Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes
Summary
Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo<em> Agrobacterium</em> Em plantas para a expressão transiente da proteína.
Abstract
Cultura de células de mamífero é a plataforma principal para a produção comercial de vacinas humanas e proteínas terapêuticas. No entanto, ele não pode atender à crescente demanda mundial por produtos farmacêuticos, devido à sua escalabilidade limitada e de alto custo. As plantas têm demonstrado ser uma das plataformas de produção farmacêuticos alternativos mais promissores que são robustas, adaptar, de baixo custo e segura. O recente desenvolvimento de vectores baseados em vírus, permitiu a expressão transiente rápida e de alto nível de proteínas recombinantes em plantas. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma metodologia simples, eficiente e de adaptar a introdução do gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal neste estudo. Os nossos resultados indicam que tanto a seringa agroinfiltration com vácuo e métodos têm como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium em folhas e robusta de produção de duas proteínas fluorescentes; GFP e DsRed. Além disso,que demonstram as vantagens únicas oferecidas pelos dois métodos. Infiltração seringa é simples e não precisa de equipamentos caros. Ele também permite a flexibilidade, quer se infiltrar toda a licença com um gene alvo, ou a introdução de genes de múltiplos alvos em uma folha. Assim, ele pode ser usado para a expressão à escala laboratorial de proteínas recombinantes, bem como para a comparação de diferentes proteínas ou vectores para a cinética de produção ou expressão. A simplicidade de infiltração seringa também sugere a sua utilidade no ensino médio e educação superior para o tema da biotecnologia. Em contraste, a infiltração por vácuo é mais robusto e pode ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas. Também apresenta a vantagem de ser capaz de agroinfiltrate espécies de plantas que não são passíveis de seringa infiltração tais como a alface e Arabidopsis. Em geral, a combinação de uma seringa e agroinfiltration vácuo fornece investigadores e formadores de uma simples, eficiente e robustametodologia para a expressão da proteína transiente. Vai facilitar muito o desenvolvimento de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.
Introduction
Desde os anos 1970, as plantas foram explorados como alternativas a culturas de células de mamíferos, insectos, bactérias e para a produção comercial de proteínas recombinantes e uma proteína terapêutica. Sistemas à base de plantas para a expressão de biofármacos têm se mostrado promissor nos últimos anos, vários novos tratamentos para doenças, como a doença de Gaucher 2 e 3 da gripe aviária H5N1, têm demonstrado sucesso em ensaios clínicos. O desenvolvimento de mecanismos competentes para a expressão de proteínas recombinantes em plantas nas décadas desde os primeiros experimentos criou o potencial para sistemas à base de plantas para alterar o paradigma atual de produção de proteína por três razões principais. Em primeiro lugar, há uma diminuição notável do custo como bioreactores de mamíferos, insectos, bactérias e exigem custos consideráveis de arranque, meios de cultura caros e processos complicados para a purificação a jusante 4. A criação de planta transgênica estávellinhas também lhes permite superar a escalabilidade de outros sistemas de expressão como plantas que expressam proteínas poderiam ser cultivadas e colhidas em escala agrícola 5. Em segundo lugar, os sistemas de expressão à base de plantas reduzem significativamente o risco de transmissão de um agente patogénico humano ou animal, a partir do hospedeiro que expressa a proteína para os seres humanos, demonstrando a superioridade em segurança pública 6. Por fim, as plantas utilizam um sistema endomembranar eucariota que é semelhante à de células de mamífero, permitindo a correcta modificação pós-tradução, incluindo a glicosilação de proteínas e o conjunto de proteínas de várias subunidades 7. Esta capacidade coloca sistemas baseados em plantas antes de aqueles baseados em sistemas procariotas, tais como bactérias, uma vez que um número maior de proteínas recombinantes farmacêuticos, incluindo os anticorpos monoclonais (mAbs), tem uma estrutura complicada e requer extensas modificações pós-tradução ou de montagem 8.
Existem dois grandes adedores de expressar proteínas recombinantes em plantas. O primeiro é o desenvolvimento de uma linha transgénica de forma estável, onde o ADN que codifica para a proteína alvo é clonado em uma cassete de expressão e introduzido tanto o genoma nuclear ou do cloroplasto. Ao fazer isso, o DNA estranho se torna hereditário através de gerações sucessivas e permite tremendamente melhorado escalabilidade, além de outros sistemas de expressão 1. A introdução de ADN exógeno no genoma nuclear é geralmente conseguido por infecção por Agrobacterium tumefaciens de tecido de planta ou, menos frequentemente, por bombardeamento de microprojécteis de tecido 9. Hormonas de plantas são depois utilizados para induzir a diferenciação e o crescimento de tecido de planta transgénica como raízes e folhas. A transformação do genoma do cloroplasto não pode ser conseguido com A. tumefaciens, mas depende inteiramente de partículas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA demitido balisticamente em células vegetais. O segundo método de expressar recombinaçãont proteína em plantas é através da expressão transitória 10. Neste cenário, os vetores de vírus derivados abrigando o gene de interesse são entregues via A. tumefaciens para plantas totalmente desenvolvidas através de um processo chamado agroinfiltration. Em vez de integração no genoma da planta, a construção de gene entregue começará então a dirigir a produção transiente da proteína desejada, que pode ser colhida e isolado após um curto período de incubação. A expressão do gene transitório oferece a vantagem de uma maior acumulação de proteína total, bem como um tempo melhorado de produção de proteínas, como as plantas estarão prontas para a colheita, aproximadamente 1-2 semanas após agroinfiltration 11. Isto é significativamente mais rápido do que os processos de produção, selecção e confirmação de linhas de plantas transgénicas estáveis, o que pode levar vários meses a um ano. Isto, no entanto, é também a limitação do sistema de expressão transitória, uma vez que não irá produzir geneticamente estável planta line que podem ser usados para gerar um banco de sementes para a produção comercial em grande escala. Apesar disso, as abordagens têm sido desenvolvidos para melhorar a expressão transiente em larga escala. Aqui demonstramos um método de geração de proteínas expressam plantas de Nicotiana benthamiana transitórios utilizam vetores virais desconstruídas entregues pela A. tumefaciens.
Existem dois métodos principais estão a ser desenvolvidos para a entrega de A. tumefaciens em tecido vegetal: banco de infiltração escala via seringa e infiltração em larga escala via câmara de vácuo. Ambos os protocolos são descritos aqui, usando N. benthamiana, que está intimamente relacionada com a planta do tabaco comum, como a planta hospedeira para expressão transitória de duas proteínas fluorescentes: a proteína verde fluorescente (GFP) de água-viva Aequorea victoria ea proteína fluorescente vermelha de Discosoma coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana é a planta hospedeira mais comum paraproteína recombinante porque é susceptível à transformação genética, podem produzir quantidades elevadas de biomassa rapidamente, e é um produtor de sementes para a produção prolífica aumento de escala 14. Outra vantagem do uso de N. benthamiana como hospedeiros para a expressão da proteína é a disponibilidade de uma variedade de vectores de expressão de 2,5. Neste estudo, dois vetores virais desconstruídas, uma baseada em um vírus do mosaico do tabaco (TMV) RNA sistema replicon (vetores MagnICON) eo outro derivado do vírus anã amarela feijão (BeYDV) sistema replicon DNA (vetores geminiviral) 4,11, 15-18, são usados para transportar o gene GFP e DsRed e entregá-los em N. células benthamiana via A. tumefaciens. três construções de DNA serão utilizados para GFP ou com vectores de expressão DsRed MagnICON. Eles incluem "módulo (pICH15879) contendo o promotor e outros elementos genéticos para a condução da expressão do gene alvo, a 3 'do módulo 5 que contém o gene de interesse (Pich-GFP ou Pich-DsRed), e o módulo de integrase (pICH14011) que codifica para uma enzima que integra a 5 'e 3' módulos juntos após expressão 8,15. Três construções de DNA também são necessários para a expressão com vetores geminiviral. Em adição a vectores que contêm o replicão do gene-alvo (ou pBYGFP pBYDsRed), um vector que codifica para a proteína de replicação (pREP110) é necessária para a amplificação do alvo replicão 11,14,16. Além disso, a inclusão de um vector que codifica para o silenciamento p19 supressor de tomate espesso vírus duplos é desejado para a expressão do gene alvo de elevado nível de 11,16.
Em geral, há três passos principais para a introdução de genes de proteínas recombinantes em células de plantas por agroinfiltration incluindo o crescimento das plantas, A. tumefaciens cultura de preparação, e a infiltração. Como cada passo é crítico para o sucesso final deste procedimento, por conseguinte, uma descrição detalhada de cada uma é fornecidatanto para a infiltração seringa e infiltração por vácuo abaixo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A crescente demanda por produtos farmacêuticos à base de proteínas em todo o mundo exigem novas plataformas de produção que são robustas, escaláveis e de baixo custo e segura. As plantas têm demonstrado ser um dos sistemas de produção alternativos mais promissores para a produção de proteínas farmacêuticas. Em anos recentes, o desenvolvimento de vectores baseados em Desconstruído vírus permitiu a expressão transitória de proteínas em plantas, o que aumenta grandemente a velocidade e o rendimento…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos R. Sun e outros estudantes do laboratório de Chen por sua contribuição para usina de geração de material. Agradecemos também a Dr. D. Green por seu apoio de pesquisa de graduação na Faculdade de Tecnologia e Inovação (CTI). Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH concede U01 AI075549 e 1R21AI101329 para Q. Chen, e uma bolsa de SSE de CTI do Arizona State University para Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke são estudantes de graduação apoiados pela concessão SSE.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
Referenzen
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
