Mit Hilfe Luciferase und in vivo bildgebende Systeme (IVIS) als neuartiges Mittel gegen Krankheiten Endpunkte zu identifizieren, bevor klinische Entwicklungen auftreten. IVIS hat uns erlaubt, in Echtzeit visualisiert die Invasion der encephalitische Viren über mehrere Tage, eine genauere Krankheit Modell für zukünftige Studie. Es hat uns auch die Möglichkeit, die potenziellen Schutzfunktionen von Virostatika und Impfstoffen schneller als derzeit genutzt Tiermodellen zu identifizieren. Die Fähigkeit, einzelne Tiere über mehrere Zeitpunkte zu nutzen sorgt für reduzierte Tier, Kosten und allgemeine Morbidität der Tiere genutzt sorgt für eine menschlichere und wissenschaftlichen Mitteln der Krankheit Studie.
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Methodenartikel
In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Moderne Entwicklungen in der Imaging-Technologie zu fördern Weiterentwicklung und Verfeinerung in der Weise viralen Forschung durchgeführt. Zunächst von Russel und Burch in Humes 3R vorgeschlagen (Replacement, Reduction, Refinement), ist die Verwendung von Tiermodellen in der wissenschaftlichen Forschung unter dem ständigen Druck, neue Methoden zu identifizieren zu Tierversuchen zu reduzieren, während die Verbesserung der wissenschaftlichen Genauigkeit und Geschwindigkeit. Eine große Herausforderung für Humes Schulleiter ist jedoch, wie zu gewährleisten, die Studien sind statistisch genaue gleichzeitiger Reduzierung von Tierseuchen Morbidität und Gesamtzahlen. Die Wirksamkeit des Impfstoffes Studien verlangen derzeit eine große Anzahl von Tieren, um als statistisch signifikant werden und oft in hohen Morbidität und Mortalität Endpunkte zur Identifizierung von Immunschutz führen. Wir verwendeten in-vivo Imaging Systems (IVIS) in Verbindung mit einem Glühwürmchen biolumineszenten Enzyms schrittweise verfolgt die Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) von einem ENCEphalitic Virus in einem Mausmodell. Typischerweise wird die Krankheit relativ langsam voranschreitet, jedoch Virusvermehrung erfolgt rasch, insbesondere innerhalb des ZNS, und kann zu einer oft letalen Ausgang führen. Nach intranasale Infektion der Mäuse mit TC83-Luc, ein attenuiertes modifiziertes venezolanischen Pferde-Enzephalitis-Virus-Stamm zu drückt ein Luciferase-Gen; können wir Virusreplikation innerhalb des Gehirns sichtbar mindestens drei Tage vor der Entwicklung klinischer Krankheitssymptome. Mit Hilfe CNS Invasion als Schlüssel encephalitische Krankheitsentwicklung Endpunkt sind wir in der Lage, schnell zu identifizieren therapeutische und Impfschutz gegen TC83-Luc Infektion bevor klinische Symptome entwickeln. Mit IVIS Technologie sind wir in der Lage, die schnelle und genaue Prüfung von Medikamenten Therapeutika und Impfstoffe zeigen, bei gleichzeitiger Reduzierung der Anzahl der Tiere und Morbidität.
Protokoll
Ein. Tierische Vorbereitung
- Tierische Ankunft: Bei der Ankunft des Tieres Sicherheitsstufe 2 (ABSL2) Einrichtungen, damit sich die Tiere ein Minimum von 2 Tagen bis an ihre neue Umgebung zu gewöhnen. Nach dieser Ruhepause, überprüfen Sie die Tiere, um ihre Gesundheit und das allgemeine Aussehen bewerten.
- Bei Ausnutzung fluoreszierenden Reporter ist es wichtig, alle tierischen Probanden auf einer Luzerne freie Diät zu platzieren, um die Menge von GI Autofluoreszenz-und Hintergrund-Signal zu begrenzen.
- Shave Tiere: Um die Biolumineszenz-Signal von dem Oberkopf während der Bildgebung erkannt zu verbessern; rasieren die Köpfe aller Tiere. Betäuben die Tiere mit einem Gemisch aus Sauerstoffgas und verdampft Isofluran. Sobald die Tiere vollständig betäubt sind, verwenden elektrische Haarschneidemaschine den Kopf rasieren. Einmal mit Rasieren abgeschlossen, kehren die Tiere zu ihren Käfigen und beachten zur vollständigen Erholung von den Wirkungen der Anästhesie.
- Bio Medic DatenSysteme (BMDS) Transponder Insertion (zu Ort nach der Rasur der Mäuse zu nehmen, während die Tiere narkotisiert sind voll): Für eine weniger invasive Mittel zur Temperatur Implantat verfolgen eine vorprogrammierte BMDS drahtlosen Transponder subkutan in die dorsale Region von jeder Maus. Diese Transponder können zur drahtlosen Identifikation und Temperatur Aufnahme. Nach der Implantation des Transponders, gelten ein Veterinär-grade Gewebeklebstoffes auf die Wunde.
- Baseline-Kollektion: Vor der Infektion, notieren eine Grundlinie Temperatur und Gewicht für alle Tiere. Sammle Blut für Plaquereduktion Neutralisationstest (PRNT) Analyse durch retro-orbitale (RO) bluten, während die Mäuse unter Narkose sind. Nach der Blutentnahme, gelten Veterinär antibiotische Augensalbe mögliche sekundäre bakterielle Infektion zu verringern. Diese Basislinie Sammlung sollte unter Berücksichtigung der Anzahl von Malen die Tiere in Narkose durch Stress auf den Mäusen platziert abgeschlossen sein. Zukünftige RO Kollektionen should nach der Bebilderung abgeschlossen sein, während die Maus noch unter Betäubung. Die maximale Blut aus einer RO erhoben werden sollten rund 200 ul sein.
- Infektion: Place Mäusen unter Narkose wie zuvor beschrieben. Beimpfen durch den intranasalen Weg mit einer Dosis von 5x10 6 bis 5x10 7 pfu TC83-Luciferase in einem Gesamtvolumen von 40 ul von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch intranasale Infektion. Nach der Infektion, legen die Mäuse in ihren Gehäusekäfig und beobachten Erholung.
2. Animal Imaging
Disclaimer: Halten Mäuse innerhalb ihrer Wohneinheit, die Biosicherheitswerkbank (BSC) oder die XIC Aufbewahrungsbox zu allen Zeiten. Die genehmigten BSCs für dieses Protokoll sind eine Klasse II Typ B1 oder B2.
- Injizieren alle Tiere mit 10 ul pro Gramm Körpergewicht intraperitoneale (IP) Luciferin in einer Konzentration von 15 mg / ml.
- Mäuse, die Ampligen sind injecte seind IP in einer Dosis von 12,5 mg / kg Körpergewicht bei -4 h nach Infektion oder 48 h nach Infektion auf ihren Gruppe.
- Vor der Injektion mit Luciferin, trennen Sie die Mäuse in Gruppen von drei bis eine gute Passform im XIC-3 Aufbewahrungsbox gewährleisten.
- Für alle Bildgebung verwenden okularen Salbe / Schmiermittel, das Trocknen der Hornhaut während des gesamten Verfahrens zu verhindern.
- Öffnen Sie die LivingImage Software und drücken Sie auf Initialisieren, um die Imaging-box vorzubereiten; set auto sparen, Belichtungszeit auto (Belichtungszeit auf auto ist ein neues Feature des LivingImage Software 3.2 und höher), sehen Feld C und Filter zu öffnen, Feld aus betrachtet sich auf die Anzahl von Mäusen Sie sind bildgebende basiert; und Filter optimiert wie für andere Imagingprojekte benötigt.
- Bestätigen Sie, dass die Luft Kohlefilter noch nicht abgelaufen sind, ist der Sauerstoff Tank voll, und die Isofluran Reservoir gefüllt ist. Legen Sie kleine Streifen Isolierband in der XIC-3 isolation Box, die hilft bei der Verringerung der Tier-Bewegung während der Bildgebung.
- Inject die Mäuse mit Luciferin IP wie in den Abschnitten 2.1 und innerhalb der Isofluran Ansaugkammer (mit geöffnetem Deckel) beschrieben für 3-5 min.
- Nach 5 min, schließen Sie den Deckel der Ansaugkammer und starten Sie den Fluss von Isofluran. Die Narkose wird auf etwa 3-5% mit dem Sauerstoff der eingestellten Förderleistung bei etwa 2,0 L / min betrieben. Einmal vollständig unbewussten warten weitere 30 sec und übertragen Sie die Maus auf den XIC-3 Isolation Box. Sicherstellen, dass die Biosicherheitswerkbank wird ausgenutzt ermöglicht den sicheren Abfangen von Isofluran da dieses Verfahren Verlust von Isofluran aus der Ansaugkammer (die IVIS Gerät enthält einen eigenen Passive Messe Kanister und die XIC-3 Aufbewahrungsbox direkt an den in / out Anschlüsse umfassen wird zu enthalten Anästhesie Durchfluss zu gewährleisten).
- Übertragen Sie die Maus auf Chip / group Zahl basiert in den XIC-3 Isolation Box mit der Isofluran-Anschluss befestigt eind öffnen. Positionieren Sie die Maus, so dass sie in Brustlage mit Köpfen sanft ruhen auf den Klebestreifen gelegt.
- Wischen Sie die XIC Aufbewahrungsbox mit Ethanol, Spray Hände und Unterseite des XIC-3 mit CaviCide, und Transfer zum IVIS Bildgebung Kammer. Schließen Sie die Anästhesie der Aufbewahrungsbox einmal in der Bildeinheit.
- Nach 10 min nach der Injektion von Luciferin, Bild die Mäuse durch die lebende Bildsoftware.
- Nach anfänglichen Bildgebung mit einem offenen Filter, initiieren DLIT 3-Dimensional Imaging mit der Sequenzanalyse und Image Wizard Setup für Biolumineszenz Glühwürmchenluciferase. Dieses Abbildungsverfahren dauert 4-5 Minuten und sollte bei einem Sichtfeld, die für die gewünschte Anzahl an Mäusen durchgeführt werden.
- Ex-vivo-Analyse möglich folgenden Sektion und Sammlung des Gehirns. Legen Sie das Gehirn auf eine sterile Petrischale, tropft 50-100 ul auf Lager Luciferin am Anfang, und innerhalb der imaGing Box.
- Finalize einen zweiten offenen Filter Bild bei 15-17 min nach der Infektion nach Abschluss der DLIT Bildgebung. Stellen Sie sicher, Sequenzanalyse ausgeschaltet ist und das Sichtfeld und Filter-Einstellungen werden auf die vorherigen Einstellungen zurück.
3. Zurück Mice and Data Analysis
- Schalten Sie das Isofluran Verdampfer und übertragen die XIC Aufbewahrungsbox zurück zum Biosicherheitswerkbank.
- Legen Sie die Maus zurück in ihre Wohneinheit, schließen Sie die obere, sprühen Sie das Gehäuse mit geeigneten Desinfektionsmittel und Ort wieder auf das Gehäuse Rack.
- Stellen Sie sicher, Mäusen vollständig aus der Narkose erholt.
- Wiederholen Sie den Vorgang, wie das Experiment benötigt, bis Bildgebung abgeschlossen ist.
- Desinfizieren Sie die BSC, fahren Sie das Gerät, und übertragen alle Daten auf einem externen Labor Standort für die weitere Analyse.
- Analysieren Sie die Daten und generieren 3-dimensionale Bilder auf IVIS Ergebnisse uti BasisLízing die LivingImage Software.
- Sicherstellen, dass das Bild korrekt ausgerichtet ist und Beleuchtung / Farbbalance eingestellt ist. Innerhalb der Werkzeug-Palette der Optionen gehören Bildeinstellung, Korrekturen, Bildinformationen und ROI Tools.
- Nutzen ROI Formen zu bestimmten Signalstärken nach Standort zu identifizieren.
- Rekonstruktion der Oberflächentopographie mit der Maus Körper markieren, initialisieren 3D DLIT Wiederaufbau, und verwenden lineare Anpassung an die Orgel Karte der topographischen Rekonstruktion gesetzt.
- Weitere virale Titration Analyse kann durch die Sammlung von Blut und Organen abgeschlossen sein. Titration in dieser Studie durch Homogenisierung von Gehirngewebe in modifiziertem Eagles Medium (MEM) fertig gestellt. Das Homogenat wurde seriell verdünnt und wir infiziert eine 6-Well-Platte von Vero-Zellen für 1 Stunde. Die Zellen wurden mit einer 1,5% agarose/2xMEM Overlay abgedeckt und für 2 Tage bei 37 Grad. Zellen wurden mit 10% Formalin für 30 Minuten fixiert und mitKristallviolett.
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Ergebnisse
Mit einem genetisch veränderten Virus, TC83-Luciferase, sahen wir einen Anstieg der Biolumineszenz Signalstärke als die Virusvermehrung bewegt sich von der nasalen Region in den zentralen CNS (Abbildung 1). Aufgrund der hohen Rate Virusreplikation erwarten wir hohe biolumineszenten Signals (2A) in Abhängigkeit von dem Vektor und dem Tier Immunreaktion auf den Vektor zu erkennen. Wir erwarten, dass diese Signalanhebung auf einen Spitzenwert weiterhin, zwischen den Tagen 5-7 nach der Infe...
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Diskussion
Während dieses Protokoll umfasst die bildgebende Aspekte für die in vivo-Analyse ist es wichtig, um die biolumineszierende Vektor als ein Schlüsselfaktor für zukünftige Studien erkannt. Unsere Ausnutzung TC83, einem attenuierten Impfstamm von VEEV, als Vektor für die Expression von Luciferase gewährleistet, daß große Mengen des Enzyms produziert werden aufgrund der sehr Replikation des Virus im ZNS, wie zuvor 1-4 beschrieben. Während die Zugabe eines zweiten subgenomischen Promotor und den Luciferase...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Institute for Translational Sciences UTMB-NIH 1UL1RR029876-01 und Alisha Prather für ihre Unterstützung bei der Videobearbeitung für dieses Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| D-Luciferin | |||
| Isofluran | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-Gas Anästhesie-System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4,0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetrie / Identifikations-Chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Tier-ID und Tempertur |
| BD Integra 1ml TB Spritze mit 26 gx 3/8 "Nadel | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond Gewebekleber | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Augensalbe | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Dient zur Sonde Informationen downloaden |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
