Estos datos muestran que los dispositivos simples que hemos desarrollado puede ser aplicado a una variedad de sistemas modelo para estudiar varios fenómenos biológicos celulares y de desarrollo in vivo.

Protocol

1. SU8 Maestro de Fabricación

  1. Diseño de las estructuras de microfluidos con software Clewin e imprimirlo utilizando 65.024 plotter láser DPI con dimensión mínima de 8 m en la película placa de circuito.
  2. Limpiar 2 cm X 2 cm obleas de silicio con óxido nativo en KOH al 20% durante 1 min y enjuague con agua desionizada; cada una oblea para la capa de flujo y su capa de control correspondiente.
  3. Secar las piezas con gas nitrógeno y se deshidratan en una placa caliente a 120 ° C durante 4 horas. Permitir que las piezas se enfríen a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa.
  4. Colocar las piezas de silicio de una en una en el plato giratorio y girar en el vacío. Cubrir las superficies de silicio con ~ 20 l hexametil-disilazano (HMDS) y recubrirlos con una. SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 3.000 rpm durante 30 sec
  5. Cubra las obleas de silicio totalmente con ~ 1,5 ml de SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) y obleas capa utilizando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 2.000 rpm durante 30 sec. Este protocolo hilado produce un espesor fotorresistente de ~ 40 m que es adecuado para el control de flujo y las capas para las primeras etapas de larvas de C. elegans.
  6. Centrifugación ~ 1,5 ml SU8-2050 usando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 2.000 rpm durante 30 segundos para obtener un espesor fotorresistente de ~ 80 m que es adecuado para la fabricación de flujo de la capa para fines de estadios larvales de C. elegans, capa de flujo basal para Drosophila / pez cebra larvas y sus capas de control correspondientes.
  7. Coloque las piezas de silicio en la placa caliente con la capa SU8 revestido en la parte superior. Soft cocer las piezas de silicio recubiertas a 65 º C durante 1 min seguido por 95 º C durante 10 min. Permitir que las piezas se enfríen a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa.
  8. Coloque las piezas de silicona suave al horno en el escenario de exposición con SU8-2025 recubierto surcara en la parte superior frente a la lámpara UV. Utilice la máscara foto con diseño I (L1, figura 1B) y el diseño II (L2, Figura 1B) para la capa de flujo y el patrón de la capa de control, respectivamente, para los primeros estadios larvarios de C. elegans. Coloque la máscara foto en la parte superior de la capa de SU8 y asegurar la máscara es plana contra la capa de recubrimiento. Abra el obturador de la lámpara UV y exponer las suaves horneados SU8 obleas de hasta 200 vatios de la lámpara UV a través de la máscara de foto durante 15 s.
  9. Utilice la máscara foto con diseño I (L1, figura 1B) y el diseño II (L2, Figura 1B) en SU8-2050 piezas recubiertas (preparado en el paso 1,6) para la fabricación de la capa de flujo y la capa de control para fines de estadios larvales de C. elegans. Utilice la máscara foto con el diseño I (L1, figura 1C) y el diseño II (L2, Figura 1C) para la capa basal y la capa de flujo de control, respectivamente, para Drosophila / pez cebra larvas en las obleas recubiertas con SU8-2050 (preparado in paso 1,6). Exponer las superficies de SU8 través de la máscara foto a la lámpara UV de 200 vatios durante 15 segundos.
  10. Coloque los trozos de silicio expuesto sobre una placa caliente con la capa de revestimiento en la parte superior. Publica hornear las obleas a 65 ° C durante 1 min seguido por 95 º C durante 10 min. Permitir que las piezas se enfríen antes de proceder al siguiente paso.
  11. Desarrollar las piezas con la solución de revelado SU8 durante 20 min. Enjuague las piezas en alcohol isopropílico (IPA) y secado de gas con nitrógeno.
  12. Coloque los trozos de silicio en un desecador con el patrón de SU8 en la parte superior. Recubrir las piezas con 50 l de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor en un desecador durante 2 hr.

Precauciones: Tome las precauciones de seguridad para el manejo de sustancias químicas durante el tratamiento KOH, capa fotosensible y en desarrollo. Silano revestimiento vapor debe realizarse dentro de un desecador en un área ventilada. Proteja SU8 resistir de la exposición excesiva a la luz. Utilice gafas de protección UV con una light fuente.

2. PDMS fabricación de moldes

  1. Preparar 10:01 PDMS mediante la combinación de 50 g de Sylgard 184 base con 5 g de agente de curado en una taza de plástico. Mezclar el contenido manualmente para ~ 3 min. Desgasificar la mezcla dentro de un desecador para eliminar todas las burbujas de aire formadas durante la mezcla.
  2. Verter una mezcla de 5 mm de espesor PDMS sobre las obleas de silicio con SU8 patrón de diseño II, para la capa de control, con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. En caso de que se forman burbujas durante el vertido, desgasificar el PDMS en el patrón de SU8 en bajo vacío para eliminar todas las burbujas.
  3. Coloque las obleas de silicio con SU8-2025 patrón de diseño que, para la capa de flujo, el plato giratorio y encienda la aspiradora para sostenerlos. Cubrir las obleas con ~ 1 ml de mezcla de PDMS y capa de las obleas utilizando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 1.500 rpm durante 30 sec.
  4. Escudo ~ 1 ml PDMS mezcla en obleas de silicio con el 80 micras SU8-2050 patrón de diseño I (L1, figura 1B), para laflujo de la capa para finales de estadios larvales de C. elegans utilizando el spinner SPIN150 a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 1.000 rpm durante 30 sec. Escudo una gruesa capa de mezcla PDMS sobre las piezas de silicio con SU8-2050 modelo de flujo de diseño I capa (L1, figura 1C) para Drosophila / pez cebra, usando larvas SPIN150 spinner a 500 rpm durante 35 seg.
  5. Hornee piezas PDMS recubiertos de silicio del diseño I y obleas con diseño correspondiente II para el control de la capa que contiene PDMS para C. elegans y / o Drosophila / pez cebra larvas en un horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 6 horas.
  6. Cortar la pieza de PDMS del sustrato de silicio que contiene el patrón II SU8 de C. elegans y / o larvas de Drosophila / pez cebra con una cuchilla afilada. Un pequeño orificio de diámetro 1 ~ mm en la parte superior del depósito de conectar la trampa principal en el molde de PDMS usando un golpeador Harris.
  7. Coloque el bloque perforado PDMS (que contiene el molde 40 m de espesor para el controlcapa L2) en una bandeja de plástico, con el lado de moldeado de la capa de control hacia arriba. Coloque la oblea de silicio recubierto de PDMS que contiene los 40 m de grosor SU8 I diseño en la misma bandeja, con la superficie recubierta hacia arriba PDMS. Introduzca la bandeja en el interior de la cámara de limpiador de plasma y encienda el vacío durante 2 min. A continuación, encienda el plasma y reducir la presión en la cámara hasta que la cámara se vuelve rosa de color claro. Exponga las dos superficies a 18 vatios aire plasma al vacío bajo durante 2 min.
  8. Coloque el bloque perforado PDMS retirados de las 80 micras de espesor que contiene SU8 maestro II modelo para finales de estadios larvales de C. elegans o Drosophila / pez cebra larvas en una bandeja de plástico, con el lado de moldeado de la capa de control hacia arriba. Coloque el correspondiente giro al horno PDMS capa revestida en la oblea de silicio que contiene 80 micras de espesor diseño I para más tarde C. elegans etapas o Drosophila / pez cebra larvas simultáneamente en la misma bandeja con el plano s recubierto PDMSurface hacia arriba. Utilice el mismo protocolo mencionado anteriormente para exponerlos al aire plasma.
  9. Coloque las dos superficies tratadas por plasma C. elegans y / o Drosophila / pez cebra larvas junto con una presión suave y hornear en horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas.
  10. Cortar los dispositivos enlazados desde el sustrato de silicio con diseño I SU8 de C. elegans y / o larvas de Drosophila / pez cebra. Perforar orificios de acceso a los depósitos de entrada y de salida del canal de flujo.
  11. Coloque el molde en condiciones de servidumbre PDMS en una bandeja de plástico para C. elegans, con la parte de trazado del diseño de la capa de flujo hacia arriba. Limpie el vidrio cubreobjetos (22 x 22 mm, No. 1 espesor) y colocarla en la bandeja de plástico mismo. Inserte la bandeja que contiene el molde de PDMS y antideslizante cubierta de vidrio en el interior de la cámara de plasma. Exponer la superficie inferior del dispositivo de PDMS y el deslizamiento de vidrio cubierta de 18 vatios de plasma de aire a baja presión durante 2 min. Coloque las dos superficies tratadas con plasma genpresión TLE y hornear en horno de convección de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas.
  12. Guarde el dispositivo en un entorno limpio para su uso futuro.

3. Pasos adicionales para Drosophila / Pez cebra dispositivo

  1. Exponer la superficie de vidrio limpio de tamaño de 2 cm X 2 cm de altura con 50 l de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor en un desecador durante 2 hr.
  2. Centrifugación ~ 1 ml de 10:1 mezcla PDMS preparada en la etapa 2,1 en la superficie de vidrio silanizada usando SPIN150 spinner a 500 rpm durante 35 seg. Hornear los sustratos de vidrio recubiertas de PDMS en un horno de aire caliente a 50 ° C durante 6 horas con la superficie recubierta hacia arriba. Permitir que la capa de PDMS que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder a la siguiente etapa.
  3. Ponche de la capa de revestimiento utilizando una costumbre golpeador construido de metal afilado en el medio de la PDMS, para formar la capa de separación PDMS. La forma de la perforadora de metal está diseñado similar al diseño de flujo para Drosophila / pez cebra (L1, figura 1C
  4. Exponer la capa separadora PDMS y de un solo bloque de servidumbre (capa y capa de control de flujo, en el paso 2.9 para Drosophila / pez cebra larvas) a 18 vatios limpiador de aire de plasma utilizando el plasma en vacío bajo. Colocar las dos superficies de plasma tratado juntos y hornear en un horno de aire caliente a 50 ° C durante 2 horas.
  5. Cortar el dispositivo unido desde el vidrio, agujeros de acceso en los depósitos de entrada y salida y el enlace a un cubreobjetos de vidrio (22 X 22 mm, N º 1 espesor) usando un limpiador de plasma como se ha mencionado en el paso 2,11. Esto produciría un dispositivo de inmovilización para el primer instar de larvas de Drosophila con una altura de canal de ~ 500 micras. Para las larvas de pez cebra, duplicar la capa espaciadora PDMS proceso de fabricación con una etapa de unión adicional. La doble capa de PDMS-S produce una altura de canal de 900 m para 30 HFP larvas de pez cebra.

Precauciones: Evitar las partículas de polvo durante la fabricación del dispositivo. Dos plasma superficie limpiadas que estar completamente libre de polvo para la correcta adherencia. La tienda de los dispositivos en un desecador en situaciones en las que una habitación limpia especial no está disponible con el fin de minimizar la acumulación de partículas de polvo en los dispositivos.

4. Con membrana de PDMS

  1. Conectar un extremo de un tubo de micro-flex (diámetro interno 1,6 ~ mm, diámetro exterior ~ 4,8 mm) a un regulador de suministro de gas nitrógeno a presión y el otro extremo al depósito trampa principal a través de una aguja de calibre 18 (diámetro exterior ~ 1,25 mm) pegados al tubo. Una llave de paso 3-way utilizado en el medio de la conexión del tubo permite la aplicación o liberación de la presión sobre la membrana.
  2. Llenar el tubo conectado al dispositivo de PDMS con una columna de 10 cm de agua destilada antes de conectarlo al depósito de la trampa principal de una C. elegans y / o Drosophila / pez cebra dispositivo larvas.
  3. Girar la válvula de la fuente de nitrógeno a 14 psi leer y controlar la membrana de la trampa principal desviando hacia the canal de flujo a bajo aumento de un microscopio invertido. Longitud de la columna de agua en el tubo de micro-flex se comprime cada vez que la llave de paso de 3-vías está abierta. Los bordes de la membrana desviados son visibles en luz transmitida (Figura 1I y 1J). Deflexión membrana provoca el desplazamiento de las partículas de polvo / burbujas en la membrana de PDMS y los empuja a los límites de los canales.
  4. Espere hasta que el frente del líquido llena el microcanal completamente sin aire atrapado.
  5. Libere la presión mediante el uso de la llave de paso de 3 vías para relajar la membrana en su posición de reposo.

5. Inserción C. elegans, Drosophila y larvas de pez cebra en el dispositivo y los inmoviliza Bajo la membrana flexible PDMS

  1. Rellene el canal de flujo con M9 buffer [3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O a 1 L, esterilizar en autoclaving] para C. elegans 18 o 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O para 1 L, esterilizar en autoclave] para Drosophila / pez cebra larvas 19 durante 10 min antes de una experimento.
  2. Localizar un solo C. elegans de etapa requerida en una placa NGM 18 (o de primer instar de larvas de Drosophila de la placa de agar huevo o manualmente dechorionated 30 larvas de pez cebra hpf en medio líquido 20) utilizando un microscopio estereoscópico de baja magnificación. Elija un solo animal usando un pequeño volumen de solución tampón en una punta de micro. Utilice una punta de micro con su extremo cortado para dar cabida a la mayor Drosophila o larvas de pez cebra en el buffer.
  3. Empuje el único organismo a través de la boca del canal de flujo. Ajustar la presión de pipeteado para colocar el animal en la trampa principal.
  4. Aumentar la presión de la membrana de PDMS lentamente a la posición del animal contra la channel límite e inmovilizarlo con la presión de psi 14 para C. elegans, 7 psi para Drosophila y 3 psi para las larvas de pez cebra.
  5. La posición del animal inmovilizado en el centro del campo de vista microscópico. El uso de un microscopio invertido con los ajustes deseados para alta resolución campo brillante o imágenes de fluorescencia. Adquirir imágenes de fluorescencia simple o lapso de tiempo a frecuencia de imagen predefinida.
  6. Libere la presión trampa y controlar la locomoción de los animales durante 5-10 min a bajo aumento.
  7. Enjuague el animal e inserte un animal fresco para repetir los pasos anteriores.
  8. Lavar todos los animales desde el depósito de residuos utilizando agua destilada aplicada usando una jeringa. Secar el canal empujando el aire con una jeringa para la reutilización futura.

Precauciones: Animales que requieren una mayor presión para pipetear líquidos dentro del cauce principal tienden a mostrar locomoción pobres / de salud después de salir de la trampa y se debe evitar por imaGing. Limpiar el canal de flujo de cualquier rastro de tampón para evitar la obstrucción de canal por los cristales. Si se utiliza aceite para obtener imágenes de alta resolución, limpiar el cubre de vidrio a ser capaz de mantener buena relación señal ruido para posteriores experimentos.

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Representative Results

El dispositivo de inmovilización es una bicapa bloque PDMS fabricado mediante la unión de dos capas: una capa de flujo (capa 1) y una capa de control (capa 2) como se muestra en la figura 1. La trampa principal está conectado a un cilindro de gas nitrógeno a través de un regulador y una válvula de cierre 3-way para aplicar necesario (3-14 psi) de presión sobre la membrana a través de una columna de líquido (Figura 1A). La membrana desviada inmoviliza C. elegans, Drosophila o de pez cebra larvas en el canal de flujo diseñados con dimensiones diferentes (Figura 1B y 1C). Máscaras de fotografía se utilizan para diseñar las capas de dispositivo de inmovilización con diferentes geometrías para C. elegans (Figura 1D), larvas de Drosophila (Figura 1F) y larvas de pez cebra (Figura 1G). La altura de la capa de canal de flujo (h1 en la Figura 1E, 1K) se varió usando diferentes velocidades de recubrimiento por centrifugación para acomodar onismos de diferentes diámetros dentro del canal de flujo. Alturas de flujo de la capa se fabricaron menos 40 micras, 80 micras, y 900 micras 500 micras de C. elegans larvas etapas, adulto C. elegans, Drosophila primer instar de larvas y larvas de pez cebra, respectivamente (Tabla 1). El dispositivo con una altura de canal de flujo de 40 micras es adecuado desde L1 a L4 temprano C. elegans larvas. Un dispositivo con una altura de canal de 80 micras de flujo se utiliza para fines de larvas L4 y C. adulto elegans cuando la vulva comienza a sobresalir. Los dispositivos de pez cebra más grandes también se puede utilizar para mayor larvas de Drosophila. El espesor de la membrana de PDMS (m) se fabricó a 40 micras y 300 micras para C. elegans y Drosophila dispositivos / pez cebra respectivamente. La altura del canal microfluídico en la capa 2 se fabricó a 40 micras para las primeras etapas de larvas de C. elegans y 80 micras para las últimas etapas larvales de C. elegans y Drosophila/ Pez cebra larvas. La altura del canal de flujo, de la membrana y el canal de control se midieron en dispositivos fabricados en múltiples lotes independientes y se encontró que ser coherente dentro de ± 5 micras de cada uno. El dispositivo utiliza una técnica de deflexión de la membrana (Figura 1H-J) para inmovilizar los organismos en el canal de flujo.

Organismos Canal de flujo (PDMS-1) Girar condiciones de canal de flujo Spacer PDMS (PDMS-S) Condiciones de centrifugado separador PDMS Inmovilización de presión (psi)
C. elegans (L1 a L4 temprano) 40 micras (SU8-2025) 500 rpm (5 segundos), 2.000 rpm (30 seg) NA NA 14
C. elegans (L4 tardíos y adultos) 80 μ m (SU8-2050) 500 rpm (5 segundos), 2.000 rpm (30 seg) NA NA 14
Drosophila (primer estadio) 80 micras (SU8-2050) 500 rpm (5 segundos), 2.000 rpm (30 seg) 400 micras (PDMS) 500 rpm (35 seg) 7
El pez cebra (30 hpf) 80 micras (SU8-2050) 500 rpm (5 segundos), 2.000 rpm (30 seg) 2X 400 micras (PDMS) 500 rpm (35 seg) 3

Tabla 1. Dimensiones de dispositivo del canal de flujo (PDMS-1) y el espaciador PDMS capa (PDMS-S) utilizado en C. elegans y Drosophila dispositivos / pez cebra.

C. elegans larvas L4 se inmovilizaron en el canal 80 micras altura dispositivo microfluídico de PDMS con 14 psi de gas nitrógeno (Figura 2A). Time-lapse de imágenes de fluorescencia were adquirido a la velocidad de 2 fotogramas por segundo (fps) usando un objetivo 60x (apertura numérica 1,4, objetivo aceite) para el transporte de imágenes de las mitocondrias visualiza mediante un GFP matriz mitocondrial específica en los receptores de las neuronas táctiles 21. Todos los marcos 400 se convirtieron a kymographs usando ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) y las mitocondrias se clasifican como anterogradely dirigida (distancia desde el cuerpo celular), dirigida retrógrada (hacia el cuerpo de la célula) o estacionaria (2E Figura). Hemos observado mitocondrial de transporte de hasta 21 psi de presión de inmovilización, pero el flujo era algo mayor a la menor presión de inmovilización. El flujo anterógrado y retrógrado de las mitocondrias se midió en 1,1 ± 0,23 y 1,6 ± 0,22 a 7 psi, mientras que 0,8 ± 0,25 y 1,2 ± 0,34 a 14 psi de presión de inmovilización. Los valores no fueron estadísticamente diferentes de 1,1 ± 0,33 y 1,3 & plusmn; 0,42 obtenido de animales inmovilizados usando 3 mM levamisol (valores de p> 0,45, n = 30 animales).

Los dispositivos de mayor tamaño con una altura de 500 micras se puede utilizar para inmovilizar primer instar de larvas de Drosophila (Figura 2B) y 28-30 hpf larvas de pez cebra (Figura 2D). Disección del primer instar larvas de Drosophila puede ser un reto. Por el contrario los dispositivos de microfluidos proporcionar un método para realizar alta resolución campo brillante y / o imágenes de fluorescencia utilizando organismos intactos. Individual larvas de Drosophila fueron inmovilizados usando 7 psi de gas nitrógeno comprimido (Figura 2B, Tabla 1) y las imágenes de fluorescencia de transporte synaptotagmin.eGFP en las neuronas sensoriales han desarrollado (Figura 2C). Películas a intervalos mostró carga sinaptotagmina móviles y estacionarios marcada en las neuronas sensoriales (Figura 2F). La velocidad promedio anterógrada y retrógrada se midió a partir kymOGRAFÍAS de 0,92 ± 0,04 m / s y 1,00 ± 0,05 micras / s, respectivamente (n = 6 animales, n> segmentos 40). Estos son comparables a las velocidades de vesículas de transporte que transporten sinaptotagmina medidos en disecados Drosophila neuronas motoras que se desplazan tanto anterógrada (0,84 ± 0,05 m / s) y retrógrada (0,76 ± 0,03 m / s) 22.

Dispositivos similares con la altura 900 micras se han utilizado para inmovilizar las diferentes etapas de larvas de pez cebra (Figura 2D, Tabla 1). Larvas de pez cebra durante sus primeras etapas de desarrollo voltea la cola cada 10 seg a 15 y normalmente se inmovilizó usando 0,02% de tricaína (MS-222) en solución o en un soporte de montaje para la formación de imágenes de alta resolución 23. Nuestro dispositivo de PDMS proporciona un medio alternativo para la inmovilización rápido y elimina la necesidad de un medio fiable de montaje en el camino óptico durante la resolución de imagen de alta 24. Nos manualmente dechorionated 28-30 hpf larvas y se inmoviliza de forma individual en un dispositivo de PDMS usando 3 psi de gas nitrógeno para adquirir películas a intervalos de latido larval. La tasa de latidos del corazón se midió que era 136,8 ± 1,6 por min (n = 8 películas) y fue similar a otros informes publicados 25.

Nuestro dispositivo de microfluidos sencillos ya había sido demostrado para medir una variedad de eventos sub-celulares y celulares de tipo salvaje C. elegans 4. En nuestro dispositivo de microfluidos, salvaje tipo C. elegans muestran un mayor número de carga, tales como vesículas sinápticas que se mueven en las neuronas en comparación con los animales que están inmovilizadas con anestésicos. Sin embargo, no había probado nuestros dispositivos para animales mutantes para ver si estas conclusiones son válidas. Para probar esto se utilizó un mutante hypomorphic fuerte en el kinesin3 / UNC-104 motor molecular, unc-104 (e1265), que transporta vesículas presinápticas 26. Se comparó el flujo de GFP :: RAB-3 marcada pre-sináptica vesilos artículos anteriores en neuronas laterales mechanosensory en anestésico inmovilizados y el dispositivo inmovilizado aniamls mutantes (Figura 3A). Flujo de pre-sinápticos vesículas fue mayor flujo en animales inmovilizados dispositivo en comparación con los datos adquiridos de unc-104 en animales anestesiados mM levamisol 1 (Figura 3B, 3C) 27. Esto demuestra que los mutantes de formación de imágenes sólidas de transporte defectuosos en los dispositivos de microfluidos es probable que sea un medio más eficaz de recogida de datos. También muestran que otros medios de transporte de carga por ejemplo dendríticas de receptores de glutamato en las neuronas URY pueden ser reflejados en los animales de dispositivos inmovilizados (Figura 3D, 3E). El dispositivo también se puede utilizar para procesos de imagen celular durante principios de C. elegans desarrollo, tales como la división neuroblast Q en animales L1. La célula QR se formó una imagen de dividir para formar dos células hija QR.a y QR.p ~ 3 h después de la eclosión (Figura 3F) consistente con laobservaciones anteriores 28.

Tabla 1. Dimensiones de dispositivo del canal de flujo (PDMS-1) y el espaciador PDMS capa (PDMS-S) utilizado en C. elegans y Drosophila dispositivos / pez cebra.

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática de PDMS dispositivos de microfluidos para organismos modelos genéticos. (A) El organismo se carga utilizando una punta de micro al canal de flujo y se inmoviliza usando gas nitrógeno comprimido controla mediante un regulador y una válvula. El dispositivo es adecuado para campo claro / fluorescencia de imágenes en un microscopio invertido. El diseño consiste en un canal de flujo 10 mm de largo (diseño I, L1) y un canal de control (diseño II, L2), respectivamente, para C. elegans (B) y Drosophila / pez cebra larvas (C). Las dimensiones se indican en el diseño (B y C). (D, F, G) Esquema de numerosas manifestacioness capas de PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membrana, PDMS-S y vidrio) presentes en un C. elegans, Drosophila y el dispositivo de inmovilización de pez cebra. (E) Representación esquemática de una sección transversal del dispositivo que muestra la mayor parte de la capa de PDMS (PDMS-2), una capa de recubrimiento PDMS giro (PDMS-1) para formar una membrana flexible y un espaciador PDMS capa (PDMS-S) para añadir altura al canal de flujo (para Drosophila / pez cebra dispositivo). Toda la estructura está unida de forma irreversible a un deslizamiento de grado óptico cubierta de vidrio para acomodar el organismo (círculo en marrón). El esquema indica la altura de 'h2' el canal de control, 'h1' canal de flujo, 's' capa perforada la membrana separadora y espesor 'm'. (H) indica la desviación membrana hacia el canal de flujo en la presencia de columna de líquido a presión en el canal de control. Imágenes brillantes de campo se muestran de una membrana libre (I) y se desvía (J) bajo cero y 14 psi presión de columna de líquido, respectivamente. La flecha y la punta de la flecha indica burbuja under y fuera de la membrana en el canal de flujo respectivamente. (K) de la sección transversal de la imagen C. dispositivo elegans tomada en la ubicación de la zona de inmovilización. La barra de escala es de 50 micras (K) y 200 m (I, J). (D, F, G) Esquemas no están a escala. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2
Figura 2. Organismos Imaging genéticos modelo inmovilizada en un dispositivo de microfluidos. Imagen de campo claro de un inmovilizado C. elegans (A), un primer instar de larvas de Drosophila (B) y un 30 hpf larvas de pez cebra (D) en un dispositivo de microfluidos PDMS. Quimógrafo análisis de time-lapse de jsIs609, una C. cepa elegans, expresando GFP una matriz mitocondrial blanco de un lateral anterior neurona mechanosensory (ALM) de un dispositivo immobilized animal (E). Las mitocondrias son clasificados como anterógrada ("abajo" cabeza de flecha), retrógrada ("arriba" cabeza de flecha) y fijos ('estrella' marca) en el quimógrafo. (C) Imagen de fluorescencia de un intacta primera larva de Drosophila. El cuadro indica el lugar donde se lleva a alta resolución time-lapse de imágenes de syt.eGFP transporte en una neurona colinérgica. Montaje de cinco cuadros adquiridos a 5 Hz con números de fotogramas indica en cada imagen y de carga GFP marcado muestra como anterógrada y retrógrada manera fija en el montaje (F). La caja en (D) indica el área que se controló para calcular la frecuencia de latidos del corazón de las larvas de pez cebra. La barra de escala es de 5 micras (F), 10 M (E), 100 m (A, B) y 200 m (D).

Figura 3
Figura 3. Imagenología celular y subcelular en C. elegans utilizando PDMS dispositivos de microfluidos. (A) Esquema de una hormigaerior mechanosensory lateral (ALM) neurona con las direcciones anterógrada y retrógrada marcado. El cuadro punteado muestra la región fotografiada para el transporte axonal. 350 tramas se adquirieron usando un microscopio confocal de disco giratorio a 5 fps con cuerpo celular (CB) en el anillo de la derecha y el nervio (NR) en el lado izquierdo. Los datos se analizaron utilizando kymographs para animales inmovilizados en un dispositivo o usando 1 mM levamisol (C). Carga que se mueve en direcciones anterógrada y retrógrada se muestran con flechas que apuntan hacia "abajo" y "arriba", respectivamente. (B) El flujo anterógrada y retrógrada de partículas observadas en unc-104 (e1265) los animales en una región de 20 m de la neurona ALM más de 350 time-lapse marcos. (D) Esquema de una neurona URY utiliza para obtener imágenes GFP marcado transporte receptores de glutamato. 350 lapso de tiempo se convierten en tramas kymographs que muestran la carga en movimiento en las direcciones anterógrada y retrógrada en animales inmovilizados en el dispositivo de PDMS o usando 1 mM levamisol (E). Time-lapse imágenes adquiridas durante neuroblast Q división y la migración en los primeros estadios larvales de C. elegans. (F) Tres time-lapse cuadros que muestran división QR pasando a formar su hija células QR.a y QR.p. Barra de escala es de 5 micras (C, E y F). Los datos representados en (B) es la media ± SEM (n> 4). Las comparaciones se hacen con respecto a los valores obtenidos en anestesia y señalados con * (p <0,05) y ** (p <0,005).

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Discussion

PDMS dispositivos microfluídicos son ópticamente transparentes por lo tanto se puede utilizar para la alta resolución en imágenes in vivo de cualquier organismo modelo transparente / translúcido. Nuestro diseño es adecuado para una gran ampliación espacio-temporal de imágenes de eventos celulares y subcelulares de animales vivos intactos. Microfabrication utilizando técnicas litográficas blandas permite la fácil manipulación de las dimensiones del dispositivo para diferentes tamaños de organismos modelo. Dispositivos de distintos tamaños se fabrican para diferentes etapas de C. elegans, Drosophila larvas y larvas de pez cebra. Los dispositivos con diferentes alturas de 40 micras y 80 micras en sus canales de flujo capa mostrar inmovilización mejorado y mejor después de la proyección de imagen de la salud de ambos principios (L1) y más tarde (finales L4) etapas de C. elegans, respectivamente. Logramos una tasa de éxito del 100% en la fabricación de dispositivos de C. elegans y Drosophila / pez cebra sin ningún tipo de dispositivos defectuosos. Los dispositivos se pueden utilizar varias veces hasta queel canal de control está contaminado con partículas de polvo o el crecimiento bacteriano. Dispositivo inmovilizado C. elegans muestran un mayor flujo de carga en tanto de tipo salvaje y los animales mutantes en comparación con los animales anestesiados. Inmovilización del dispositivo elimina la necesidad de protocolos de disección técnicamente desafiantes especialmente para las primeras etapas de desarrollo de las larvas de Drosophila 29.

Instantáneos protocolos de inmovilización en PDMS dispositivos de microfluidos tienen una ventaja inherente de reducir el tiempo de experimentación en comparación con los tiempos de exposición más largos típicamente requieren para anestésicos aplicados externamente. Todos los organismos inmovilizados volver a la locomoción normal dentro de 5-10 minutos después de la liberación de la presión sobre la membrana deformable PDMS. C. elegans se inmovilizan en el límite del canal de flujo y fuera de la porción central de la membrana de inmovilización. Animales inmovilizados en el medio del canal de flujo muestran mala salud post-inmovilizaciónción y mueren dentro de un día o dos. Nuestro dispositivo de microfluidos se ha utilizado para mantener L4 etapa C. elegans inmovilizada durante un máximo de una hora bajo la membrana sin afectar a su salud o su desarrollo posterior. Animales inmovilizados durante tiempos más cortos (hasta 10 min) podría quedar atrapado varias veces para formación de imágenes. En los primeros estadios de desarrollo, C. elegans fueron inmovilizados con presión ligeramente inferior (7 psi) durante más largo plazo con lapso de tiempo experimentos (~ 3 h). Animales inmovilizados debajo de la membrana después de la liberación se dejaron en el mismo dispositivo en el tiempo intermedio. Estos animales son comparables a las de tipo salvaje, tanto en su desarrollo y salud general. Adulto C. elegans inmovilizados con menor presión (7 psi) mostró deriva lenta de alta resolución durante lapsos de tiempo experimentos y requieren herramientas de análisis complejos para el análisis de transporte. Sin embargo, las presiones más bajas fueron utilizados para realizar estudios a más largo plazo, como la división celular neuroblast Q / migración durante ~ 3 horas o mitoj semicuantitativaondria caracterización transporte, procesos que no requieren una inmovilización completa. Así, las presiones más bajas de inmovilización puede ser utilizado dependiendo del conjunto de datos que debe ser recogido.

Time-lapse de imágenes de L4 C. elegans muestra el movimiento saltatoria de GFP marcado mitocondrias en la neurona ALM (cepa jsIs609) como se ha descrito para las neuronas en otros sistemas modelo 30-32. Algunos mitocondrias en estas neuronas muestran transporte bidireccional mientras que la mayoría de ellos son estacionarios durante la duración de la película. A pesar de las pequeñas diferencias en el flujo seguimos utilizando 14 psi de presión de inmovilización en caso de C. elegans para obtener una completa inmovilización y evitar cualquier deriva en alta resolución time-lapse de imágenes de transporte axonal. Se sugiere utilizar 14 psi en un protocolo general y dependiendo de las necesidades experimentales esto puede ser incrementado o disminuido. Animales llevó casi el mismo tiempo para regresar a la normalidad locomotion de las dos presiones de inmovilización inferiores y superiores y animales inmovilizados desarrollado de forma idéntica a los que se cultivan sin inmovilización.

El dispositivo cuando se fabrica el uso de grandes dimensiones con capas espaciadoras se puede utilizar para organismos modelo más grandes tales como Drosophila y larvas de pez cebra. Imágenes de transporte synaptotagmin.eGFP en neuronas intactas primera fase larval de Drosophila muestra sensoriales transporte activo tanto en dirección anterógrada y retrógrada. Las velocidades medias medidas en las larvas dispositivo se inmovilizan mayor en comparación con los valores medidos en las neuronas motoras disecados 22. Esta diferencia puede surgir a partir de una adquisición más rápida de los datos en nuestros experimentos (5 Hz v / s 1.1 a 1.4 Hz), específicos de neuronas diferencias en orgánulos de transporte (sensorial v / s neuronas motoras) y / o los efectos debidos a la disección.

Nuestros experimentos anteriores se llevaron a cabo exclusivamente en animales de tipo salvaje 4, con lo que se determinó simutantes de imagen en dispositivos de microfluidos también era ventajosa. Time-lapse de imágenes de C. elegans L4 animales muestra reducido flujo de GFP :: RAB-3 pre-marcadas vesículas sinápticas en kinesin3/unc-104 mutantes inmovilizados en levamisol 1,0 mM en comparación con las mediciones de flujo obtenidos en animales inmovilizados usando nuestro dispositivo PDMS (Figura 3B). Hemos observado con frecuencia y muestran un ejemplo (Figura 3C) que en los mutantes se observa muy poco transporte si los animales se inmovilizan usando concentraciones de anestésico que inmovilizan los animales de tipo salvaje. Los números de vesículas que se mueven en unc-104 animales es significativamente mayor cuando utilizamos dispositivos de microfluidos. Animales anestesiados muestran características similares de transporte cuando se coloca bajo presión de 14psi aplicada a la membrana de PDMS (Figura 3B). Observaciones similares se han realizado en animales de tipo salvaje 4. Estos datos sugieren que el aumento de flujo no es probable que surjan a partir de immovilización en atmósfera de nitrógeno, pero debido a un protocolo que fue menos perjudicial para el transporte intra-celular.

En principio, otros acontecimientos tales como la dinámica del calcio y la división celular todo puede ser reflejado en Drosophila intacto / larvas de pez cebra también. Post-formación de imágenes de recuperación de los animales inmovilizados dispositivo es menos perjudicial para la viabilidad organismo 4 y por lo tanto estos dispositivos también se pueden utilizar para realizar a largo plazo de imágenes de organismos modelo genéticos genéticos para eventos que ocurren durante largos escalas de tiempo.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Ray Krishanu para las poblaciones de Drosophila, Tarjani Agarwal para el mantenimiento de una jaula de Drosophila, Peter Juo para nuIs25 CGC y de C. elegans cepas. SPK jsIs609 hecho en el laboratorio de Nonet de Michael. Damos las gracias a Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por su ayuda en time-lapse de transporte mitocondrias de los animales jsIs609 en dispositivos de microfluidos. Estamos muy agradecidos con el Dr. Vatsala Thirumalai Surya Prakash y por darnos embriones de pez cebra. Damos las gracias a la Dra. Krishna y CIFF en BCN para uso del microscopio confocal de disco giratorio apoyado por el Departamento de Ciencia y Tecnología-Centro para la Nanotecnología (N º SR/55/NM-36-2005). También damos las gracias Kaustubh Rau, V. y Venkatraman Sachidanand Chetana para los debates. Este trabajo fue financiado por el DBT beca posdoctoral (SM), DST vía rápida esquema (SM) y una subvención a DBT (SPK). SA fue apoyado por becas de horario de verano y el CSIR a SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

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References

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