Methodenartikel

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

DOI:

10.3791/4282

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23. April 2013

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1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Zusammenfassung

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Elektrochemische Sensoren sind weit verbreitet für die schnelle und genaue Messung des Blutzuckerspiegels verwendet werden und kann für den Nachweis einer Vielzahl von Analyten angepasst werden. Elektrochemische Sensoren arbeiten nach Transduktion einer biologischen Erkennung Veranstaltung in ein nützliches elektrisches Signal um. Die Signalübertragung erfolgt durch Koppeln der Aktivität eines Redox-Enzym zu einer amperometrischen Elektrode. Sensor Spezifität entweder eine inhärente Eigenschaft des Enzyms Glucoseoxidase bei einer Glucose-Sensor, oder ein Produkt der Verknüpfung zwischen dem Enzym und einem Antikörper oder der Sonde.

Hier beschreiben wir einen elektrochemischen Sensor Assay-Verfahren direkt zu erfassen und zu identifizieren Bakterien. In jedem Fall sind die hier beschriebenen DNA-Sonden-Oligonukleotide. Diese Methode basiert auf Sandwich-Hybridisierung von capture und der Fühler mit Ziel ribosomalen RNA (rRNA) basiert. Die Fänger-Sonde an den Sensor Oberfläche verankert, während der Detektor-Sonde an h gebunden istorseradish Peroxidase (HRP). Wenn ein Substrat, wie 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) mit einer Elektrode mit capture-Ziel-Detektor Komplexe gebunden an dessen Oberfläche zugegeben wird, wird das Substrat durch HRP oxidiert und reduziert durch die Arbeitselektrode. Das Redox-Zyklus führt pendelt der Elektronen durch das Substrat von der Elektrode zum HRP, wodurch Strom in der Elektrode.

Einleitung

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Mit rRNA als Zielmolekül für bakterielle Nachweis und zur Identifizierung hat eine Reihe von Vorteilen. Die Fülle der rRNA in bakteriellen Zellen sorgt für eine Nachweisgrenze von nur 250 Bakterien pro Milliliter, ohne die Notwendigkeit für Zielamplifikation 1. Bakterielle rRNA enthält eindeutige Spezies-spezifischen Sequenzen, die zugänglich Hybridisierung mit DNA-Sonden sind. Folglich kann eine Anordnung von elektrochemischen Sensoren verwendet werden, um unbekannte Bakterien, wobei jeder Sensor mit einer unterschiedlichen Spezies-spezifische Fangsonde funktionalisierte identifizieren. Positive Control-Sensoren sollten für ein synthetisches Oligonukleotid Ziel, dass "Brücken" die Gefangennahme und der Fühler eine interne Kalibrierung zu erzeugen einbezogen werden.

Elektrochemische Sensoren haben eine breite Palette von Grundlagenforschung und translationale Forschung. Zum Beispiel beschriebene Test hier wurde verwendet, um präzise die Wirkung von E. coli Wachstumsphase auf RRnA und pre-rRNA Kopie Zahlen, die von großem Interesse für die Forscher in der bakteriellen Physiologie 2 interessiert ist. Die Empfindlichkeit des elektrochemischen Sensors Assay wird durch das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt. Eine Vielzahl von Signalverstärkung und Rauschunterdrückung Methoden erforscht worden. Wir finden, dass die Verbesserung der Chemie der Sensoroberfläche Schlüssel zur Verringerung der unspezifischen Bindung von Detektor-Sonde und / oder HRP-Enzym. Insbesondere wurde eine gemischte Monoschicht Alkandithiolen und Mercaptohexanol erwiesen Hintergrund durch Abdecken der Elektrodenoberfläche vollständiger Beibehaltung Zugänglichkeit der Einfang-Sonde für Zielhybridisierung 3 zu reduzieren. Diese Oberflächenchemie Behandlungen sind besonders wichtig für die Assays, die komplexen biologischen Proben.

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Protokoll

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1. Funktionalisierung von Elektrochemische Sensoren

  1. Vorbereiten des thiolierten Fangsonde mit einer Konzentration von 0,05 uM in 300 uM 1,6-Hexandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min . Inkubation der thiolierten Einfangsonde mit HDT sorgt dafür, dass die Thiolgruppe auf der Capture-Sonde reduziert wird, was zu mehr konsistente Ergebnisse.
  2. Tragen Sie einen Stickstoffstrom auf blankem Gold 16 Sensorarraychips (e) für 5 Sek. Feuchtigkeit und / oder Partikel zu entfernen.
  3. Übernehmen 6 ul der HDT-thiolierten Einfangsonde Mix zur Arbeitselektrode aller 16 Sensoren des Sensor-Arrays und speichern den Sensorchip (s) in einem überdachten Petrischale bei 4 ° C über Nacht. Thiolierte Fangsonden binden direkt auf den blanken Goldelektrode und der HDT wirkt, um Überspritzungen der Fangsonden verhindern und halten sie in einer gestreckten Konformation, die eine Hybridisierung mit dem Ziel fördert.
  4. Diefolgenden Tag, waschen Sie den Sensor-Chip mit deionisiertem H 2 O für 2-3 sec und trocken unter einem Strom von Stickstoff für 5 sek.
  5. Anwenden 6 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-Mercapto-1-hexanol (MCH) an die Arbeitselektrode von allen Sensoren 16 und Inkubation für 50 min. Dieser und alle nachfolgenden Sensorchip Inkubationen werden in einem bedeckten Petrischale bei Raumtemperatur durchgeführt. MCH wirkt als Blockierungsmittel, Auffüllen der Lücken in dem thiolierten Fangsonde oder HDT nicht vorhanden ist auf der Elektrodenoberfläche.

2. Probenvorbereitung

  1. 1 ml der Bakterienkultur in der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 ≈ 0,1) zu einem Mikrozentrifugenröhrchens und Zentrifuge bei 16.000 xg für 5 min. Entfernen Sie den Kulturüberstand. Das bakterielle Pellet kann unmittelbar weiterverarbeitet oder bei -80 ° C für die spätere Verwendung.
  2. Gründlich resuspendieren die bakterielle Pellet in 10 ul 1 M NaOH, indem die Pipettenspitze zu dem Bottom des Mikrozentrifugenröhrchens und Auf-und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren der Suspension bei Raumtemperatur für 5 min.
  3. Neutralisieren des bakteriellen Lysat durch Zugabe von 50 ul 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, enthaltend 2,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,25 mM eines Fluorescein-modifizierten Detektorsonde. Inkubieren des neutralisierten Lysats für 10 min bei Raumtemperatur. Fluorescein-modifizierten Detektorsonden mit bakteriellen rRNA Zielmoleküle hybridisieren.

3. Elektrochemische Sensor Assay

  1. Waschen der MCH vom Sensorchip mit deionisiertem H 2 O für 2-3 Sekunden gewaschen und unter einem Stickstoffstrom für 5 Sekunden.
  2. Übernehmen 4 ul neutralisiert Bakterienlysat zur Arbeitselektrode jeder 14 Sensoren und die Proben für 15 min. Ziel-Detektorsonde Komplexe immobilisiert thiolierten Fangsonden hybridisieren.
  3. Übernehmen 4 ul 1 nM Überbrückungsoligonukleotids in 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, mit 2,5% BSA und 0,25 μ M Fluorescein-modifizierten Detektorsonde bis 2 positive Kontrolle Sensoren (für Signal-Normalisierung) und Inkubation für 15 min.
  4. Waschen des Sensorchips mit deionisiertem H 2 O für 2-3 Sekunden gewaschen und unter einem Stickstoffstrom für 5 Sekunden.
  5. Übernehmen 4 ul von 0,5 U / ml anti-Fluorescein-HRP in 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, mit 0,5% Casein zur Arbeitselektrode aller 16 Sensoren und die Proben für 15 min. Die Anti-Fluorescein-HRP bindet an die immobilisierten fluoresceinmodifiziertem der Fühler.
  6. Waschen des Sensorchips mit deionisiertem H 2 O für 2-3 Sekunden gewaschen und unter einem Stickstoffstrom für 5 Sekunden.
  7. Tragen Sie einen Film auch Aufkleber auf der Oberfläche des Sensorchips und Last in den Sensor-Chip Halterung. Je 50 ul TMB Substrat, auf allen 16 Sensoren und schließen Sie den Sensor-Chip Halterung.
  8. Erhalten Amperometrie und Cyclovoltammetrie Messungen für alle 16 Sensoren mit der Helios Chip Reader. Amperometric Strom ist proportional zur Geschwindigkeit der TMB reduction auf der Sensoroberfläche (siehe Abbildung 1).

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Ergebnisse

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Wir beschreiben einen elektrochemischen Assay, ähnlich einer Sandwich-ELISA strukturiert. Wie in 1, Ziel ribosomalen RNA (rRNA) Hybridisierung mit Erfassung und der Fühler durch eine Redox-Reaktion katalysiert HRP konjugiert an Anti-Fluorescein-Antikörper-Fragmente, die an das 3'-Fluorescein-Verknüpfung gebunden auf dem Detektor-Sonde entwickelt gezeigt. Ein wichtiger Bestandteil der Empfindlichkeit des Assays ist die Oberflächenchemie des Goldelektrode. Wir haben gefunden, dass eine ternäre Monoschicht...

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Diskussion

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Der elektrochemische Sensor beschriebenen Test hier ermöglicht die schnelle Detektion von Nukleinsäure-Targets. Sensitivität und Spezifität hängen teilweise von der freien Energie der Target-Sonden-Hybridisierung, die ihrerseits abhängig von der Länge und GC-Gehalt der Erfassung und der Fühler. Wir üblicherweise die Schritte Hybridisierung bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Jedoch können die Hybridisierung der Schritte (3.2 und 3.3) auch bei höheren Temperaturen in einem Wärmeschrank durchgeführt werden, wen...

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Offenlegungen

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Alle Autoren sind Erfinder von Patenten relevant zu den beschriebenen Methoden. Eines dieser Patente hat Qvella Corporation lizenziert. BMC und DAH haben Kapitalanteil in Qvella Corporation. VG ist der Präsident der GeneFluidics, die der Hersteller der elektrochemischen Sensor-Array-Chip, Chip-Halterung und Chip-Leser in diesem Papier beschrieben.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von Cooperative Agreement Auszeichnung AI075565 (bis DAH) von der National Institute of Allergy and Infectious Diseases und durch die Wendy und Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Forschung gefördert. BMC ist die Judith und Robert Winston Chair in Pediatric Urology.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Mercapto-1-hexanol (MCH)Sigma451088Bei Raumtemperatur lagern
1,6-Hexanedithiol (HDT)SigmaH-12005Bei Raumtemperatur lagern
Thiolierte EinfangsondenOperon N/ABei 100 μm lagern; M in 0,1x TE bei -20 ° C
Fluorescein-modifizierte DetektorsondenOperon N/ABei 100 μm lagern M in 0,1x TE bei -20 ° C
Überbrückendes OligonukleotidOperon N/ABei 100 μm lagern; M in 0,1x TE bei -20 ° C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab-FragmenteRoche11 426 346 910Bei 4 > C
Helios Chip ReaderGeneFluidicsGFR-2009
Sensor Chip MountGeneFluidicsGFR-003
Filmschacht-AufkleberGeneFluidicsLieferung mit Sensorchips
Blanke goldene 16-Sensor-Array-Chips GeneFluidicsSC1000-16X-BIn 100% N2 bei Raumtemperatur lagern
Rinderserumalbumin SigmaA7906Lagern bei 4 > C
1M Phosphatpuffer, pH 7,2 0,35M NaH2PO4, 0,65M K2HPO4, angepasst an pH 7,2
Blocker Casein in PBS Pierce37528einem gleichen Volumen von 1M Phosphatpuffer verdünnen, pH 7,2, bei 4 & Grad lagern; C
Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung.
Mit

Referenzen

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  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
  11. Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

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Schlagwörter

Ribosomal RNASandwich HybridizationHorseradish PeroxidaseTMB SubstrateSensor Array ChipCapture ProbeDetector ProbeFluorescein Conjugate

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