Method Article

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

DOI:

10.3791/50231

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January 6th, 2013

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1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

In This Article

Summary

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Lasermikrodissektion ist eine Technik, die die Gewinnung von ausgewählten Zellen aus winzigen Mengen von Parenchym ermöglicht. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlicher Pankreasinseln aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien verwendet werden. Unser Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen und erleichtert so ihre Sammlung.

Abstract

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Lasermikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die Rückgewinnung ausgewählter Zellen und Geweben von winzigen Mengen von Parenchym 1,2 ermöglicht. Die präparierten Zellen können für eine Vielzahl von Untersuchungen, wie transkriptomischen oder Proteom-Studien, DNA Beurteilung oder Chromosomenanalyse 2,3 verwendet werden. Eine besonders anspruchsvolle Anwendung von LMD Transkriptomanalyse ist, die aufgrund der Labilität der RNA 4, besonders ausgeprägt, wenn die von Geweben, die reich von RNasen, wie der Bauchspeicheldrüse sind seziert kann. Ein Protokoll, das Mikrodissektion schnelle Identifikation und Erfassung von Zielzellen ermöglicht ist in dieser Einstellung, um das Gewebe Handhabung zu verkürzen und damit zu RNA-Konservierungsmedien zu gewährleisten.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlichen Pankreas-Beta-Zellen aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien 5 verwendet werden. Kleine Stücke der Bauchspeicheldrüse von etwa 0,5-1 cm 3 wurden von den gesunden erscheinenden Rande der resezierten Bauchspeicheldrüse Proben, in Tissue-Tek OCT Compound eingebettet, sofort gekühlt 2-Methylbutan zerteilt gefroren und bei -80 ° C bis zum Schneiden. Vierzig Serienschnitten von 10 um Dicke wurden auf einem Kryostaten bei -20 ° C eine Einstellung geschnitten, individuell auf Glasobjektträgern im Kryostat für 1-2 Minuten getrocknet, und bei -80 ° C überführt

Unmittelbar vor der Lasermikrodissektion Verfahrens wurden die Schnitte fixiert in eiskaltem, frisch zubereitete 70% Ethanol für 30 sec. gewaschen, um 5-6 Dips in eiskaltem DEPC-behandeltem Wasser und entwässert durch zwei einminütigen Inkubationen in eiskaltem 100% Ethanol gefolgt von Xylol (welches zum Gewebe Dehydratisierung verwendet) für 4 min; Gewebeschnitte wurden dann luftgetrocknet anschließend für 3-5 min. Wichtig ist, dass alle Schritte, mit Ausnahme der Inkubation in Xylol, wurden mit eiskaltem Reagenzien - eine Änderung über einen zuvor beschriebenen Protokoll 6. Utilization eiskaltem Reagenzien führte zu einem deutlichen Anstieg der intrinsischen Autofluoreszenz der Beta-Zellen, und erleichtert ihre Anerkennung. Für Mikrodissektion wurden vier Abschnitte dehydratisiert jeweils erneut beiden wurden in einer Folie umwickelte 50 ml Röhrchen gegeben, um das Gewebe vor Feuchtigkeit schützen und Bleichen; die verbleibenden zwei wurden sofort mikrodissezierten. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung eines PALM MicroBeam Instrument (Zeiss) unter Verwendung der Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) Modus. Der Abschluss der Beta-Zell-/ Insel Dissektion von vier Kryoschnitten nicht länger als 40-60 min benötigt. Zellen wurden in ein AdhesiveCap gesammelt und lysiert mit 10 ul Lysepuffer. Jede einzelne RNA Probe für Transkriptom-Analyse wurde durch die Kombination von 10-Zellen mikrodissezierten Proben, gefolgt von RNA Extraktion mit dem Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus) erhalten. Dieses Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen, um so ihren schnellen und präzisen Erkennung und collection. Weitere Verbesserung dieses Verfahrens konnte ermöglichen die Dissektion der phänotypisch unterschiedlichen Beta-Zellen, mit möglichen Folgen für ein besseres Verständnis der Veränderungen mit Typ 2 Diabetes.

Protocol

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Ein. Freezing of Human Pankreasgewebe

  1. Entfernen Fettgewebe, Blutgefäße, Nerven und nicht Parenchymgewebe mit einem Skalpell und Pinzette, und schneiden Sie das Pankreasgewebe in Stücke (~ 0,5-1 cm große Würfel schneiden).
  2. Legen Sie eine Pankreasgewebe Stück in der Mitte eines Cryomold, und decken Sie es komplett mit kaltem Tissue-Tek OCT Compound. Legen Sie die Cryomold in ein Gefäß, dessen Boden mit vorgekühlten 2-Methylbutan und Snap-freeze in flüssigem Stickstoff bedeckt. Bewahren Sie die gefrorene Probe bei -80 ° C.

2. Herstellung von Gefrierschnitten

  1. Tragen Sie Handschuhe bei allen Schritten zur Denaturierung der RNA zu vermeiden.
  2. Reinigen Sie den Kryostaten Messer, Probenhalter und Pinsel mit kaltem 100% Ethanol und RNase Away. Legen Sie die gefrorenen Gewebe im Inneren des Kryostaten.
  3. Warten Sie, bis das Gewebe, Messer und Pinsel zu erreichen -20 ° C. Beschriften Sie die SuperFrost Plus Objektträger und pre-cool sie innerhalb der Kryostatkammer während der Wartezeitfür das Gewebe zu erreichen -20 ° C.
  4. Übernehmen Sie die Tissue-Tek OCT Compound auf dem Probenhalter und legen Sie die gefrorenen Gewebe an der Spitze.
  5. Sobald das Tissue-Tek OCT Compound eingefroren trimmen cryoblock und entfernen Sie über Tissue-Tek OCT Compound mit einer Rasierklinge.
  6. Schneiden Sie insgesamt 40 aufeinanderfolgende 10 um Scheiben aus dem Pankreasgewebe Block. Zusätzlich empfehlen wir das Schneiden eines ersten und mittleren Scheibe für Übersichtszeichnungen des Pankreas Abschnitt, der die Identifizierung von Inseln innerhalb der Scheiben erleichtern kann während der Mikrodissektion eingespart werden.
  7. Übertragen Sie die Abschnitte aus der Messerklinge in die Mitte eines SuperFrost Plus Objektträger berühren die Rückseite der Folie mit dem Finger (abgedeckt mit einem Handschuh) zum Aufwärmen nur die Region, in die der Abschnitt einzuhalten haben.
  8. Trocknen Sie die Abschnitte 1-2 min innerhalb des Kryostaten bei -20 ° C, nach denen Sie steckte sie in eine Folie Box auf Trockeneis gelegt. Bewahren Sie die Abschnittebei -80 ° C.
  9. Falls notwendig, reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern und kalt 100% Ethanol.

3. Dehydratisierung von Gefrierschnitte

  1. Bereiten Sie die Reagenzien: pour 30 ml frisch zubereitet 70% Ethanol, 30 ml DEPC-behandeltem Wasser, 2x30 ml 100% Ethanol und 30 ml Xylol in 50 ml CELLSTAR Röhren (Falcons); Kälte und halten alle Reagenzien (außer Xylol) auf Eis.
  2. Reinigen Sie den Arbeitsbereich unter der Haube mit 100% Ethanol und RNaseZAP.
  3. Prozess zwei Kryoschnitten wie folgt: in eiskaltem 70% Ethanol fix für 30 sec, waschen mit 5-6 schnelle Dips in eiskaltem DEPC-behandeltem Wasser, zweimal austrocknen für 1 min in eiskaltem 100% Ethanol inkubieren 4 min in Xylol bei Raumtemperatur (25 ° C), und an der Luft trocknen für 3-5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen Paar von Kryoschnitten.
  4. Legen Sie zwei getrocknete Kryoschnitten zurück in eine 50 ml CELLSTAR Rohr mit Aluminiumfolie eingewickelt, um sie vor Licht und Feuchtigkeit zu schützen sichern.

4. Laser Mikrodissektion der Beta-Zellen mit PALM MicroBeam, Zeiss

  1. Reinigen Sie das Mikroskop mit RNaseZAP und montieren Sie die Adhesive Cap im RoboMover.
  2. Legen Sie die folgenden Einstellungen: Filter-Set 09 (Anregung: 450-490 nm, Emission> 515 nm), AutoLPC-Modus, 50% Laserenergie, 65% Laserfokus, 100% Laser-Geschwindigkeit, 5 mm Abstand zwischen AutoLPC Schüsse, 6 um Abstand die Linie, Arbeitshöhe: -10.100.
  3. Legen Sie ein Abgleiten in die Bühne.
  4. Suchen Sie die autofluoreszierenden Beta-Zellen unter dem Mikroskop Visualisierung (5x oder 10x Objektiv).
  5. Wechseln Sie zu dem 40x Objektiv, wählen Sie die Beta-Zellen mit dem "Freehand" Auswahl-Werkzeug und microdissect sie mit dem Laser.
  6. Nehmen Sie das Gewebe von vier dehydrierte Kryoschnitten in einem AdhesiveCap.
    Kommentar 1: Die Zeit, um die Beta-Zellen ein dehydrierte Kryoschnitt sezieren sollte nicht länger als 10-20 min Rehydratation der Gewebeschnitte, die dazu führen würde, zu vermeidenRNA-Abbau.
    Bemerkung 2: überprüfen Sie die erfolgreiche Mikrodissektionsverfahren durch visuelle Inspektion nach dem Umzug von der Bühne zum Checkpoint.

5. Lyse von mikrodissezierten Beta-Zellen Enriched Tissue

  1. Entfernen Sie die AdhesiveCap aus dem RoboMover.
  2. Pipet 10 ul Extraktionspuffer (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) in den Deckel des AdhesiveCap und inkubieren sie auf den Kopf bei 42 ° C für 30 min.
  3. Spin-Down bei 10.000 xg und legte das Lysat auf Trockeneis. Speichern sie bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion durchgeführt wird.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.) Bis 5.) Mit allen anderen Abschnitten.

6. RNA-Extraktion

  1. Kombinieren Sie alle zehn 10 ul Lysaten
  2. Verfahren mit der RNA-Isolierung durch Arbeiten bei Raumtemperatur gemäß dem Protokoll des PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, unter Verwendung eines 1:1-Verhältnis Extraktionspuffer (XB) zu 70% Ethanol (einschließlich DNase Behandlung).

7. RNA-Analyse

  1. Verwenden Sie 1 ul RNA für die Analyse von Qualität und Quantität mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (picoChip). Quantitative Auswertung ist in Bezug auf eine Standard-RNA parallel auf dem Chip geladen getan.

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Results

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Wie in 1 gezeigt, führte die modifizierte Dehydratisieren Protokoll zu einer Verbesserung der Betazellen Autofluoreszenz im Vergleich zum vorherigen veröffentlichten Protokoll 6. Aufbringen der beschriebenen Protokolls wurde jedes der 39 Proben verwendet chirurgischen Pankreas bis 40 serielle Kryoschnitten für einen Durchschnitt von 3 31'544'704 um Gewebe / Probe Pankreas (Bereich: 8'742'390 - 81'522'153 um 3) zu erzeugen wie in Tabelle 1 gezeigt. Dies s...

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Discussion

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Wir beschreiben einen zuverlässigen Ansatz für die Laser-Mikrodissektion (LMD) der menschlichen Inselzellen von chirurgischen Pankreas Probe. Sofern ein LMD Mikroskop zur Verfügung steht, könnte dieses Verfahren an irgendeiner Forschungseinrichtung Ausführung partieller Pankreatektomien umgesetzt werden, wodurch sich Zugang zu menschlichen Inseln Material aus beiden Nicht-Diabetiker und Typ 2 Diabetikern. Dies ist besonders relevant in Anbetracht der Mangel an Bauchspeicheldrüsen für Inselisolierung angeboten. Vorteilha...

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Wir wollen alle unsere Kollegen, die Hilfe, Rat und kritischen Input auf verschiedenen Stufen des Projektes bedanken. Die Produktion dieses Video Artikel wurde aus Mitteln IMIDIA (unterstützt http://www.imidia.org ), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) mit dem Deutschen Zentrum für Diabetesforschung (DZD, http://www.dzd -ev.de ) und das Universitätsklinikum Carl Gustav Carus an der Technischen Universität Dresden. Die Arbeiten, die zu dieser Veröffentlichung wird unterstützt von der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking erhalten unter Finanzhilfevereinbarung n ° 155005 (IMIDIA), Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und EFPIA bestehen Unternehmen in Form von Sachleistungen.

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Materials

Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
2-Methylbutan (Isopentan) ROTH 3927,1
AdhesiveCap (opak, 500 ul) ZEISS 415190-9201-000
CELLSTAR Röhrchen (50 ml) Greiner Bio-One 210 261 mit Unterstützung skirt
CELLSTAR Röhrchen (50 ml) Greiner Bio-One 227,261
Diethylpyrocarbonat (DEPC) SIGMA D 5758
Trockeneis
Ethanol absolut VWR 20821.310
Flüssiger Stickstoff
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way Einbettformen (abgeschnitten), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internen 22x22 mm, Tiefe 21 mm
Arcturus PicoPure Gefrorene RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Kunststoff-Klemme
Rasierer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel /Chirurgische Klingenanordnung Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus Haftung Objektträger Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 oder 0807000022
Pinzette BRAUN BD168R
Xylol VWR 28975.291

References

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  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
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