Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Enkla mikroflödessystem enheter för Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

En enkel mikrofluidikanordning har utvecklats för att utföra bedövningsmedel gratis

Abstract

Micro tillverkade fluidic enheter ger en tillgänglig mikro-miljö för in vivo-studier på små organismer. Enkla tillverkningsprocesser finns för mikroflödessystem enheter som använder mjuk litografi tekniker 1-3. Mikrofluidanordningar har använts för sub-cellulär avbildning 4,5, in vivo-laser mikrokirurgi 2,6 och cellulär avbildning 4,7. Avbildning in vivo kräver immobilisering av organismer. Detta har uppnåtts med hjälp sug 5,8, avsmalnande kanaler 6,7,9, deformerbara membran 2-4,10, sug med extra kylning 5, anestesigas 11, temperaturkänsliga geler 12, cyanoakrylatlim 13 och anestetika såsom levamisol 14 , 15. Vanligt använda bedövningsmedel påverkar synaptisk transmission 16,17 och är kända för att ha skadliga effekter på sub-cellulära neuronal transporter 4. I denna mUdy visar vi ett membran baserad poly-dimetyl-siloxan (PDMS) enhet som tillåter bedövningsmedel fri immobilisering av intakta genetiska modellorganismer som Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larver och zebrafisk larver. Dessa modellorganismer är lämpliga för in vivo-studier på mikrofluidikanordningar på grund av deras små diametrar och optiskt transparenta eller genomskinliga organ. Body diametrar varierar från ~ 10 | im till ~ 800 | im för tidiga larvstadier av C. elegans och zebrafisk larver och kräver mikrofluidikanordningar i olika storlekar för att uppnå fullständig immobilisering för hög upplösning time-lapse avbildning. Dessa organismer är immobiliserade med tryck appliceras av komprimerad kvävgas genom en vätskepelare och avbildades med användning av ett inverterat mikroskop. Djur som frigörs från fällan återgå till normal förflyttning inom 10 minuter.

Vi visar fyra tillämpningar av time-lapse avbildning i C. elegansnämligen bildbehandling mitokondriell transport i nervceller, presynaptisk vesikel transport i en transport-defekt mutant, glutamatreceptor transport och Q neuroblast celldelning. Data från sådana filmer visar att mikroflödessystem immobilisering är ett användbart och korrekt sätt att förvärva in vivo-data av cellulära och sub-cellulära händelser jämfört med sövda djur (Figur 1J och 3C-F 4).

Device dimensioner förändrades så att time-lapse avbildning av olika stadier av C. elegans, första stadiet Drosophila larver och zebrafisk larver. Transport av vesiklar markerade med synaptotagmin taggade med GFP (syt.eGFP) i sensoriska neuroner visar riktat rörelse av synaptiska vesikler markörer uttrycks i kolinerga sensoriska neuroner i intakt första stadiet Drosophila larver. En liknande anordning har använts för att utföra tidsförlopp avbildning av hjärtslag i ~ 30 timmar efter befruktning (HPF)zebrafisk larver. Dessa data visar att de enkla anordningar som vi har utvecklat kan appliceras på en mängd olika modellsystem för att studera flera cellbiologiska och utvecklingsmässiga fenomen in vivo.

Protocol

1. SU8 Mästare Fabrication

  1. Utforma mikroflödessystem strukturer med hjälp av Clewin programvara och skriva ut den med 65.024 DPI laser plotter med minsta karaktäristisk storlek som 8 um på kretskort film.
  2. Rengör 2 cm x 2 cm skivor kisel med nativ oxid i 20% KOH under 1 min och sköljning i avjoniserat vatten, en skiva vardera för flödet skiktet och dess motsvarande kontroll skikt.
  3. Föna bitarna med kvävgas och dehydrera på en varm platta vid 120 ° C under 4 timmar. Låt bitarna svalna till rumstemperatur innan man fortsätter till nästa steg.
  4. Placera kisel bitar i taget på ratten chucken och slå på vakuum. Täck kiselytor med ~ 20 | il hexametyl-disilazan (HMDS) och belägga dem med en SPIN150 spinner vid 500 rpm under 5 sekunder, följt av 3.000 rpm under 30 sek.
  5. Täck kiselskivor helt med ~ 1,5 ml SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) och skivorna coat användning SPIN150 spinner vid 500 rpm under 5 sekunder, följt av 2.000 rpm under 30 sek. Denna roterande protokoll ger en fotoresist tjocklek av ~ 40 | im som är lämplig för kontroll och skikten flöde för tidiga larvstadier av C. elegans.
  6. Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 med användning av SPIN150 spinner vid 500 rpm under 5 sekunder, följt av 2.000 rpm under 30 sekunder för att erhålla en fotoresist tjocklek av ~ 80 | im som är lämplig för strömningsskikt tillverkning för sena larvstadier av C. elegans, basala flöde lager för Drosophila / zebrafisk larver och deras motsvarande skikt kontroll.
  7. Placera kisel bitar på varm plåt med SU8 belagda lager ovanpå. Mjuk baka de belagda kisel bitar vid 65 ° C under 1 min följt av 95 ° C under 10 minuter. Låt bitarna svalna till rumstemperatur innan man fortsätter till nästa steg.
  8. Placera mjuka bakade kisel bitar på exponeringen scenen med SU8-2025 belagd suransikte på toppen vänd mot UV-lampan. Använd bilden masken med design I (L1, figur 1B) och design II (L2, figur 1B) för flödet lagret och kontroll lager mönster respektive för tidig larvstadier av C. elegans. Placera fotot masken ovanpå SU8 skiktet och säkerställa masken ligger platt mot det belagda skiktet. Öppna luckan för UV-lampan och exponera de mjuka bakade SU8 wafers till 200 Watt UV-lampa genom foto masken för 15 sek.
  9. Använd bilden masken med motiv I (L1, figur 1B) och design II (L2, figur 1B) på SU8-2050 belagda stycken (framställd i steg 1,6) för att tillverka strömningsskiktet och kontroll skikt för sena larvstadier av C. elegans. Använd bilden mask med designen I (L1, figur 1C) och design II (L2, figur 1C) för basala flödet lagret och kontroll lager respektive för Drosophila / zebrafisk larver i skivor belagda med SU8-2050 (beredd iN steg 1,6). Frilägg SU8 ytorna genom foto masken till 200 watt UV-lampa under 15 sek.
  10. Placera de exponerade kisel bitar på en varm platta med det belagda skiktet på toppen. Post baka skivorna vid 65 ° C under 1 min följt av 95 ° C under 10 minuter. Låt bitarna svalna innan du fortsätter till nästa steg.
  11. Utveckla bitarna med hjälp av SU8 utvecklare lösning för 20 minuter. Skölj bitarna i iso-propylalkohol (IPA) och blås torrt med kvävgas.
  12. Placera kisel bitar i en exsickator med SU8 mönster ovanpå. Coat bitarna med 50 pl tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silan ånga i en exsickator under 2 timmar.

Försiktighetsåtgärder: Ta försiktighetsåtgärder för kemisk hantering under KOH behandling, fotoresistbeläggning och utveckling. Silan ångbeläggning bör utföras i en exsickator i ett ventilerat utrymme. Skydda SU8 motstå från över exponering för ljus. Använd skyddsglasögon med UV-light källa.

2. PDMS Mögel Fabrication

  1. Framställ 10:01 PDMS genom att kombinera 50 g Sylgard 184 bas med 5 g härdare i en plastkopp. Blanda innehållet manuellt för ~ 3 min. Avgasa blandningen inuti en exsickator för att avlägsna alla luftbubblor som bildats under blandning.
  2. Häll en 5 mm tjock PDMS blandningen över kiselskivor med SU8 mönster för design II för kontroll lagret, försiktigt för att undvika uppkomsten av luftbubblor. I fall bubblor bildas under hällning, avgasa PDMS på SU8 mönstret i lågt vakuum för att avlägsna alla bubblor.
  3. Placera kiselskivor med SU8-2025 mönster för design I, för flödet lagret på spinnare chuck och slå på vakuum för att hålla dem. Täck skivorna med ~ 1 ml PDMS blanda och belägga skivorna med SPIN150 spinner vid 500 rpm under 5 sekunder, följt med 1.500 rpm i 30 sek.
  4. Päls ~ 1 ml PDMS blandningen på kiselskivor med 80 nm SU8-2050 mönster av design I (L1, figur 1B), förströmningsskikt för sena larvstadier av C. elegans använder SPIN150 spinnaren vid 500 rpm under 5 sekunder, följt med 1.000 rpm i 30 sek. Coat ett tjockt skikt av PDMS blandningen på kisel bitar med SU8-2050 mönster av strömningsskikt design jag (L1, figur 1C) för Drosophila / zebrafisk larver, med SPIN150 spinner vid 500 rpm i 35 sek.
  5. Baka PDMS-belagda kisel bitar av design jag och wafers med motsvarande konstruktion II för kontroll skikt innehållande PDMS för C. elegans och / eller Drosophila / zebrafisk larver i en varm luft konvektionsugn vid 50 ° C under 6 timmar.
  6. Klipp ut PDMS bit från kiselsubstratet innehåller SU8 mönstret II för C. elegans och / eller Drosophila / zebrafisk larver med hjälp av en vass kniv. Stansa ett litet hål ~ 1 mm diameter på toppen av reservoaren förbinder huvudsakliga fällan i PDMS formen med hjälp av en Harris hålslag.
  7. Placera den stansade PDMS blocket (som innehåller 40 um tjock mögel för kontrollskiktet L2) på en plastbricka, med den formade sidan av kontroll skiktet uppåt. Placera PDMS belagda kiselskiva som innehåller 40 um tjock SU8 design jag på samma bricka, med PDMS belagda ytan vänd uppåt. Sätt in plåten i kammaren av plasma renare och slå på vakuum i 2 min. Därefter slår du på plasma-strömmen och sänk kammaren tryck tills kammaren blir ljust rosa till färgen. Exponera båda ytorna till 18 Watt luftplasma under lågt vakuum under 2 minuter.
  8. Placera den stansade PDMS blocket bort från 80 um tjock SU8 master innehåller mönster II för sent larvstadier av C. elegans eller Drosophila / zebrafisk larver på en plastbricka med den gjutna sidan av kontrollen lagret uppåt. Placera motsvarande bakade PDMS skikt spinnbelades på kiselskivan innehållande 80 ^ m tjock konstruktion I för senare C. elegans steg eller Drosophila / zebrafisk larver samtidigt på samma facket med platta PDMS belagda surface uppåt. Använd samma protokoll som nämns ovan för att utsätta dem för luftplasma.
  9. Placera de två plasma behandlade ytorna för C. elegans och / eller Drosophila / zebrafisk larver tillsammans med lätt tryck och grädda dem i varm luft konvektionsugn vid 50 ° C under 2 timmar.
  10. Klipp ut de bundna enheter från kiselsubstratet med SU8 design jag för C. elegans och / eller Drosophila / zebrafisk larver. Stansa tillträde hål vid inloppet och utloppet reservoarer av strömningskanalen.
  11. Placera bundna PDMS mögel på en plastbricka för C. elegans, med den formade sidan av flödet lager design uppåt. Rent glas täckglas (22 x 22 mm, nr 1 tjocklek) och placera den på samma plastbricka. Sätt in magasinet med PDMS mögel och glas täckglas inuti plasmakammaren. Exponera den nedre PDMS yta av anordningen och täckglas till 18 W luftplasma vid lågt tryck under 2 minuter. Placera de två plasma behandlade ytor med genTLE tryck och grädda dem i varm luft konvektionsugn vid 50 ° C under 2 timmar.
  12. Förvara enheten i en ren miljö för framtida bruk.

3. Ytterligare steg för Drosophila / Zebrafish enhet

  1. Exponera ren glasyta av storlek 2 cm X 2 cm med 50 pl tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silan ånga i en exsickator under 2 timmar.
  2. Spin ~ 1 ml 10:01 PDMS blandningen som framställts i steg 2,1 på silaniserade glasytan med SPIN150 spinner vid 500 rpm i 35 sek. Baka PDMS-belagda glassubstrat i en varmluftsugn vid 50 ° C under 6 timmar med den belagda ytan vänd uppåt. Låt PDMS skiktet att svalna till rumstemperatur innan man fortsätter till nästa steg.
  3. Punch belagda skiktet med en anpassad byggd vassa hålslag vid mitten av PDMS, för att bilda PDMS distansskiktet. Formen av metall hålslag är utformad liknande flödet design för Drosophila / zebrafisk (L1, figur 1C
  4. Exponera PDMS distansskiktet och den enda bundna blocket (strömningsskikt och kontroll lager, i steg 2,9 för Drosophila / zebrafisk larver) till 18 Watt luftplasma med plasma renare vid lågt vakuum. Placera de två plasma behandlade ytorna tillsammans och baka dem i en varmluftsugn vid 50 ° C under 2 timmar.
  5. Skär bundna enheten från glaset, stansa tillträde hål vid inloppet och utloppet reservoarer och binda den till en täckglas (22 X 22 mm, nr 1 tjocklek) med användning av en plasma-renare som nämns i steg 2,11. Detta skulle ge en immobilisering anordning för första stadiet Drosophila larver med en kanal höjd av ~ 500 | im. För zebrafisk larver, duplicera PDMS spacer processen lager tillverkning med ytterligare bindning steg. Den dubbla lager av PDMS-S ger en kanal höjd 900 nm för 30 HFP zebrafisk larver.

Försiktighetsåtgärder: Undvik dammpartiklar under enhetens tillverkning. Två plasma rengjorda ytans måste vara helt dammfri för korrekt bindning. Förvara anordningarna i en exsickator i situationer där ett speciellt rena rum är inte tillgänglig för att minimera ackumulering av dammpartiklar i anordningar.

4. Använda PDMS membran

  1. Anslut ena änden av en mikro-flex slang (innerdiameter ~ 1,6 mm, ytterdiameter ~ 4,8 mm) till en trycksatt kvävgas tillförsel regulatorn och den andra änden till de viktigaste fällan reservoaren genom en 18 gauge nål (yttre diameter ~ 1,25 mm) limmas på röret. En 3-vägs avstängningskran som används i mitten av röret anslutning tillåter tillämpning eller frigöring av trycket på membranet.
  2. Fyll röret anslutet till PDMS anordningen med en 10 cm kolonn av destillerat vatten innan den ansluts till behållaren av den huvudsakliga fällan av ett C. elegans och / eller Drosophila / zebrafisk larver enhet.
  3. Vrid ventilen av kvävetillförseln att läsa 14 psi och övervaka membranet av den huvudsakliga fällan avböja mot the flödeskanal vid låg förstoring av ett inverterat mikroskop. Längd av vattenpelaren i mikro-böjlig slang komprimeras när 3-vägs avstängningskran är öppen. Kanter avlänkade membranet är synliga i genomlysning (Figur 1I och 1J). Membran nedböjning orsakar förskjutning av dammpartiklar / bubblor under PDMS membranet och driver dem till kanalen gränser.
  4. Vänta tills den flytande fronten fyller mikrokanalen helt utan någon instängd luft.
  5. Släpp trycket med hjälp av 3-vägs avstängningskran att slappna av membranet till sitt viloläge.

5. Sätta C. elegans, Drosophila och zebrafisk larver i enheten och immobilisera dem under Flexibel PDMS membran

  1. Fyll flödeskanalen med M9-buffert [3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O till 1 L, sterilisera genom autoclaving] för C. elegans 18 eller 1X PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, H 2 O till 1 L, sterilisera i autoklav] för Drosophila / zebrafisk larver 19 under 10 min innan en experimentet.
  2. Hitta en enda C. elegans av erforderlig steg på en NGM platta 18 (eller första stadiet Drosophila larver från agar ägg tallrik eller manuellt dechorionated 30 HPF zebrafisk larver i flytande medium 20) med hjälp av en låg mikroskop förstoring stereo. Plocka ett enda djur med en liten volym av buffertlösning i en mikro spets. Använd en mikro spets med sin ändskär att rymma större Drosophila eller zebrafisk larver i buffert.
  3. Tryck enda organism genom flödeskanalen inlopp. Justera pipettering trycket att placera enskilda djuret under den huvudsakliga fällan.
  4. Öka trycket PDMS membranet sakta för att placera djuret mot ChanNEL gräns och immobilisera den med 14 psi tryck för C. elegans, 7 psi för Drosophila och 3 psi för zebrafisk larver.
  5. Placera den immobiliserade djuret i centrum av den mikroskopiska synfältet. Använd ett inverterat mikroskop vid önskade inställningar för hög upplösning ljusfält eller fluorescensavbildning. Förvärva en eller tidsförlopp fluorescens bilder med fördefinierad bildhastighet.
  6. Släpp trycket fällan och övervaka förflyttning av djuret i 5-10 min vid låg förstoring.
  7. Spola djuret och infoga en ny djur att upprepa stegen ovan.
  8. Tvätta alla djur från avfallsbehållaren med destillerat vatten appliceras med hjälp av en spruta. Torka kanalen genom att trycka luft med hjälp av en spruta för framtida återanvändning.

Försiktighetsåtgärder: Djur som kräver högre pipettering tryck strömma inuti huvudkanalen tenderar att visa dålig förflyttning / hälsa efter frisläppandet från fällan och bör undvikas för imaging. Rengör flödeskanal för varje spår av buffert för att förhindra tilltäppning av kanalen av kristaller. Om olja används för högupplösande avbildning, rengör slip glasskyddet att kunna upprätthålla bra signal-brus-förhållande för efterföljande experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immobiliseringen anordningen är ett dubbelskikt PDMS blocket tillverkas genom att binda två skikt: ett flöde (Layer 1) och en kontroll (Layer 2), såsom visas i figur 1. Den huvudsakliga fällan är ansluten till en kvävgas cylinder genom en regulator och en 3-vägs avstängningskranen för att tillämpa nödvändig (3-14 psi) på membranet genom en vätskepelare (Figur 1A). Den avböjda membranet immobiliserar C. elegans, Drosophila eller zebrafisk larver i flödeskanalen utformad med olika dimensioner (figur 1B och 1C). Foto masker används för att utforma skikt immobilisering enhet med olika geometrier för C. elegans (figur 1D), Drosophila larver (figur 1F) och zebrafisk larver (figur 1G). Kanal höjd strömningsskiktet (h1 i figur 1E, 1K) varierades med användning av olika hastigheter spinnbeläggning att rymma ellerganisms med olika diametrar inuti flödeskanalen. Strömningsskikt höjder tillverkades vid 40 pm, 80 pm, 500 pm och 900 nm för C. elegans larvstadier, vuxen C. elegans, första stadiet Drosophila larver och zebrafisk larver respektive (tabell 1). Enheten med en strömningskanal höjd 40 um är lämplig från L1 till början L4 C. elegans larver. En enhet med ett 80 nm flödeskanal höjd används för sent L4 larver och vuxna C. elegans när vulva börjar skjuta. De större zebrafisk anordningarna kan också användas för äldre Drosophila larver. PDMS membrantjockleken (m) tillverkades vid 40 pm och 300 um för C. elegans och Drosophila / zebrafisk enheter respektive. Höjden på mikroflödessystem kanalen i skikt 2 var tillverkat vid 40 um för tidiga larvstadier av C. elegans och 80 um för sena larvstadier av C. elegans och Drosophila/ Zebrafisk larver. Höjden av flödeskanalen, membran och styrkanal mättes i anordningar tillverkade i flera oberoende satser och befanns vara konsekvent inom ± 5 pm från varandra. Enheten använder en teknik membran deformation (figur 1H-J) för att immobilisera organismer i flödeskanalen.

Organismer Flödeskanalen (PDMS-1) Spin villkor för flödeskanalen Spacer PDMS (PDMS-S) Spin villkor för distansorganet PDMS Immobilisering tryck (psi)
C. elegans (L1 till början L4) 40 um (SU8-2025) 500 rpm (5 sek), 2.000 rpm (30 sek) NA NA 14
C. elegans (sena L4 och vuxna) 80 &mu, m (SU8-2050) 500 rpm (5 sek), 2.000 rpm (30 sek) NA NA 14
Drosophila (första stadiet) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sek), 2.000 rpm (30 sek) 400 fim (PDMS) 500 rpm (35 sek) 7
Zebrafisk (30 HPF) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sek), 2.000 rpm (30 sek) 2X 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sek) 3

Tabell 1. Device dimensioner flödeskanalen (PDMS-1) och distansen PDMS skikt (PDMS-S) som används i C. elegans och Drosophila / zebrafisk enheter.

C. elegans L4 larver immobiliserades i 80 um rännhöjden PDMS mikroflödessystem enhet med 14 gas psi kväve (Figur 2A). Time-lapse fluorescens bilder were förvärvats vid en hastighet av 2 bildrutor per sekund (fps) med en 60X mål (numerisk apertur 1,4, olja mål) för avbildning transport av mitokondrier visualiseras med hjälp av en mitokondriell matris riktad GFP i nervceller Touch receptor 21. Samtliga 400 ramar omvandlades till kymographs med ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) och mitokondrier klassificerades som anterogradely riktade (bort från cellkroppen), retrograd riktade (mot cellkroppen) eller stationär (figur 2E). Vi observerade mitokondriella transporter upp till 21 psi immobilisering tryck, men flödet var något större vid den lägsta immobilisering trycket. Den anterograd och retrograd flöde av mitokondrier uppmättes till 1,1 ± 0,23 och 1,6 ± 0,22 vid 7 psi medan 0,8 ± 0,25 och 1,2 ± 0,34 vid 14 psi tryck immobilisering. Värdena var inte statistiskt annorlunda från 1,1 ± 0,33 och 1,3 & plusmn, 0,42 erhållits från djur immobiliseras med användning av 3 mM levamisol (p-värden> 0,45, n = 30 djur).

De större enheter med 500 um höjd kan användas för att immobilisera första stadiet Drosophila larver (figur 2B) och 28-30 HPF zebrafisk larver (figur 2D). Dissektion av första instars Drosophila larver kan vara en utmaning. Däremot mikrofluidikanordningar tillhandahålla en metod för att utföra hög upplösning ljust fält och / eller fluorescens avbildning med intakta organismer. Individuell Drosophila larver immobiliserades med 7 psi komprimerad kvävgas (Figur 2B, tabell 1) och fluorescens bilder av synaptotagmin.eGFP transport i sensoriska neuroner förvärvades (figur 2C). Time-lapse-filmer visade rörliga och stationära synaptotagmin markant last i sensoriska neuroner (figur 2F). Genomsnittlig anterograd och retrograd hastighet mättes från Kymographs vara 0,92 ± 0,04 | im / s och 1,00 ± 0,05 | im / s respektive (n = 6 djur, n> 40 segment). Dessa är jämförbara med hastigheter av synaptotagmin bär transporter vesiklar mätt i dissekerade Drosophila motoriska neuroner flyttar både anterogradely (0,84 ± 0,05 fim / s) och retrograd (0,76 ± 0,03 fim / s) 22.

Liknande anordningar med 900 pm höjd användes för att immobilisera olika stadier av zebrafisk larver (figur 2D, tabell 1). Zebrafisk larver under dess tidiga utvecklingsstadier vänder sin svans var 10 till 15 sekunder och är vanligtvis immobiliseras med 0,02% tricaine (MS-222) i lösning eller om montering medier för hög upplösning avbildning 23. Vår PDMS-enheten tillhandahåller ett alternativt sätt för snabb immobilisering och eliminerar behovet av en otillförlitlig monteringsmedium i den optiska banan vid hög upplösning avbildning 24. Vi dechorionated manuellt 28-30 HPF larver och immobiliserade dem individuellt i en PDMS enhet med 3 gas psi kväve att förvärva tidsförlopp filmer av larver hjärtslag. Graden av hjärtslag uppmättes till 136,8 ± 1,6 per min (n = 8 filmer) och var liknar andra publicerade rapporter 25.

Vår enkla mikrofluidikanordning redan visats för att mäta en mängd olika sub-cellulära och cellulära händelser i vild typ C. elegans 4. I vår mikrofluidikanordning, vild typ C. elegans visar ett större antal last såsom synaptiska vesiklar som rör sig i neuroner jämfört med djur som är immobiliserade med anestetika. Dock hade vi testat inte våra enheter för muterade djur för att se om dessa fynd håller sant. För att testa detta har vi använt en stark hypomorphic mutant i kinesin3 / UNC-104 molekylär motor, unc-104 (e1265), som transporterar presynaptiska vesiklar 26. Vi jämförde flödet av GFP :: RAB-3 märkt presynaptisk vesilarna i främre laterala mechanosensory nervceller immobiliserade i narkos och enheten immobiliserade muterade aniamls (Figur 3A). Flöde av presynaptiska vesiklar var större flöde i anordningen immobiliserade djur jämfört med data som erhållits från unc-104 djur sövda i 1 mM levamisol (figur 3B, 3C) 27. Detta visar att avbildning starka transporter defekta mutanter i mikroflödessystem enheter kommer sannolikt att vara ett mer effektivt sätt att samla in data. Vi visar också att andra last, t.ex. dendritiska transport av glutamatreceptorer i URY neuroner kan avbildas i anordningen immobiliserade djur (figur 3D, 3E). Enheten kan också användas för att avbilda cellulära processer under tidig C. elegans utveckling som Q-neuroblast division L1 djur. Den QR cellen avbildades att dela bilda två dotterceller QR.a och QR.p ~ 3 timmar efter kläckning (Figur 3F) överensstämmer medtidigare observationer 28.

Tabell 1. Device dimensioner flödeskanalen (PDMS-1) och distansen PDMS skikt (PDMS-S) som används i C. elegans och Drosophila / zebrafisk enheter.

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av PDMS mikroflödessystem enheter för genetiska modellorganismer. (A) organism laddas med hjälp av en mikro spets in i flödeskanalen och immobiliseras med komprimerad kvävgas regleras med en regulator och ventil. Anordningen är lämplig för ljusfält / fluorescens avbildning i ett inverterat mikroskop. Konstruktionen består av en 10 mm lång flödeskanal (design jag, L1) och en styrkanal (utformning II, L2) för respektive C. elegans (B) och Drosophila / zebrafisk larver (C). Dimensionerna anges på design (B och C). (D, F, G) Schematisk various skikt av PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS-membran, PDMS-S och Glas) närvarande i ett C. elegans, Drosophila och zebrafisk immobilisering anordning. (E) Schematisk återgivning av ett tvärsnitt av anordningen som visar huvuddelen PDMS skiktet (PDMS-2), en spinnbelades PDMS skikt (PDMS-1) för att bilda ett flexibelt membran och ett distansorgan PDMS skikt (PDMS-S) för att lägga till höjd till flödeskanalen (för Drosophila / zebrafisk enhet). Hela strukturen binds irreversibelt till en optisk kvalitet täckglas att rymma organismen (cirkeln i brunt). Den schematiska visar höjd styrkanalen "h2", flödeskanal 'h1 ", stansade distansskikt" s "och membrantjockleken" m ". (H) Anger membranet avböjning mot flödeskanalen i närvaro av vätskepelaren under tryck i styrkanalen. Ljusfält bilder visas av en fri (I) och avböjda membran (J) under noll och 14 psi tryck vätskepelare respektive. Pilen och pilspets indikerar bubbla uNDER och ut ur membranet i flödeskanalen respektive. (K) tvärsnittsarea bild av C. elegans anordningen tagen vid platsen för immobiliseringen området. Skala bar är 50 um (K) och 200 ^ m (I, J). (D, F, G) Schema är inte skalenliga. Klicka här för att se större bild .

Figur 2
Figur 2. Imaging genetiska modellorganismer immobiliserade i en mikroflödessystem enhet. Ljusfält bild av en immobiliserad C. elegans (A), en första stadiet Drosophila larver (B) och en 30 HPF zebrafisk larver (D) i en PDMS mikroflödessystem enhet. Kymograph analys av tidsförlopp avbildning av jsIs609, ett C. elegans stam, som uttrycker en mitokondriell matris riktad GFP i en främre lateral mechanosensory neuron (ALM) av en enhet Immobilized djur (E). Mitokondrier klassificeras som anterograd ("ner" pilspets), retrograd ("upp" pilspets) och stationära ("star" märke) i kymograph. (C) Fluorescens bild av ett intakt första stadiet Drosophila larv. Boxen anger platsen där hög upplösning time-lapse avbildning av syt.eGFP transporten sker i en kolinerg neuron. Montage av fem ramar som förvärvats vid 5 Hz med ramnummer anges på varje bild och GFP märkt last visas som anterograd, bakåtsträvande och stationära i montaget (F). Rutan i (D) anger det område som övervakades för beräkning graden av hjärtslag zebrafisk larver. Skala bar är 5 um (F), 10 ^ m (E), 100 pm (A, B) och 200 ^ m (D).

Figur 3
Figur 3. Cellulär och sub-cellulära avbildning i C. elegans med PDMS mikroflödessystem enheter. (A) Schematisk bild av en myraerior sidled mechanosensory (ALM) neuron med anterograd och retrograd riktningar markerade. Den streckade rutan visar den region avbildas för axonal transport. 350 bilder förvärvas med hjälp av en snurrande skiva konfokalmikroskop på 5 bps med cellkroppen (CB) på höger och nerv ring (NR) till vänster. Data analyseras med kymographs för djur immobiliserade i en anordning eller med användning av 1 mM levamisol (C). Cargo rör sig i anterograd och retrograd riktningar visas med pilar som pekar "ner" och "upp" respektive. (B) Anterograd och bakåtsträvande flöde av partiklar som observerats i unc-104 (e1265) djur i en 20 nm region i ALM neuron över 350 tidsfördröjda ramar. (D) Schematisk bild av en URY neuron som används för att avbilda GFP märkta glutamatreceptorer transporter. 350 tidsfördröjda ramar omvandlas till kymographs som visar last rör sig i anterograd och retrograd riktning i djur immobiliserade i PDMS-enhet eller med användning av 1 mM levamisol (E). Time-lapse bilder som förvärvats under kvartal neuroblast division och migration i tidiga larvstadier av C. elegans. (F) Tre time-lapse ramar som visar QR genomgår division att bilda sin dotter celler QR.a och QR.p. Skala bar är 5 um (C, E och F). Data som representeras i (B) är medelvärde ± SEM (n> 4). Jämförelser görs med avseende på värden erhållna i narkos och betecknas med * (p <0,05) och ** (p <0,005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS mikroflödessystem enheter är optiskt transparent kan därför användas för högupplöst in vivo avbildning av en transparent / genomskinlig modell organism. Vår design är lämplig för hög förstoring tid och rum avbildning av cellulära och sub-cellulära händelser i intakta levande djur. Mikrofabrikation med mjuk litografi teknik möjliggör enkel hantering av enheten dimensioner för olika storlekar av modellorganismer. Enheter av olika storlekar tillverkas för olika stadier av C. elegans, Drosophila larver och zebrafisk larver. Enheter med olika höjder på 40 pm och 80 pm i deras flödeskanaler skiktet uppvisar förbättrad immobilisering och bättre efter-avbildning hälsa av både tidiga (L1) och senare (sent L4) stadier av C. elegans respektive. Vi uppnår en 100% framgång i Komponentframställning för C. elegans och Drosophila / zebrafisk utan defekta enheter. Enheter kan användas flera gånger tillsstyrkanalen är förorenad med dammpartiklar eller bakterietillväxt. Enhet immobiliserade C. elegans visar större last flöde i både vildtyp och mutanta djur jämfört med bedövades djur. Enhet immobilisering eliminerar behovet tekniskt utmanande dissektion protokoll speciellt för tidiga utvecklingsstadier av Drosophila larver 29.

Momentana immobilisering protokoll i PDMS mikroflödessystem enheter har en inneboende fördelen att reducera experimentell tid jämfört med de typiska längre exponeringstider behövs för externt applicerade bedövningsmedel. Alla immobiliserade organismer återgå till normal förflyttning inom 5-10 minuter efter offentliggörandet av trycket på den deformerbara PDMS membranet. C. elegans är immobiliserade vid gränsen av strömningskanalen och bort från den centrala delen av immobiliseringen membranet. Djur som immobiliserade i mitten av strömningskanalen visar dålig hälsa efter immobilizaning och dö inom en dag eller två. Vår mikroflödessystem anordningen har använts för att hålla L4 steg C. elegans orörlig under upp till en timme under membranet utan att påverka dess hälsa eller senare utveckling. Djur immobiliserade kortare tid (upp till 10 minuter) kunde fångas flera gånger för avbildning. För tidiga utvecklingsstadier, C. elegans immobiliserades med något lägre tryck (7 psi) för långsiktiga tidsförlopp experiment (~ 3 timmar). Djur immobiliserade under membranet efter frigörande fanns kvar i samma enhet under den mellanliggande tiden. Dessa djur är jämförbara med vildtyp i både deras utveckling och allmänna hälsa. Vuxen C. elegans immobiliserade med lägre tryck (7 psi) visade långsam avdrift under högupplösta tidsförlopp experiment och kräver komplexa analysverktyg för transport analys. Men lägre tryck användes för att utföra långtidsstudier som Q-neuroblast celldelning / migration under ~ 3 timmar eller semi kvantitativ mitochondria transporter karakterisering, processer som inte behöver fullständig immobilisering. Således lägre tryck för immobilisering kan användas beroende på datamängden som måste samlas in.

Time-lapse avbildning av L4 C. elegans visar saltatorisk rörelse av GFP märkta mitokondrier i ALM neuronen (stam jsIs609) som har rapporterats för nervceller i andra modellsystem 30-32. Vissa mitokondrier i dessa nervceller visar dubbelriktad transport medan majoriteten av dem är stationära under hela filmen. Trots små skillnader i flöde vi fortsätta att använda 14 trycket psi immobilisering vid C. elegans att få fullständig immobilisering och undvika varje förändring under hög upplösning time-lapse avbildning av axonal transport. Vi föreslår att du använder 14 psi i en allmän protokoll och beroende på experimentella behov kan detta antingen ökas eller minskas. Djuren tog nästan samma tid att återgå till normal locomotion från både lägre och högre immobilisering tryck och immobiliserade djur utvecklade identiskt som odlats utan immobilisering.

Anordningen när tillverkas med större dimensioner med distanselement skikt kan användas för större modellorganismer såsom Drosophila och zebrafisk larver. Avbildning av synaptotagmin.eGFP transport i intakta första stadiet Drosophila sensoriska neuroner visar aktiv transport i både anterograd och retrograd riktningar. Den genomsnittliga hastigheterna mätt i enheten immobiliserade larverna högre jämfört med de värden som uppmätts i dissekerade motoriska nervceller 22. Denna skillnad kan uppstå snabbare insamling av data i våra experiment (5 Hz v / s 1,1-1,4 Hz), neuron-specifika skillnader i organell transporter (sensoriskt v / s motoriska neuroner) och / eller effekterna på grund av dissekering.

Våra tidigare experiment genomfördes uteslutande vildtyp djur 4, så vi huruvidaavbildning mutanter i mikroflödessystem enheter var också fördelaktigt. Time-lapse avbildning av C. elegans L4 djur visar minskad flöde av GFP :: RAB-3 markerade presynaptiska vesiklar i kinesin3/unc-104 mutanter immobiliserade i 1,0 mM levamisol jämfört med flussmedel mätningar erhållna i djur immobiliserade med vår PDMS enhet (figur 3B). Vi har ofta observerat och visar ett exempel (figur 3C) som i mutanter mycket liten transporter observeras om djuren är immobiliserade med anestetiska koncentrationer som immobiliserar vildtyp djur. Antalet vesiklar rör sig i unc-104 djur är betydligt högre när vi använder mikrofluidikanordningar. Sövda djur visar liknande transportegenskaper när den placeras under 14psi tryck anbringas på PDMS membranet (figur 3B). Liknande observationer har också gjorts i vildtyp djur 4. Dessa data tyder på att den ökade flödet inte kan uppstå immobilisering under kväve men på grund av ett protokoll som var mindre skadliga för intracellulär transport.

I princip kan andra händelser såsom kalcium dynamik och celldelning alla avbildas i intakt Drosophila / zebrafisk larver också. Post-avbildning återvinning av enhet immobiliserade djur är mindre skadlig för organismen livskraft 4 och därmed sådana anordningar kan också användas för att utföra en långsiktig avbildning av genetiska modell genetiska organismer för händelser som inträffar över en längre tidsperiod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Krishanu Ray för Drosophila aktier, Tarjani Agarwal för att upprätthålla en Drosophila bur, Peter Juo för nuIs25 och CGC för C. elegans stammar. SPK gjorde jsIs609 i Michael Nonet laboratorium. Vi tackar Arpan Agnihotri (BITS Pilani) för hans hjälp i tid-lapse avbildning av mitokondrier transport av jsIs609 djur i mikroflödessystem enheter. Vi är tacksamma till Dr Vatsala Thirumalai och Surya Prakash för att förse oss med zebrafisk embryon. Vi tackar Dr Krishna och CIFF vid nationella centralbankerna för användning av roterande skiva konfokalmikroskop stöds av Institutionen för teknik och naturvetenskap, Centrum för nanoteknik (nr SR/55/NM-36-2005). Vi tackar också Kaustubh Rau, V. Venkatraman och Chetana Sachidanand för diskussioner. Detta arbete har finansierats av DBT postdoktorala stipendium (SM), DST snabba system (SM) och en DBT bidrag till (SPK). SA stöddes av DST och CSIR bidrag till SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Bioteknik molekylärbiologi neurovetenskap Microfluidics, zebrafisk larver bedövningsmedel pre-synaptisk vesikel transporter dendritisk transport av glutamatreceptorer mitokondriell transporter synaptotagmin transporter hjärtslag
Enkla mikroflödessystem enheter för<em&gt; In vivo</em&gt; Avbildning av<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Och zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter