Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Summary

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Abstract

In diesem Protokoll werden die Herstellung, der Versuchsaufbau und der grundlegende Betrieb des kürzlich eingeführten mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) detailliert beschrieben. Das PLBR kann für die Analyse einzelner Bakterien und Mikrokolonien eingesetzt werden, um biotechnologische und mikrobiologische Fragestellungen zu untersuchen, z.B. in Bezug auf Zellwachstum, Morphologie, Stressantwort und Metaboliten- oder Proteinproduktion auf Einzelzellebene. Das Gerät verfügt über einen kontinuierlichen Medienfluss, der konstante Umgebungsbedingungen für Störungsstudien ermöglicht, aber auch schnelle Medienwechsel sowie oszillierende Bedingungen ermöglicht, um jede gewünschte Umgebungssituation nachzuahmen. Für die Herstellung der Einweggeräte diente ein Siliziumwafer mit submikrometergroßen SU-8-Strukturen als Replikationsform für den schnellen Polydimethylsiloxan-Guss. Die Chips wurden geschnitten, zusammengesetzt, verbunden und auf ein hochauflösendes und vollautomatisches Mikroskop gesetzt, das für die Zeitrafferbildgebung geeignet ist und ein leistungsstarkes Werkzeug für die räumlich-zeitliche Zellanalyse ist. Hier wurde der biotechnologische Plattformorganismus Corynebacterium glutamicum in das PLBR eingepflanzt und das Zellwachstum und die intrazelluläre Fluoreszenz über mehrere Stunden verfolgt, um die zeitabhängige Heterogenität der Population auf Einzelzellebene zu entschlüsseln, was mit herkömmlichen Analysemethoden wie der Durchflusszytometrie nicht möglich ist. Neben Einblicken in die Geräteherstellung werden auch die Vorbereitung der Vorkultur, das Verladen, das Einfangen von Bakterien und die PLBR-Kultivierung von Einzelzellen und Kolonien demonstriert. Diese Geräte werden eine neue Dimension in der mikrobiologischen Forschung hinzufügen, um zeitabhängige Phänomene einzelner Bakterien unter strenger Umweltkontrolle zu analysieren. Aufgrund des einfachen und relativ kurzen Herstellungsprozesses kann die Technologie in jedem Mikrofluidiklabor leicht angepasst und einfach auf die spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden.

Introduction

Zeitraffermikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung lebender Zellen in vivo¹. In der Zwischenzeit werden kommerziell erhältliche vollautomatische Mikroskopie-Plattformen einschließlich thermisch induzierter Fokusdrift-Kompensation häufig in der biologischen Forschung eingesetzt, um zeitabhängige Phänomene zu untersuchen, die von der Krebs- und Neuronenzellforschung über das Tissue Engineering bis hin zu dynamischen Studien mit einzelnen Hefe- oder Bakterienzellen^{reichen 2-6}.

Typischerweise werden transparente Well-Platten, Agar-Pads oder einfach Mikroskopie-Objektträger verwendet, um Zellkulturumgebungen während der Zeitraffer-Bildgebung bereitzustellen⁷. Obwohl diese einfachen Systeme für bestimmte Forschungsarbeiten geeignet sind, haben sie nur eine sehr begrenzte Kontrolle über die Umgebungsbedingungen und erlauben keine komplexeren Störungen oder klar definierte und schnelle Medienwechsel. Mikrofluidische Einweg-Chips, die in Massenproduktion hergestellt werden, wurden kürzlich auf den Markt gebracht, sind aber meist auf größere eukaryotische Zelltypen zugeschnitten⁴. Obwohl das Wachstum verfolgt werden kann, sind gut definierte Wachstumsuntersuchungen, z.B. hinsichtlich präziser Zelleinfalle, Koloniegröße, Wachstumsrichtung und der Fähigkeit zur Zellentfernung, begrenzt. Mikrofluidische Habitate und Reaktoren, in denen Bakterienzellen in 3D-Umgebungen kultiviert werden^8-10, haben Nachteile, wenn es sich um quantitative Studien auf Einzelzellebene handelt. Während die Heterogenität der Gesamtpopulation analysiert werden kann, können viele Zellparameter nicht mit Einzelzellauflösung genau bestimmt werden, da das Wachstum nicht auf Monoschichten beschränkt ist.

Diese Einschränkung löste die Entwicklung von Mikrosystemen aus, die die Kultivierung von Zellen in genau definierten Kanälen und Habitaten ermöglichen, wobei Zellen in flachen Monoschichten mit Einzelzellauflösung und besonders strenger Kontrolle über die Medienversorgung und die Umweltbedingungen wachsen^6,11,12. Einige Beispiele für mikrofluidische Systeme zur Kultivierung von Bakterienzellen wurden demonstriert^12-14. Bakterien weisen in der Regel sehr schnelle Wachstumsraten auf und benötigen mikrofluidische Strukturen im Bereich von wenigen Mikrometern und darunter, insbesondere wenn Zellmonoschichten für die Mikroskopie gewünscht werden. Keymer et al. demonstrierte das Wachstum und die Ausbreitung von E. coli-Stämmen in mikrofabrizierten Landschaften^15,16. Da sie sich für die Dynamik von Populationen interessierten, untersuchten sie nicht mit Einzelzellauflösung.

Wir haben den Pikoliter-Bioreaktor (PLBR)¹³ entwickelt, der derzeit zur Untersuchung verschiedener biotechnologischer Leistungsindikatoren wie Wachstum¹⁷ und fluoreszenzgekoppelte Produktivitätsanalyse auf Einzelzellebene^18,19 eingesetzt wird. Die vorliegende mikrofluidische Vorrichtung ermöglicht die Steuerung des Umweltreaktors bei einem definierten Kulturvolumen von etwa einem Pikoliter und die gleichzeitige kontinuierliche Einzelzellbeobachtung. Im Vergleich zu offenen Monolayer-Box-Systemen^{11, 14}, bei denen eine oder zwei Seiten zum Medienzufuhrkanal hin offen sind, ermöglicht das PLBR ein kontrolliertes Einfangen und Kultivieren. Das Design ermöglicht eine langfristige Kultivierung von Bakterien, ohne das Risiko, dass mehrere benachbarte Kolonien eine große Population bilden. Darüber hinaus integriert das System Kultivierungsbereiche von 1 μm Höhe (in der Größenordnung des Zelldurchmessers), um das Bakterienwachstum auf Zellmonoschichten zu beschränken. Im Gegensatz dazu sind die Zuführkanäle 10-fach tiefer, um den hydraulischen Widerstand zu minimieren.

Im Vergleich zu miniaturisierten Batch-Kultivierungssystemen²⁰ ermöglicht das vorliegende System den Anbau mit konstanten Umgebungsparametern aufgrund des kontinuierlichen Medienflusses. Darüber hinaus können Umgebungsparameter wie Medienzusammensetzung, Temperatur, Durchflussmengen und Gasaustausch einfach gesteuert und innerhalb von Sekunden geändert werden. Dies ermöglicht es, die zelluläre Reaktion auf Umweltveränderungen wie z.B. Nährstoffverfügbarkeit oder Stressreize gezielt zu untersuchen. Die Nachfrage nach reduzierten Medienvolumina, d. h. im Bereich von nur wenigen Mikrolitern, ermöglicht es den Forschern, neuartige Studien durchzuführen, z. B. die Störung von Zellen während der Zeitrafferbildgebung mit Überstand von Großexperimenten, die die Zellantwort unter diesen spezifischen Umweltbedingungen entschlüsseln¹⁷. Der Pikoliter-Bioreaktor bietet den Forschern ein robustes System, das die biophysikalischen Bedingungen streng kontrolliert und mit hochpräzisen Spritzenpumpen und automatisierter Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie für die Zeitrafferbildgebung betrieben wird. Hier berichten wir über ein vollständiges Protokoll, das das Gerätedesign, die Herstellung und beispielhafte Anwendungen umfasst.

Protocol

1. Herstellung von Wafern

1. Entwerfen Sie das mikrofluidische Gerät mit Einlässen, Ausgängen, Hauptkanälen und den PLBRs (Abbildung 1A) mit CAD-Software.
2. Das in diesem Protokoll vorgestellte Design (Abbildung 2) besteht aus zwei Seeding-Einlässen, einem Gradientengenerator zum Mischen von zwei verschiedenen Substraten, einem Auslass und sechs Arrays von PLBRs. Jedes Array enthält 5 PLBRs, was zu 30 parallelen PLBRs in einem mikrofluidischen Gerät führt.
3. Erstellen Sie eine Lithografie-Fotomaske mit den gewünschten Chip-Layouts (Abbildung 1B). Die Fotomaske wurde im eigenen Haus durch Elektronenstrahlschreiben mit einer Auflösung im Submikrometerbereich hergestellt. Die verwendete Maske bestand aus einer Chromschicht auf einer 5 in² Glasplatte.
   Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte unter Reinraumbedingungen der Klasse 100 oder besser durch (ein Prozessablaufdiagramm ist in den Abbildungen 3A und 3B dargestellt).
4. Reinigen Sie einen 4-Zoll-Siliziumwafer einige Minuten lang mit Piranha (10:1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) und Flusssäure (Achtung: gefährliche Chemikalien). Mit entionisiertem (DI) Wasser ca. 10 Sekunden lang spülen.
5. Wafer 20 min bei 200 °C dehydrieren.
6. Spin Coat 1 μm SU-8 2000.5 Fotolack auf den Wafer (1. Schicht) (4 ml Resist, 10 sec Spin mit, v = 500 U/min und a = 100 U/min, Spin 30 sec mit v = 1.000 U/min und a = 300 U/min).
7. Legen Sie den beschichteten Wafer auf eine heiße Platte bei 95 °C, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen (1,5 min bei 65 °C, 1,5 min bei 95 °C und 1 min bei 65 °C; idealerweise verwenden Sie zwei Heizplatten).
8. Legen Sie die 1^. Schicht Fotomaske (hier die Einfangbereiche der Pikoliterreaktoren) und den Wafer in den Masken-Aligner ein und belichten Sie den Wafer auf 350-400 nm (Vakuumkontakt, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).
9. Nach der Belichtung auf einer heißen Platte bei 95 °C backen, um die Polymerisation von SU-8 zu initiieren (1 min bei 65 °C, 1 min bei 95 °C und 1 min bei 65 °C). Hinweis: Nach diesem Schritt sind die Strukturen in der SU-8-Schicht zu sehen.
10. Legen Sie den Wafer für 1 Minute in ein SU-8-Entwicklerbad und überführen Sie den Wafer für einige Sekunden in einen zweiten Behälter mit frischem SU-8-Entwickler.
11. Spülen Sie den Wafer in Isopropanol, um den SU-8-Entwickler zu entfernen, und trocknen Sie den Wafer mit dem Stickstofffluss des Wafer-Spinners.
12. Den Wafer 10 min bei 150 °C hart backen.
13. Spin Coat 9 μm SU-8 2010 Fotolack auf den Wafer (2^.Schicht) (4 ml Resist dispensieren, 10 sec mit v = 500 U/min, a = 100 rpm/sec und 30 s mit v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/sec drehen).
14. Legen Sie den Wafer mit SU-8 auf eine Heizplatte bei 95 °C, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen (15 min bei 65 °C, 45-60 min bei 95 °C und 10 min bei 65 °C). Hinweis: Auf Falten und Blasen ist zu achten. Wenn der Wafer auf 95 °C erhitzt wird, kann verdampftes Lösungsmittel in winzigen Gasblasen eingekapselt werden.
15. Photomaske mit dem gewünschten Layout (hier Hauptkanäle für die Nährstoffversorgung) und den Wafer in den Masken-Aligner einlegen und auf 350-400 nm belichten (harter Kontakt, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)
16. Nach der Belichtung auf einer heißen Platte bei 95 °C backen, um die Polymerisation von SU-8 abzuschließen (5 min bei 65 °C, 3:30 min bei 95 °C, 3 min bei 65 °C). Hinweis: Nach diesem Schritt sind die Strukturen in der SU-8-Schicht zu sehen.
17. Legen Sie den Wafer für 45 Sekunden in ein SU-8-Entwicklerbad, überführen Sie den Wafer in einen zweiten Behälter mit frischem SU-8-Entwickler und entwickeln Sie ihn 60 Sekunden lang.
18. Spülen Sie den Wafer 20 Sekunden lang mit Isopropanol, um alle SU-8-Entwicklerrückstände zu entfernen, und trocknen Sie den Wafer mit Druckstickstoff.
19. Zum Schluss die Waffel bei 150 °C hart backen. Als Ergebnis erhält man den finalen Wafer (Abbildung 1C), der als Master-Mold für das PDMS-Molding verwendet wird.
20. Führen Sie Profilometermessungen durch (Abbildung 3C), um die Höhe der SU-8-Struktur zu validieren. Hinweis: Ungenauigkeiten in der Strukturhöhe können zu einer ineffizienten Zellfalle oder zum Verlust von Zellen während der Kultivierung führen.

2. Herstellung von Polydimethylsiloxan-Chips

Hinweis: Alle folgenden Schritte sollten idealerweise unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt werden, um zu verhindern, dass Staubpartikel den Herstellungsprozess beeinträchtigen (Ein Prozessablaufdiagramm ist in Abbildung 4 dargestellt).

1. Bereiten Sie eine Mischung aus Polydimethylsiloxan (PDMS)-Base und Härter im Verhältnis 10:1 vor. Vorsichtig mischen, bis eine homogene Lösung entsteht, die undurchsichtig aussieht. Bereiten Sie so viel vor, wie für die gewünschte Schichthöhe (hier 3 mm) benötigt wird.
2. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch ca. 30 min lang unter leichtem Vakuum, bis alle Blasen verschwunden sind.
3. Bereiten Sie die Formvorrichtung (oder Petrischale) mit dem entsprechenden SU-8-Wafer vor und gießen Sie die PDMS-Mischung hinein (Abbildung 1D).
4. Das PDMS 3 Std. bei 80 °C im Ofen backen.
5. Ziehen Sie die PDMS-Platte vorsichtig vom Wafer ab. Schneiden Sie die Platte mit einem sauberen und scharfen Skalpell in einzelne Späne.
6. Waschen Sie die Chips 90 min lang in einem n-Pentanbad, gefolgt von zwei Aceton-Waschbädern (je 90 min). Trocknen Sie die Späne über Nacht, um Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Achtung: Führen Sie die PDMS-Reinigung unter einem Abzug durch. Hinweis: Während der n-Pentan-Wäsche werden Monomere und Dimere aus dem ausgehärteten PDMS entfernt und die Chipgröße kann sich während des Waschvorgangs vorübergehend verdoppeln.
7. Lagern Sie die mikrofluidischen PDMS-Chips bis zum endgültigen Experiment in geschlossenen Behältern.
8. Stanzen Sie kurz vor dem Experiment die Einlass- und Auslasslöcher mit einer Nadel (oder einem Locher) in den PDMS-Chip, deren Durchmesser etwas kleiner ist als bei den Anschlüssen, die zum Verbinden von Schläuchen mit dem PDMS-Chip verwendet werden.
9. Reinigen Sie den mikrofluidischen PDMS-Chip vorsichtig mit Isopropanol und verwenden Sie Klebeband, um Staubpartikel zu entfernen, die auf der strukturierten PDMS-Seite haften bleiben könnten. Verwenden Sie das Klebeband mehrmals, bis keine Partikel mehr auf dem Chip zu sehen sind.
10. Reinigen Sie einen 170 μm dünnen Objektträger nacheinander mit Aceton und Isopropanol. Zum Schluss mit entionisiertem Wasser reinigen und mit Druckstickstoff trocknen.
11. Vor der Plasmaaktivierung den Plasmareiniger erwärmen und das Plasma ca. 300 Sekunden lang laufen lassen. Glasobjektträger und PDMS-Chip plasmaoxidieren (Leistung 50 W, Zeit = 25 sec, Sauerstoffdurchfluss = 20 sccm).
12. Richten Sie das PDMS und den Glaschip vor dem Verkleben aus. Platzieren Sie abschließend den PDMS-Chip vorsichtig auf dem Objektträger (Abbildung 1E). PDMS und Glas verbinden sich innerhalb von Sekunden. Hinweis: Drücken Sie während des Klebevorgangs nicht mit einer Pinzette auf die Oberseite des PDMS-Chips. Dies kann zum sogenannten Einsturz der Dächer der Kanäle und kleiner Strukturen führen.
13. Um die Verbindung zu verstärken, wird der fertige PDMS-Glaschip 10 Sekunden lang bei 80 °C gebacken.

3. Vorbereitung der Bakterienkultur

Hinweis: Alle Kultivierungen sollten in sterilem, gefiltertem Medium zubereitet werden, um die Ansammlung unerwünschter Partikel zu verhindern, die während der Kultivierung stören könnten.

1. Verwenden Sie eine Agarplatte mit den gewünschten Organismen (hier C. glutamicum ATCC 13032) und inokulieren Sie eine Kolonie in 20 ml frisches BHI-Medium, inkubieren Sie über Nacht (≈ 8-14 Uhr) bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (120 U/min).
2. Überführen Sie 10 μl der Vorkultur in das gewünschte Medium (hier CGXII²¹), das bei der mikrofluidischen Kultivierung verwendet wird, und lassen Sie die Zelle über Nacht bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (120 U/min) wachsen.
3. Übertragen Sie die gewünschte Menge der Zellsuspension (zwischen 10-500 μl, je nach Versuchsstart) in das gewünschte Medium (hier CGXII²¹), das bei der mikrofluidischen Zellkultivierung verwendet wird. Hinweis: Am besten verwenden Sie Zellen aus der frühen logarithmischen Phase für die Aussaat. Für die C. glutamicum-Kultur lag die beste optische Dichte (OD₆₀₀) für die Aussaat zwischen 0,5 und 2.
4. 1 ml der Bakterienkultur in ein steriles 2-ml-Röhrchen umfüllen. Hinweis: Dies sollte direkt nach dem Zusammenbau des mikrofluidischen PDMS-Chips erfolgen, um die Übertragungszeit zwischen dem Schüttelkolben und der mikrofluidischen Kultivierung zu minimieren. In der Regel beträgt die Transferzeit etwa 15 Minuten und sollte so kurz wie möglich gehalten werden, um Auswirkungen auf den Stoffwechsel durch Sauerstofflimitierung und Temperaturänderungen zu vermeiden.

4. Versuchsaufbau

Hinweis: Alle Schritte werden mit einem inversen Mikroskop durchgeführt.

1. Starten Sie den Mikroskop-Inkubator 2 Stunden vor dem Experiment, um das System aufzuwärmen. Hinweis: Die Mikroskopie sollte mit einem Inkubator in voller Größe ausgestattet sein, um die Temperatur und gegebenenfalls den Gasfluss zu steuern. Eine zusätzliche Feuchtigkeitsregelung ist nicht erforderlich, da das Chipsystem kontinuierlich mit Medien infundiert wird.
2. Öffnen Sie das Inkubatorsystem, wählen Sie das gewünschte Objektiv aus und geben Sie bei Bedarf Immersionsöl auf das Objektiv.
3. Montieren Sie den Chip im Chiphalter. Bei Bedarf die Glasplatte mit Klebeband fixieren, um eine Bewegung des Splitters während des Bühnenbetriebs zu vermeiden.
4. Zentrieren Sie die Probe auf dem Mikroskop und fokussieren Sie sie auf die PLBR-Arrays.
5. Verbinden Sie die Ein- und Auslässe mit den entsprechenden Schläuchen (Abbildung 1F). Schließen Sie den Schlauch an einen Abfallbehälter an. Ein repräsentativer Chip ist in Abbildung 4D zu sehen.
6. Setzen Sie die Spritzen in die Pumpen ein und starten Sie den Medienfluss. Verwenden Sie Medium, Puffer oder ggf. Beschichtungslösung und spülen Sie die mikrofluidischen Kanäle ca. 1 Stunde lang. Hinweis: Zur Beschichtung der Kanalwände wird eine Beschichtungslösung verwendet, um eine unspezifische Zelladhäsion zu verhindern.
7. Für E. coli wird eine 0,1%ige BSA-Lösung verwendet, um die Kanalwände zu beschichten. Für C. glutamicum ist keine Beschichtung notwendig. Nach dem Beschichtungsvorgang wird der Chip vor dem Cell Seeding mit Medium gespült.
8. Prüfen Sie vor der Aussaat und Kultivierung der Zellen, ob keine Leckage auftritt und die Temperatur konstant ist.

5. Aussaat von Bakterienzellen in das mikrofluidische Gerät

1. Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Bakterienlösungen in geeigneten Spritzen verfügbar sind, die mit dem Schlauch verbunden sind.
2. Trennen Sie den Puffer oder die Beschichtungslösung und verbinden Sie die Zellsuspension mit dem Chip. Um das Todesvolumen und unerwünschte Luftblasen zu minimieren und die Versuchszeit zu verkürzen, sollten sowohl die komplette Nadel als auch der Schlauch und nicht nur die Spritzen gewechselt werden.
3. Die Zellsuspension wird mit einem Volumenstrom von 200 nl/min in die Kanäle infundiert, bis die meisten PLBRs mit der gewünschten Menge an Zellen gefüllt sind (Abbildung 5A). Hinweis: Das optimale Aussaatergebnis hängt vom Bakterienstamm OD₆₀₀ und dem Wachstumsmedium der Vorkultur ab. Diese Parameter müssen angepasst werden, um die Einfangeffizienz und die Zeit bis zu einer ausreichenden Anzahl von Zellen in den Reaktorstrukturen zu erhöhen. Für C. glutamicum wurde typischerweise eine Zellsuspension von OD₆₀₀ 0,5-2 verwendet; für E. coli lag der OD₆₀₀ zwischen 0,5-1.
4. Wenn nur eine kleine Anzahl von PLBRs gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussmenge auf 800-1.200 nl/min.
5. Trennen Sie die Zellsuspension und verbinden Sie das Wachstumsmedium mit dem Chip (Abbildung 5B). Achten Sie darauf, dass während des Mediumwechsels keine Luftblase entsteht. Perfusion mit frischen Wachstumsmedien bei 100 nl/min.

6. Zeitraffer-Bildgebung

1. Wählen Sie bestimmte PLBRs für die Zeitraffer-Bildgebung aus. Typischerweise werden PLBRs gewählt, die zu Beginn eines Experiments eine einzelne Mutterzelle enthalten. Die Anzahl der interessierenden Regionen, die in einem Experiment untersucht werden können, hängt von der gewünschten Bildrate und dem mikroskopischen Aufbau ab.
2. Wählen Sie eine geeignete Bildrate in Abhängigkeit von der Anzahl der PLBRs. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop die gewünschte Menge an ROIs im Zeitrafferintervall verarbeiten kann.
3. Wählen Sie passende Filtersets (hier YFP). Schließen Sie den Verschluss automatisch während der Tischbewegung und nach jeder Zeitraffermessung, um ein Ausbleichen der Chromophore zu verhindern.
4. Konfigurieren Sie die Zeitraffer-Mikroskopiesequenz und starten Sie das Experiment.
5. Nachdem alle PLBRs überwuchert sind, kann das Experiment gestoppt, der mikrofluidische PDMS-Chip verworfen und das Experiment ausgewertet werden.

7. Analyse

Hinweis: Die folgenden Schritte oder Teile des Verfahrens können manuell oder durch Bildanalyseprogramme wie ImageJ usw. durchgeführt werden.

1. Bestimmen Sie PLBRs of Interest, bei denen die Kultivierung alle gewünschten Kriterien erfüllt, z.B. Anzahl der Mutterzellen, Position der Mutterzellen, etc.
2. Um die Wachstumsrate einer Mikrokolonie zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der Zellen in jedem Zeitrahmen.
3. Berechnen Sie die maximale Wachstumsrate, indem Sie die Zeit in Abhängigkeit von ln (Zellenzahl) darstellen. Die Steigung des Diagramms stellt die Wachstumsrate in [1/h] dar (siehe Abbildung 6).
4. Die Analyse von Fluoreszenzdaten hängt stark vom durchgeführten Experiment ab. In diesem Bericht wurde ein Beispiel gewählt, um die Heterogenität zwischen Kolonie und Zelle zu Zelle zwischen verschiedenen isogenen Mikrokolonien zu veranschaulichen (siehe Abbildung 7).

Results

Herstellung von Geräten

Das mikrofluidische PLBR-System besteht aus einer Schicht PDMS, die auf einen dünnen Glaschip geklebt ist, der für hochauflösende Mikroskopie geeignet ist. Die Fertigung besteht aus zwei Hauptschritten: zum einen der Herstellung des Replikationsmasters (Abbildungen 1A, 1B und 1C) und zum anderen der Chipherstellung (Abbildungen 1D, 1E und 1F). Gemäß dem Protokoll werden standardmäßige fotolithographische Mikrofabrikationstechniken verwendet, um die Urform zu erstellen. Labore ohne Reinraumeinrichtung können kommerziell erhältliche kundenspezifische SU-8-Urformen erwerben. Mit dem sich wiederholenden PDMS-Spritzguss (Abbildungen 1A, 1B und 1C) können Hunderte von Einwegchips hergestellt werden. PDMS-Formgebung und Chipmontage können in jedem Labor durchgeführt werden und erfordern keine Reinraumeinrichtungen, jedoch sind Arbeitsplätze mit laminarer Luftströmung günstig.

Der Prozess beginnt mit dem Design des mikrofluidischen Chipsystems. In der Regel wird CAD-Software verwendet, um den mikrofluidischen Chip zu entwerfen (Abbildung 1A). Nach der CAD-Bearbeitung wird eine Maske von einem E-Beam-Schreiber (Abbildung 1B) mit einer Auflösung im Submikrometerbereich erzeugt. In der vorliegenden Studie wurde eine 5-Zoll-Chrom-Maske erstellt, die für die SU-8-Wafer-Lithographie verwendet wurde. Der endgültige Silizium-SU-8-Wafer wird für das PDMS-Spritzgießen verwendet (Abbildung 1D). Nach einem Backschritt wird die PDMS-Platte in Späne geschnitten, die sich irreversibel mit den Objektträgern verbinden (Abbildung 1E). Zum Schluss wird der Schlauch angeschlossen (Abbildung 1F).

Abbildung 2 zeigt den Aufbau des mikrofluidischen Systems im Detail. Er besteht aus zwei Aussaateinläufen, einem Gradientengenerator zum Mischen verschiedener Substrate bzw. Medien und einem Auslauf. Die Hauptkanäle haben eine Abmessung von 50 μm x 10 μm (B x H). Jedes Gerät besteht aus sechs Arrays von PLBRs, die jeweils 5 PLBRs enthalten. Das Ergebnis sind 30 parallelisierte Reaktoren in einem mikrofluidischen Gerät.

Abbildung 3 veranschaulicht die Produktion des Replikationsmasters. Wie im Protokoll ausführlich beschrieben, wird eine erste SU-8-Schicht durch SU-8-Lithographie hergestellt (Abbildung 3A). Ein ähnliches Verfahren wird für die zweite Schicht angewendet (Abbildung 3B). Um die Kanalgeometrie zu überprüfen, untersuchten wir die Höhe der PLBRs und Hauptkanäle mit einem Profilometer. In dem in Abbildung 3C gezeigten Beispiel wurde die erste Schicht (die Kultivierungsschicht) gemessen. Hier zeigt die Schicht eine gleichbleibende Höhe von 1.200 nm, die für die Kultivierung von C. glutamicum im BHI-Medium geeignet ist.

Abbildung 4 zeigt das PDMS-Formverfahren, beginnend mit dem PDMS-Mischen (Abbildung 4A), gefolgt vom Formprozess (Abbildung 4B) und schließlich dem Klebeschritt (Abbildung 4C). Abbildung 4D zeigt den endgültigen mikrofluidischen Chip mit der 170 μm dicken Glasplatte, dem PDMS-Chip (3 mm hoch) mit Ein- und Ausgängen und Stahlnadeln, die mit den Rohren verbunden sind. Nach dem Experiment kann der Chip entsorgt werden und es ist keine umfangreiche Reinigung notwendig. Darüber hinaus ist es einfach zu montieren und zu handhaben. Es ist kein aufwendiges und schwieriges Befüllverfahren notwendig.

Geräteprinzip

Abbildung 5 zeigt das Funktionsprinzip des Reaktorsystems. Zellen werden in das mikrofluidische Gerät infundiert und einzelne Zellen bleiben einfach durch Zell-Wand-Wechselwirkungen im PLBR gefangen. Aufgrund des unterschiedlichen hydrodynamischen Widerstands von Kanal und PLBR tritt im PLBR nur eine minimale Strömung auf. Nach der Aussaat des PLBR (Abbildung 5A) wird die Wachstums- und Beobachtungsphase mit einem Wechsel von Bakterienlösung zu Wachstumsmedium eingeleitet (Abbildung 5B). Nachdem die PLBRs überwuchert wurden (Abbildung 5C), wird das Experiment in der Regel gestoppt und Zeitrafferbilder können analysiert werden. Für die Einfangmechanismen und das Strömungsprofil innerhalb des PLBR wird auf Grünberger et al. verwiesen.¹³ für weitere Details.

Analyse der Wachstumsrate

Das vorliegende System kann angewendet werden, um verschiedene Bakterienarten in Bezug auf verschiedene biologische Parameter wie Wachstum, Morphologie oder ein Fluoreszenzsignal zu untersuchen. In einem ersten Beispiel wurde C. glutamicum, ein industriell relevanter Produktionsorganismus, unter Standard-Kultivierungsbedingungen (T=30 °C, CGXII Medium²¹) kultiviert. Abbildung 6A zeigt die Wachstumskurven, die von drei isogenen Mikrokolonien abgeleitet wurden. Das exponentielle Wachstum wird aufrechterhalten, bis die PLBRs gefüllt sind, was darauf hindeutet, dass keine Nährstofflimitierung auftritt. Abbildung 6B zeigt vier DIC-Zeitraffer-Mikroskopiebilder einer wachsenden C. glutamicum-Kolonie.

Fluoreszenzanalyse

Für die Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie verwenden Forscher häufig spezifische fluoreszierende Proteine, zum Beispiel GFP oder Derivate, um einen bestimmten Phänotyp von Interesse mit einer messbaren Ausgabe (einem Fluoreszenzsignal) zu koppeln. Um die Anwendbarkeit des PBLR für fluoreszenzbasierte Zeitrafferstudien zu demonstrieren, untersuchten wir die Fluoreszenzemission eines C. glutamicum-Stammes, der ein Plasmid-kodiertes YFP-TetR-Fusionsprotein unter Kontrolle des P-tac-Promotors (pEKEx2-yfp-tetR) ^{produzierte18,22}. Es ist bekannt, dass die Expression von Ptac in Gegenwart niedriger Induktorkonzentrationen (IPTG) zu signifikanten Zellvariationen in isogenen Bakterienpopulationen führt. Ausgehend von einer Vorkultur wurde das Wachstum und die Einzelzellfluoreszenz für mehrere isogene Mikrokolonien verfolgt. Wie in Abbildung 7 zu sehen ist, beobachteten wir eine phänotypische Heterogenität zwischen verschiedenen Mikrokolonien und eine Heterogenität auf Einzelzellebene innerhalb von Kolonien, die von einer Mutterzelle ausgehen. Eine Kolonie (Abbildung 7B, PLBR 1) zeigte fast keine Fluoreszenzemission, während Zellen von PLBR 2 eine geringe Fluoreszenzemission aufgrund der basalen yfp-tetR-Expression desP-tac-Promotors aufwiesen. In PLBR 3 war die Fluoreszenzemission im Vergleich zu den anderen Kolonien beträchtlich stark und es wurde eine breite Verteilung der Population beobachtet. Dieses Beispiel zeigt die Anwendbarkeit des PBLR für Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie-Studien. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie, bei der die Fluoreszenz einzelner Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmt werden kann, ermöglichen die vorliegenden Systeme die Verfolgung von Zellen und die Untersuchung der Einzelzellfluoreszenz in Echtzeit über viele Generationen.

Abbildung 1.Überblick über den Produktionsprozess von PLBR-Chips. Herstellung von Master-Formen: beginnend mit (A) Design, (B) Herstellung von Lithografiemasken, und (C) Waferproduktion. PDMS-Glaschip-Produktion: beginnend mit (D) des PDMS-Spritzgusses, gefolgt von (E) Glas und PDMS-Verklebung und (F) Endmontage des Chips.

Abbildung 2. Aufbau des PLBR-Chips. (A) CAD-Zeichnung des gesamten mikrofluidischen Chips; (B) Vergrößerung ausgewählter Layout-Positionen: Das Layout enthält zwei Medium Inlets (a1), einen Gradientengenerator mit Mischkanälen (a2) und 6 parallele PLBR-Arrays (b1). b2 zeigt einen PLBR, der in einen Fluidkanal mit einer Breite von 100 μm eingebettet ist. Der PLBR hat einen Innendurchmesser von 40 μm und Nährstoffkanäle mit einer Breite von 2 μm. Der Säeinlauf hat eine Länge von 40 μm. Die rosa Farbe steht für die erste Schicht (Fang- und Kultivierungsbereich) und die blaue Farbe für die zweite Schicht (Flüssigkeitstransport).

Abbildung 3.Illustration des Herstellungsprozesses von zweischichtigen Wafern. (A) Herstellung der ersten Schicht mit Einfangstrukturen; (B) Herstellung der zweiten Schicht mit Flüssigkeitskanälen, -ein- und -auslässen; (C) Repräsentative Oberflächenprofile der ersten Schicht. In diesem Fall betrug die Höhe der ersten Schicht 1.200 nm und wird für die Kultivierung von C. glutamicum in komplexem Medium verwendet.

Abbildung 4.Herstellung von Geräten und repräsentativer Chip. Illustration des PDMS-Formprozesses: (A) PDMS-Mischen und Entgasen; (B) PDMS-Formteil; (C) Trennmittel, Schneiden und Spankleben. Endgültiger Chip (Reproduktion mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry¹³): (D) Foto des PDMS-Chips mit 2 Ein- und 1 Ausgang; (E) CAD-Bild von sechs parallelen Arrays mit jeweils 5 PLBRs; (F) REM-Aufnahme eines PLBR.

Abbildung 5. Funktionsprinzip des PLBR-Systems. (A) Aussaatphase; (B) Wachstumsphase der bakteriellen Mikrokolonien; (C) Überlaufphase. Reproduktion mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Abbildung 6.Bestimmung der Wachstumsrate von C. glutamicum WT-Mikrokolonien. (A) Wachstumsfläche von drei PLBR-Kulturen und resultierende Exponentialkurven (Teile mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry reproduziert)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Zeitrafferaufnahmen einer wachsenden C. glutamicum-Kolonie.

Abbildung 7. PBLR-basierte Analyse der Heterogenität der Population. Gezeigt ist C. glutamicum, das eine yfp-tetR-Fusion unter der Kontrolle des Ptac-Promotors (pEKEx2-yfp-tetR) in Abwesenheit des Induktors IPTG exprimiert. (A) Experimenteller Arbeitsablauf; (B) drei isogene Mikrokolonien, die eine Heterogenität von Kolonie zu Kolonie und von Zelle zu Zelle aufweisen; (C) Verteilung der einzelligen Fluoreszenz innerhalb der jeweiligen Mikrokolonien.

Abbildung 8. Rasterelektronenbilder verschiedener PLBRs. REM-Bilder mit Aussaateinlässen zur Optimierung der Fangeffizienz. (A) Größere Säeinläufe (B) Kleinere Säeinläufe (C) Größere "offene" Säeinläufe (D) Zwei Säeinläufe.

an ist

Schritt	Problem	Mögliche Ursache	Lösung
Wafer-Herstellung	Eingeschlossene Luftblasen in SU-8 während des weichen Backens	Temperaturanstieg zu schnell	Bei 95 °C und 65 °C mehrmals backen
Wafer-Herstellung	Verschwindende und kaputte SU-8-Strukturen	Nicht optimales Herstellungsverfahren; mechanische Beanspruchung in SU-8-Strukturen	Optimierung von Parametern wie Backzeit, Einwirkzeit
Wafer-Herstellung	SU-8-Schichten bis zu niedrigen oder hohen oder ungleichmäßigen Schichtdicken	Problem beim Schleudercoating	Überprüfen Sie die Parameter des Spin-Coaters und das Wafer-Chuck
Chip-Bonding und Montage	Kollabierende PLBRs	PDMS-Bonding-Parameter nicht optimal	Passen Sie die Leistung, die Plasmabelichtungszeit und die Backzeit nach dem Verkleben
Chip-Bonding und Montage	Verschmutzte Strukturen und Partikel in den PLBRs	Chip wurde nicht richtig gereinigt	Scotch-Tape für die Oberflächenreinigung auftragen
Chip-Bonding und Montage	Unzureichende PDMS-Glasverklebung	Verklebungsparameter nicht optimal oder unzureichende Reinigung	Überprüfen Sie die Einstellungen des Sauerstoffplasmas
Mikrofluidisches Experiment	Leckage von Flüssigkeit	Das Einlass-/Auslassloch wurde nicht richtig gestanzt	Optimieren Sie den Lochprozess
Mikrofluidisches Experiment	Viele kleine PDMS-Partikel beim Befüllen	Das Loch wurde nicht richtig gestanzt	Optimieren Sie den Lochprozess
Mikrofluidisches Experiment, biologischer Aspekt	Kein Zellwachstum	Lösungsmittelrückstände aus dem Reinigungsverfahren	Spülen Sie den Chip vor dem Laden der Zelle umfangreicher oder lassen Sie das Lösungsmittel vor der Verklebung verdampfen
Mikrofluidisches Experiment, biologischer Aspekt	Veränderte Wachstumsraten	Verschiedene Gründe	Vorkultur und Temperatur prüfen
Mikrofluidisches Experiment, biologischer Aspekt	Veränderungen der Zellmorphologie während der Kultivierung	Nährstoffeinschränkungen oder Temperaturverschiebung	Überprüfen Sie den Inkubator und den Ablauf
Mikrofluidisches Experiment, Technischer Aspekt	Drift in der Position während der Zeitraffermikroskopie	temperaturschwankungen	Überprüfen Sie das Temperaturprofil vor Experimenten, bis keine Schwingung mehr vorhanden
Mikrofluidisches Experiment, Technischer Aspekt	Verlust von Zellen während der Kultivierung	Leicht bis hohe Reaktorhöhe	Optimierung der Reaktorhöhe
Mikrofluidisches Experiment, Technischer Aspekt	Kein Einfangen	Zu geringe Reaktorhöhe	Optimierung der Reaktorhöhe

Tabelle 1. Fehlerbehebung. Diese Tabelle fasst kritische Aspekte, häufige Fehler und mögliche Lösungen bei experimentellen Arbeiten zusammen.

Discussion

Wir haben die Herstellung, den Versuchsaufbau und die damit verbundenen Betriebsverfahren eines mikrofluidischen PDMS-Geräts, das mehrere (PLBRs) enthält, für die Einzelzellanalyse von Bakterien beschrieben.

Die Mikrofabrikation mit weichen Lithographietechniken ermöglicht eine schnelle Anpassung der Geräteabmessungen für verschiedene Größen und Bakterienmorphologien. Derzeit optimieren wir den Pikoliter-Bioreaktor im Hinblick auf die Kultivierung verschiedener mikrobieller Organismen und den Kultivierungsdurchsatz. Um die Einfangeffizienz zu erhöhen, wird auch die Reaktorgeometrie optimiert. Abbildung 8 zeigt vier neue PLBR-Geräte, die derzeit validiert sind. In allen Abbildungen wurde der Säkanal hinsichtlich Breite und Form neu gestaltet. In der Praxis scheint sich dies auf die Anzahl der gefangenen Zellen auszuwirken, bedarf aber weiterer Untersuchungen. Signifikante Verbesserungen hinsichtlich der Einfangeffizienz wurden auch durch den Einbau zusätzlicher Überlaufkanäle erreicht, die zu einer höheren konvektiven Strömung durch den Reaktor führten und mehr Zellen eingefangen wurden. Gleichzeitig erhöht man jedoch das Risiko, Zellen während der Kultivierung auszuwaschen.

Das Gerät ist eine interessante Alternative zu makroskaligen Kultivierungen, die seit Jahrzehnten zur Untersuchung von Wachstums- und Produktionsprozessen auf Einzelzellebene eingesetzt werden. Er stellt jedoch einige wichtige Anforderungen: Für die parallele Überwachung mehrerer Pikoliter-Bioreaktoren ist ein hochauflösender und vollmotorisierter mikroskopischer Aufbau mit Fokusdriftkompensation zwingend erforderlich. Zusätzlich wird ein Inkubationssystem benötigt, um die gewünschte Kultivierungstemperatur während der Messungen konstant zu halten.

Wir erreichen eine Erfolgsquote von 95 % bei der Herstellung von Geräten. Die Hauptprobleme hängen mit ineffizienten PDMS-Glasverklebungen, PDMS-Dacheinstürzen oder Flüssigkeitsleckagen zusammen (siehe Tabelle 1 zur Fehlerbehebung der am häufigsten auftretenden Probleme). Obwohl die experimentelle Arbeit teilweise unter unsterilen Bedingungen durchgeführt wird, sehen wir bei den Experimenten aufgrund des geschlossenen fluidischen Systems nur selten eine Kontamination. PDMS-Mikrofluidikgeräte sind optisch transparent und können daher für hochauflösende In-vivo-Bildgebung verwendet werden. Obwohl PDMS perfekt für die Anwendung geeignet zu sein scheint, hat es eine hohe Affinität zu hydrophoben Molekülen, was die Verwendung von Lösungsmitteln, die in biokatalytischen Ganzzellprozessen weit verbreitet sind, einschränkt. Es stehen jedoch geeignete Beschichtungen zur Verfügung, um das Protokoll an diese Art von Anwendungen anzupassen.

Das vorgeschlagene PLBR eignet sich gut für die räumlich-zeitliche Analyse zellulärer und sogar subzellulärer Ereignisse verschiedener Bakterienarten. Ein großer Vorteil des vorliegenden Ansatzes liegt in der Möglichkeit, das Wachstum von Mikrokolonien im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden direkt zu quantifizieren. Darüber hinaus ermöglicht der PLBR den Anbau unter definierten und konstanten Bedingungen. Da das System die Verwendung kleiner Mengen an Reagenzien oder Materialien ermöglicht, bietet es die Vorteile, dass es kostengünstig, anpassbar und für einen hohen Durchsatz geeignet ist. Bei traditionellen Methoden werden bei der Analyse der mikrobiellen Kultivierung Durchschnittswerte der Gesamtpopulation berücksichtigt. Darüber hinaus ist bei bestehenden Methoden eine manuelle Probenahme erforderlich, was zu einer Degradation der Proben und damit zu Fehlern in der Messung führen kann. Das PLBR bietet neue Perspektiven für die Bioprozessentwicklung und die Analyse der Populationsheterogenität in der Mikrobiologie. Das PLBR ist ein vielversprechendes Werkzeug für verschiedene Anwendungen in der Bioprozessentwicklung und könnte in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, z.B. bei der Analyse der Zell-zu-Zell-Heterogenität, der Analyse spezifischer Zellcluster innerhalb von Zelllinien, dem Screening von mikrobiellen Produktionsstämmen und der Echtzeituntersuchung von Zellphänotypen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siliziumwafer 100 mm Durchmesser, P/BOR < 100>	Si-MAT, Silikonmaterialien, Deutschland
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Deutschland
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Deutschland
SU-8 Entwickler mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Deutschland
Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Dow Corning; Farnell GmbH, Deutschland
Dosiernadeln Präzisionsspitzen  27 G; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Deutschland
Glasplatten D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Deutschland
Locher AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Deutschland
Einwegspritzen – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Deutschland	552-183143
Spritzen, 1 ml sterile Glasspritzen	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Deutschland
Chemikalien
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
Harnstoff	Carl Roth GmbH + Co. KG. KG, Deutschland
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
Biotin	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
Procatechuinsäure	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
Glukose-Monohydrat	Carl Roth GmbH + Co. KG, Deutschland
BHI	Becton, Dickinson
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Deutschland
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Deutschland
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Mask Aligner MA-6	Karl Suess
Heizplatte HP30A - 2	Torrey Pines Scientific
Laborofen Memmert UN 200	Memmert
Plasmareiniger FEMTO	Diener Electronics, Deutschland
neMESYS Spritzenpumpen	Cetoni GmbH, Deutschland
Magnetrührer CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Mikroskop Nikon Eclipse Ti	Nikon Mikroskopie
Mikroskop Inkubator	Pecon GmbH, Deutschland
Zentrifuge minispin plus " schwarze Linie"	Eppendorf	9776501
Photometer BioPhotometer plus	Eppendorf	6132000008
Schüttelschüttler/Inkubator 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Deutschland
Profilometer, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco