Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Summary

Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Abstract

Zelle Strukturierung Technologien, die schnell, einfach zu bedienen und erschwinglich sind, werden für die zukünftige Entwicklung von Hochdurchsatz-Zell-Assays, Plattformen zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen und Gewebe technischer Systeme benötigt werden. Diese detaillierte Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen von Co-Kulturen von Zellen unter Verwendung von biokompatiblen Lösungen von Dextran (Dex) und Polyethylenglykol (PEG), die Phasentrennung bei über dem Schwellenwert Konzentrationen kombiniert. Zellen können in einer Vielzahl von Konfigurationen unter Verwendung dieses Verfahrens strukturiert werden. Zellausschlussschicht Strukturierung kann durch Drucken von Tröpfchen DEX auf einem Substrat und Abdecken mit einer Lösung von PEG mit Zellen durchgeführt werden. Die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen gebildet bewirkt Zellen um die Außenseite des DEX Tröpfchens fallen und bilden eine kreisförmige Lichtung die für die Migration Assays verwendet werden kann. Zelle Inseln können durch den Verzicht auf eine Zelle reichen DEX Phase in eine PEG-Lösung oder durch Abdecken des DEX strukturiert werdenTröpfchen mit einer Lösung von PEG. Co-Kulturen können direkt durch die Kombination Zellausschlussschicht mit DEX Insel Strukturierung gebildet werden. Diese Verfahren sind mit einer Vielzahl von Liquid-Handling Ansätze, einschließlich manueller Mikropipettiervorrichtung und können mit nahezu jedem adhärenten Zelltyp eingesetzt werden.

Introduction

Wässriger Zweiphasensysteme (ATPSs) bilden, wenn Lösungen aus zwei inkompatiblen Polymeren miteinander bei ausreichend hohen Konzentrationen vermischt. Phasentrennung wird durch eine Vielzahl von Faktoren, die das Molekulargewicht und die Polarität der Polymeren, Temperatur der Lösung, pH-Wert und ionischen Gehalt der wässrigen Lösungsmittel ^{1, 2} umfassen beeinflusst. Der Punkt, an dem die beiden Polymerlösungen separaten von den physikochemischen Eigenschaften des ausgewählten Phasen-System bestimmt wird, sondern erfolgt in der Regel bei niedrigen Polymer Konzentrationen (weniger als 20% wt / wt) unter nicht-denaturierenden Bedingungen, wodurch ATPSs für Biotechnologie eingesetzt werden Anwendungen ^3-9.

Die mit Abstand am intensivsten untersuchten ATPS ist die Polyethylenglykol (PEG) / Dextran (DEX) System. Die ATPS durch diese kostengünstig und biokompatiblen Polymeren gebildet wurde ursprünglich zur Reinigung von Biomolekülen über molekulare Partitionierung ^{2, 10} beschrieben. Abtrennungtritt bei zusätzlichen Molekülen oder Partikeln, die nicht dem Phasensystem beitragen mit PEG und DEX werden gemischt. Basierend auf ihren relativen Affinitäten für entweder DEX oder PEG, werden die Moleküle oder Teilchen bevorzugt in einer der beiden Phasen oder an der Schnittstelle befinden. Eine weitere Eigenschaft des PEG / DEX ATPS ist die Existenz der Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymer-Phasen. ATPSs von PEG und DEX gebildet zeigen im Allgemeinen Grenzflächenspannungen, die viel niedriger als in anderen Flüssig-Flüssig-Zwei-Phasen-Systeme wie Öl und Wasser, aber die Grenzflächenspannung Kräfte üben noch immer Auswirkungen auf kleine Partikel wie Viren, Zellen und Proteinaggregate ^{2 , 11-13.} Da schließlich höhermolekularen PEG und DEX separaten bei niedrigen Konzentrationen (weniger als 5% Gewicht / Gewicht für Polymere mit hohem Molekulargewicht Sorten) in Anwesenheit von physiologischen Konzentrationen von Salzen, gibt es wenige oder gar keine schädlichen Wirkungen auf Säugetierzellen innerhalb dieser eingearbeitet Systeme^14-16.

Kürzlich haben die Grenzflächeneigenschaften und Partitionierung Wirkungen ATPSs von unserem Labor für Zelle Strukturieren ^{14, 16-20} angewandt. Dies wurde durch Mikrostrukturierung eine dichtere Lösung auf DEX Zellkultursubstraten in Gegenwart von PEG durchgeführt. Wenn Zellen in die PEG-Phase eingearbeitet sind, werden sie aus der Eingabe der DEX Tröpfchen aufgrund PEG / DEX Grenzflächenspannung ²⁰ ausgeschlossen. Wenn Zellen in der DEX Phase gemustert werden, werden sie an der Oberfläche des Substrats durch Zellkultur Grenzflächenspannung und Partitionierung ^{16, 17, 19} beibehalten.

Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Musterbildung Zelle ist ATPS Zelle Strukturieren einfach zu erlernen und erfordert nur rudimentäre Wissen über die Polymere selbst, und die Fähigkeit zur Zellkultur durchzuführen und eine Mikropipette. Andere Methoden zur Zelle Strukturierung beinhalten oft spezielle Ausrüstung und Ausbildung, die nicht leicht zu th übersetzte Life Sciences. Zum Beispiel können einige Methoden (Mikrokontaktdrucken oder Tintenstrahldruck)-Muster Zellen indirekt durch Aufbringen von Mustern zelladhäsive Biomoleküle an einem Kultursubstrat, das anschließend als Stellen für die Zellanheftung ^{21, 22} dienen. Obwohl indirekten Ansätzen nützlich für einige Zelltypen sind, erfordern sie einen hohen Grad an Geschicklichkeit und Benutzers Spezialausrüstung die Musterbildung Werkzeug herzustellen, und können Spezifität fehlt Abhängigkeit von der speziellen Zelltyp / Biomolekül Muster. Alternativ können Zellen, die mit hoher Spezifität Muster durch direkte Strukturierung Ansätze, die laminare Strömung Strukturieren, stenciling und ^23-26 gehören Tintenstrahldruck abgeschieden werden. Jedoch erfordern diese Techniken auch Benutzerexpertise und Spezialausrüstung und kann Zellen während des Druckprozesses zu beschädigen. Obwohl diese Ansätze in der Regel produzieren präzise Muster der Zellen, Zell-Strukturierung ein nützliches Werkzeug in den Lebenswissenschaften zu sein, muss es kostengünstig a seinnd einfach zu implementieren.

Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von strukturierten Zellkulturen mit den ATPSs in unserem zuvor veröffentlichten Anwendungen beschrieben. Mit nur Mikropipetten können Anwender Zellausschlussschicht Zonen oder Zelle Inseln Zellmigrationsassays. Dies wird mittels PEG / DEX Grenzflächenspannung, die entweder beibehält Zellen im DEX Phase oder schließt Zellen in der PEG-Phase vom abgeschiedenen DEX erreicht. Durch Kämmen diese beiden grundlegenden Strukturieren Techniken ist es möglich, schnell zu generieren Co-Kulturen von Zellen wie Leber-Fibroblastenzelle Co-Kulturen. Strukturierungsverfahren, ATPS Parametern und erwarteten Ergebnisse sind in Einzelheiten beschrieben.

Protocol

Ein. Phase-System Charakterisierung: Ermittlung Schwellenwerte für Phase Separation

1. Planen Lösungen enthaltend PEG und DEX in dem gewünschten Puffer oder Zellkulturmedium, wie in Figur 1 (lila Punkte) in 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen gezeigt. Im Folgenden wird PEG und DEX auf 35 kDa PEG und 500 kDa DEX beziehen, aber kritischen Konzentrationen ändert sich je nach den beiden Polymeren verwendet. Notieren Sie sich die Masse von PEG und DEX in jeder Lösung. High-Konzentration Polymerlösungen kann mehrere Stunden dauern, sich aufzulösen. Vortexen für Serum-freie Lösungen verwendet werden. Für Medien, die Proteine ​​oder Serum, legen Sie die Rohre auf einer rocken Stufe bis beide Polymere vollständig gelöst sind. Das Gewicht der verwendeten Medien, die Polymere auflösen und beachten Sie die anfänglichen Konzentrationen.
2. Sobald die Polymere vollständig gelöst sind, sollten die Lösungen erscheinen möglich. Dies ist der erste Hinweis darauf, dass eine Phasentrennung erfolgt ist. Um dies zu bestätigen, damit diePolymerlösungen in vertikaler Position bei Raumtemperatur für 20 Min. ruhen. Zentrifugation bei 1000 xg kann die Phasentrennung zu beschleunigen. Je dichter untere Phase wird DEX-reich sein und die obere Phase wird PEG-reichen sein.
3. Langsam fügen zusätzlichen Puffer oder Medien an den Rohren. Kleinen Schritten sollte, um nicht die Überschwingen Phasentrennungspunkt verwendet werden.
4. Wenn die Lösung klar wird, und nicht mehr phasensepariert nach Zentrifugation wird der Schwellenwert für die Phasentrennung erreicht wurde. Aufzeichnen das Endgewicht des Rohres.
5. Verwendung der vorherigen aufgezeichneten Gewichte für die Polymeren, zusammen mit dem Endgewicht nach Zugabe Medien bestimmen% Gew. / Gew. von jedem der beiden Polymere bei dem eine Phasentrennung nicht mehr auftritt.
6. Plotten diese Werte als% Gew / Gew PEG auf der y-Achse und% wt / wt DEX auf der x-Achse. Dieser Plot, wie die binodale Kurve bekannt ist, kann verwendet werden, um den Schwellenwert-Konzentration für eine Phasentrennung für unterschiedliche concentrati bestimmenons von PEG / DEX in einer bestimmten Zellkulturmedium.

2. Konfiguration 1: Ausschluss Strukturierung (96-well Platte Format)

1. Planen getrennte Lösungen von 5,0% w / w PEG und 12,8% Gew. / Gew. DEX in Zellkulturmedium. Verwenden ATPS Lösungen von mindestens dem Doppelten der kritischen Punktes, um sicherzustellen, dass ein ATPS nachdem die Polymere mit Bezug zueinander äquilibrieren bleibt. Es gibt eine kleine Menge des Flusses von DEX in die PEG-reichen Phase und umgekehrt, also arbeiten zu nahe der kritischen Konzentration kann zu einem Verlust des Phasensystems als Konzentrationen Unterschreiten kritischer Punkt führen. In ähnlicher Weise kann die Übertragung der Zellkulturschale zu einer Feuchte-und Temperatur-kontrollierten Inkubator verändern die zweiphasige Eigenschaften und stellen die beiden Lösungen mischbar. Hinweis: Einige Zellen können besser mit anderen ATPS Formulierungen. Akzeptablen Formulierungen können basierend auf den binodale Kurven aus Teil 1 bestimmt, ausgewählt werden.
2. Ernten Sie die Zellen, die zur Ausgrenzung patte verwendet werdenrning. Ermitteln Sie die Gesamtzahl / Konzentration von Zellen zur Verfügung. Optional: Kennzeichnen der Zellen mit CellTracker oder andere nicht-zytotoxischen Etiketten für die Fluoreszenzmikroskopie.
3. Pelletieren der Zellen und Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von 5,0% PEG, um die gewünschte Anzahl von Zellen für den Ausschluss erreichen. Zum Beispiel erfordert eine Vertiefung einer 96-Well-Platte 37.500 Fibroblastenzellen in 200 ul der PEG resuspendiert werden bis zur Konfluenz produzieren des folgenden Tages. Skalieren diese Zahlen als geeignet für andere Zelltypen und Kultur Substrat Größen.
4. Mit einer Mikropipette, verzichten 0,5 ul Tröpfchen DEX auf ein trockenes Zellkultursubstrat. Größeres Volumen Tröpfchen größere Sperrzonen. Tröpfchen mit einer Größe von 0,1 bis 1 ul werden für den Ausschluss Mikrostrukturierung empfohlen. Optional: DEX Tröpfchen können 24 Stunden vor der Zeit abgelagert werden und bei Raumtemperatur zu entwässern. Dies kann zu saubereren Muster.
5. Geben Sie 200 ul PEG Zellsuspension in ter gut zur Deckung der DEX Tröpfchen.
6. In einem befeuchteten Inkubator für 12 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2. Stellen Sie sicher, dass das Gericht nicht bei der Handhabung und dass es auf einem Niveau Inkubator Regal gestellt zu verhindern, dass die Muster gekippt.
7. Entfernen Sie die PEG-Lösung und dreimal mit 200 ul Kulturmedium.
8. Fügen Sie frisches Kulturmedium und Rückkehr in den Inkubator.
9. Überwachen Sie die Kulturen in regelmäßigen Abständen zu Zelle Bewegung in der Sperrzone zu beobachten.

3. Konfiguration 2: Island Strukturierung (96-well Platte Format)

1. Planen Lösungen von 5,0% w / w PEG und 12,8% Gew. / Gew. DEX in Zellkulturmedium wie oben.
2. Ernten Sie die Zellen, die zur Insel Strukturierung verwendet werden. Ermitteln Sie die Gesamtzahl / Konzentration von Zellen zur Verfügung.
3. Pellet und Zellen in einem geeigneten Volumen von 12,8% DEX, um die gewünschte Konzentration der Zellen für die Insel Strukturierung zu erreichen. Konzentrationen von 5.000 cells / ul oder weniger sind für stark haftende Zelltypen empfohlen. Für Zellen, die Schwierigkeiten Anbringen oder Zellen, die lose anhaften haben, Konzentrationen von bis zu 10.000 Zellen / ul in Betracht.
4. Arbeitet schnell zu vermeiden Trocknen Pipette 0,5 ul Tröpfchen von DEX auf ein trockenes Zellkultursubstrat, wie oben beschrieben. Lassen Sie keine Tröpfchen zu trocknen. Optional: 200 ul PEG-Lösung kann der gut aufgenommen der Zeit voraus sein. DEX Tröpfchen können dann in der PEG-Lösung, wo sie auf den Boden sinken wird, und wenden die Kultur Oberfläche abgeschieden werden. Dies kann zu saubereren Inselmuster.
5. Bedecken Sie die DEX Tröpfchen mit 200 ul PEG.
6. In einem befeuchteten Inkubator für 12 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2. Stellen Sie sicher, dass das Gericht nicht bei der Handhabung und dass es auf einem Niveau Inkubator Regal gestellt zu verhindern, dass die Muster gekippt.
7. Entfernen Sie die PEG-Lösung und dreimal mit 200 ul Kulturmedium.
8. Fügen Sie frisches Kulturmediummittel-und Rückkehr in den Inkubator.
9. Überwachen Sie die Kulturen regelmäßig Zellbewegung und Proliferation nach außen von den Inseln zu beobachten.

4. Konfiguration 3: Ausschluss Co-Kulturen (96-well Platte Format)

1. Planen Lösungen von 5,0% w / w PEG und 12,8% Gew. / Gew. DEX in Zellkulturmedium wie oben.
2. Ernten Sie die Zellen, die zur Ausgrenzung und Insel Strukturierung verwendet werden. Ermitteln Sie die Gesamtzahl / Konzentration der Zellen für jeden Zelltyp. Optional: Einige Zellen Paarungen kann dramatisch anders Verbreitung Indizes anzuzeigen. Um die ausgeschlossenen Zellen aus übervölkern die Insel gemusterten Zellen (insbesondere für die langfristige Kulturen) verhindern, behandeln die Zellen für Ausschluß mit Mitomycin C für 2 Stunden oder gebraucht bestrahlen sie vor der Ernte. Dadurch wird verhindert, Proliferation. Fluorescent CellTracker Farbstoffe können verwendet werden, um die beiden Zellpopulationen unterscheiden, wenn es erforderlich ist.
3. Pellet die Zellen und das Pellet für exclusion Musterbildung in einem geeigneten Volumen von 5,0% PEG zur Erzielung der gewünschten Anzahl von Zellen, wie oben beschrieben. Das Pellet für Insel Musterbildung in einem geeigneten Volumen von 12,8% DEX, um die gewünschte Konzentration der Zellen zu erreichen, wie oben.
4. Mit einer Mikropipette, verzichten 0,5 ul Tröpfchen DEX Zellsuspension auf einem trockenen Zellkultursubstrat. Lassen Sie keine Tröpfchen zu trocknen.
5. Bedecken Sie die DEX Tröpfchen mit 200 ul PEG Zellsuspension.
6. In einem befeuchteten Inkubator für 12 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2. Stellen Sie sicher, dass das Gericht nicht bei der Handhabung und dass es auf einem Niveau Inkubator Regal gestellt zu verhindern, dass die Muster gekippt.
7. Entfernen Sie die PEG-Lösung und dreimal in 200 ul Kulturmedium.
8. Fügen Sie frisches Kulturmedium und Rückkehr in den Inkubator.
9. Überwachen Sie die Co-Kulturen, die Interaktion zwischen Zellpopulationen zu beobachten. Optional: Controls kann durch Ausführen Ausschluss oder die Insel Strukturierung indiv. vorbereitet werdenidually, durch Co-Kultivierung von Zellen, die nicht interagieren oder durch Blockieren Wege des Interesses an einem oder beiden Zellpopulationen vor oder nach einem Mustern.

Results

Um eine geeignete Kombination von PEG und DEX für Zelle Strukturieren auszuwählen, ist es wichtig, um die binodale Kurve bestimmen. Diese Kurve skizziert die Punkte, an denen ein ATPS bilden können und für einen gegebenen Satz von Polymeren auf Temperatur, pH und Ionengehalt variieren. Zum Kultivieren von Zellen, die angepasst Mediums Formulierungen erfordern kann es erforderlich sein, um experimentell die binodale Kurve. Dies wird durch Erzeugen einer Reihe von ATPSs, die weit von der binodale und Variieren in ihrer PE...

Discussion

Die ATPS Zelle Mikrostrukturierung Methode erfordert nur sehr wenig Know-how über Kenntnisse in Zellkultur-Techniken und kann schnell gemeistert werden. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, dass sie preiswert, schnell und kompatibel mit einer Vielzahl von Zelltypen und Kultur Formaten ist. Aus diesen Gründen sollte unser Protokoll leicht Biowissenschaftler, insbesondere diejenigen, die Zellproliferation, Migration und Chemotaxis und den Einfluss der juxtacrine und parakrine Interaktionen zwischen Zellpopulationen zu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens	Hersteller
Dextran 500.000 kDa	Pharmacosmos, Dänemark
Polyethylene Glycol 35.000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Handy Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fötales Rinderserum	Gibco, Carlsbad, CA