FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

Summary

Eine Beschreibung, wie Förster Resonance Energy Transfer integriert biologischen Sensoren (FIBS) zur in-situ-Kalibrierung Metabolic Profiling vorgestellt. Die FIBS kann verwendet werden, um die intrazellulären Spiegel von Metaboliten nicht-invasiv Unterstützung bei der Entwicklung von Stoffwechselmodelle und Hochdurchsatz-Screening von Bioprozess-Bedingungen zu messen.

Abstract

Im Zeitalter der Computerbiologie, neue Hochdurchsatz-Versuchssysteme, um zu füllen und zu verfeinern Modelle, so dass sie für Prognosezwecke validiert werden erforderlich. Idealerweise würden solche Systeme mit geringem Volumen, die Probenahme und destruktiven Analysen ausschließt, wenn die Zeit natürlich Daten erhalten werden sollen sein. Was benötigt wird, ist eine in-situ-Monitoring-Tool, das in Echtzeit und nichtinvasiv die notwendigen Informationen mitteilen können. Eine interessante Möglichkeit ist die Verwendung von Fluoreszenz-, Protein-basierte biologische in vivo-Sensoren als Reporter der intrazellulären Konzentrationen. Eine besondere Klasse von Biosensoren, die in vivo-Anwendungen in Metaboliten Quantifizierung gefunden ist, wird auf Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen, die von einem Ligandenbindungsdomäne basierend verbunden. FRET integrierten biologischen Sensoren (FIBS) konstitutiv in der Zelllinie hergestellt, sie haben schnelle Reaktionszeiten und ihre spektralen chaschaften bezogen auf die Konzentration des Metaboliten in der Zelle ändern. In dieser Arbeit wird das Verfahren zur Konstruktion des chinesischen Hamsters (CHO)-Zelllinien, die konstitutiv ein FIBS für Glukose und Glutamin und die Kalibrierung der FIBS in vivo im Batch Zellkultur, um zukünftige Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten-Konzentration zu ermöglichen beschrieben. Daten von Fed-Batch-Kulturen von CHO-Zellen zeigt, daß die FIBS konnte in jedem Fall, um die sich ergebende Änderung der intrazellulären Konzentration zu detektieren. Verwendung des Fluoreszenzsignals von den FIBS und der zuvor konstruierten Eichkurve wurde die intrazelluläre Konzentration genau bestimmt, wie durch einen unabhängigen enzymatischen Assay bestätigt.

Introduction

Metabolite Überwachung hat verschiedene Anwendungen in der Bioverfahrenstechnik, einschließlich Prozessentwicklung, Medien-und Futtermittel-Design und Metabolic Engineering. Verschiedene Verfahren sind durch die Verwendung von enzymatischen ^1, Chemie ^{2, 3} oder Bindungsassays für Konzentrationsmessungen zur Verfügung. Eine interessante Möglichkeit ist die Verwendung von Fluoreszenz-, Protein-basierte biologische in vivo-Sensoren, die Daten über die intrazelluläre Konzentration von Schlüsselmetaboliten. Im Ultra-Low-Volume-Assays, Fluoreszenz ist ein geeignetes Mittel, wie Miniaturisierung tatsächlich verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ^{von 4,5} und ^einer proteinbasierte Sensoren können genetisch codierten Sinne, dass keine exogenen Reagenzien zur Metabolitenanalyse notwendig sind. Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Biosensoren bestehen aus zwei fluoreszierenden Proteinen, die von einem Liganden-bindenden Domäne verbunden ist. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem photoangeregten Donor zu einem Akzeptor-Fluoreszenzmolekül locat in unmittelbarer Nähe (<100) ed. Liganden oder Bindungsspaltung bewirkt eine Konformationsänderung in den Sensor, der wiederum induziert eine Änderung in der Nähe der Fluorophore, die zu einer Änderung im FRET-Effizienz durch die Änderung im Emissionsspektrum gemessen. FRET integrierten biologischen Sensoren (FIBS) konstitutiv in der Zelllinie hergestellt und ihre spektralen Eigenschaften ändern sich die Konzentration des Metaboliten in der Zelle. FIBS haben schnelle Reaktionszeiten machen sie ideal für Messungen für dynamische Modelle ^6. Zurück Anwendungen umfassen die Überwachung und mehrfache Einzel ^{7-9 10} Metaboliten und Bereitstellung von Daten über raumzeitliche Verteilung ^11. Apo-Max, wobei die Ligandenbindung stört die Nähe der Fluorophore Senkung der Energieübertragung und Apo-Min, wobei die Ligandenbindung bringt die beiden Fluorophore in engeren Kontakt (Fig. 1): FIBS kann in zwei Konfigurationen erzeugt werden.

_content "> In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Konstruktion von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zelllinien, die konstitutiv ein FIBS ein Metabolit Glucose oder Glutamin dargestellt. eine Methodik für die Kalibrierung des Sensors in vivo eingerichtet, um künftige quantitative Freigabe Messungen der intrazellulären Metaboliten-Konzentration, wie in Fig. 2 dargestellt. Auf dieser Grundlage wird die intrazelluläre Konzentration von Glucose oder Glutamin in Fed-Batch-Kulturen von CHO-Zellen bestimmt werden, an denen die beiden Nährstoffe in hohen Konzentrationen in-Verfahren zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung des Fluoreszenzsignals von den FIBS und dem zuvor konstruierten Eichkurve ist genau Vorhersage der intrazellulären Konzentration möglich, von einem unabhängigen enzymatischen Test bestätigt. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber gegenwärtigen analytischen Techniken, da sie nicht invasiv ist, kostengünstige und schnell, was eine Echtzeit-Signal der FIBS, die mon seinwährend der Kultivierungs itored.

Protocol

1. Zelllinie Revival und Wartung

1. Revive CHO-Zellen in 9 ml CD-CHO-Medium mit 8 mM L-Glutamin und 10 ml / L 100x Hypoxanthin / Thymidin-Supplement (komplette Wachstumsmedium) ergänzt.
2. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
3. Resuspendieren der Zellen in 10 ml frisches vollständiges Wachstumsmedium.
4. Entfernen einer 1 ml Probe und bestimmen die Lebendzellkonzentration mittels Lichtmikroskopie mit der Trypanblau-Ausschluss-Verfahren in einer Zählkammer.
5. Initiieren einer Kultur bei einer Aussaatdichte von 3 x 10 ⁵ Zellen / ml in 125 ml-Schüttelkolben.
6. Erhaltung der Kultur im Brutschrank bei 37 ° C, einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2, auf einem Orbitalschüttler bei 120 Umdrehungen pro Minute dreht.
7. Subkultivierung alle 3-4 Tage in komplettem Wachstumsmedium bei einer Aussaatdichte von 2 x 10 ⁵ Zellen / ml.

2. Transfektion der Zelllinie mit dem Plasmid Containing den Biosensor Gene

1. Bereiten Plasmid-DNA mit einem großen Plasmid-Reinigungs-Kits.
2. Aufrechterhaltung Zellen an den entsprechenden Bedingungen (37 ° C, 5% CO ₂₎ 12-24 Stunden vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass die Zellen sich aktiv teil Zeitpunkt der Transfektion.
3. Zählen der Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens, bereiten dann ein Arbeitsvolumen von 20 ml der Zellkultur in einem 125 ml Schüttelkolben in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
4. Verwenden Sie eine geeignete Transfektion Kit für die Zelllinie verwendet wird. Die Plasmid-DNA zu Transfektionsreagenzien Verhältnis wird abhängig von der Zelllinie und Vektor sein. Es wird empfohlen, dass diese durch Testen eines Bereichs von Verhältnissen innerhalb des durch den Hersteller vor der Durchführung der abschließenden Transfektionen angegeben optimiert. Auch halten mindestens eine negative Kontrollkultur, die Zellen aber keine DNA enthalten.
5. Inkubation für 4 Tage im statischen Modus und dann zu einem shaki übertragenng-Plattform bei 125 Umdrehungen pro Minute rotiert.
6. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum für Plasmid-Selektion auf eine geeignete Konzentration, wie durch einen Kill-Kurve bestimmt. In dieser Studie wurde Zeocin bis zu einer Endkonzentration von 400 ug / ml für die Selektion von transfizierten Zellen zugegeben.
7. Ändern Sie Medien zu einem geeigneten Zeitintervall für die Zelllinie, das Hinzufügen Antibiotikum jedes Mal, bis die Zellen in Steuer gut sind gestorben.
8. Mit den meisten Brunnen konfluenten Kulturen Schütteln Fortschritt.
9. Schaffung eines Zellbank durch Einfrieren der Zellen in Kryoröhrchen mit 10 ⁷ lebensfähigen Zellen in 1 ml Gefriermischung. In dieser Arbeit besteht diese aus 92,5% Wachstumsmedium und 7,5% Dimethylsulfoxid.

3. Batch-und Fed-Batch-Zellwachstumskurve

1. Folgen Sie den Anweisungen für die Zellwartungs oben, um dreifach-Zellkulturen der transfizierten CHO-Zellen in 250 ml etablieren Schüttelkolben mit einem Arbeitsvolumen von 50 ml.
2. Pflegen Sie die kulAuflösung in einem befeuchteten Zell Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO _2, auf einem Orbitalschüttler bei 125 Umdrehungen pro Minute dreht, und entfernen 4,1 ml Proben von jeder wachsenden Kultur bei 24 Stunden Intervallen.
3. Verwenden von 100 &mgr; l der Probe, um die Konzentration lebensfähiger Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypan-Blau-Ausschlussverfahren zu bestimmen.
4. Wiederholen, bis die Konzentration lebensfähiger Zellen auf Null reduziert wird.
5. Wiederholen für die Fed-Batch-Zellkulturen die Ergänzung mit der entsprechenden Menge an Glucose oder Glutamin am Tag 6 nach deren Konzentrationen auf ihre Anfangswerte von 36 mm und 4 mm wiederherzustellen sind. Es wird empfohlen, dass zusätzliche Kontrollkulturen werden auch erhalten, was mit dem gleichen Volumen (12 ml in diesem Fall) von reinem Wasser zugeführt werden.

4. FRET-Messungen Verhältnis

1. Nehmen 2 ml der Proben täglich in Schritt 3.2 Zentrifuge entfernt und bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C.
2. Resuspendete das Zellpellet in 2 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bringen Sie diese in eine 6-Well-Platte und fügen Sie eine Leerprobe, die keine Zellen, die man gut.
3. Messen Sie die Höhe der blauen und gelben Fluoreszenz sofort bei einer Anregungswellenlänge von 430/435 nm und Emissionswellenlängen von 465/435 nm (blau) und 520/510 nm (gelb).
4. Berechnen Sie die FRET-Ratios (Verhältnis von gelben Fluoreszenz über blaue Fluoreszenz erfasst wird).

5. Metabolite Assays

1. Nehmen 2 ml der Proben täglich in Schritt 3.2 Zentrifuge entfernt und bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
2. Zellpellet in 3 ml eiskaltem PBS gewaschen und erneut zentrifugieren bei 100 × g für 5 min.
3. Den Überstand und Zellpellet in 3 ml eiskaltem PBS wie oben. Beschallen der Probe 5x für jeden 3 min bei einem Puls von 15 Sek. auf 15 Sek. und ausgeschaltet. An diesem Punkt ist die Zelle zusätzlichects, falls gewünscht eingefroren werden.
4. Verwenden ein geeignetes Glucose-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers an Proben von Zellextrakten, die intrazellulären Glucosekonzentration zu ermitteln (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Verwenden Sie geeignete Standards, um eine Standardkurve zu konstruieren. In dieser Arbeit, die Konzentration der Standards lag zwischen 0-100 mM.
5. Verwendung der Messwerte für die Standards, die Standardkurve zu konstruieren, und um die lineare Gleichung der besten Anpassung (in diesem Fall y = 1310.51x - 723,43 wobei y die Absorptionsmessung und x der Glucosekonzentration).
6. Berechnen Sie die Glucose-Konzentrationen anhand der Standardkurve und unter Berücksichtigung der Verdünnung. Die intrazellulären Glukosekonzentration kann dann berechnet werden unter Verwendung dieser Gleichung:
   
   Für CHO-Zellen, wurde die Einzelzellvolumen berechnet wird unter Verwendung eines Zelldurchmesser von 12 &mgr; M ¹²
7. Verwenden Sie eine geeignete Glutamin-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers an Proben von Zellextrakten, um die intrazellulären Glutamin-Konzentration zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Verwenden Sie geeignete Standards, um eine Standardkurve zu konstruieren. In dieser Arbeit, die Konzentration der Standards lag zwischen 0-2 mM.
8. Wie in 5.5 oben, Die Eichkurve (in diesem Fall y = + 17,1 203.1x wobei y die Absorptionswert ist und x die Glucosekonzentration)
9. Mit der Standardkurve, die Berechnung der Glutamin-Konzentration der Proben, wobei die Verdünnung berücksichtigt. Die intrazelluläre Konzentration Glutamin können unter Verwendung der obigen Gleichung 1 berechnet werden.

Results

Ein Überblick der Methoden ist in Fig. 2 dargestellt. In der hier vorgestellten Arbeit wurden CHO-Zellen mit dem Vektor FIBS und stabile Zelllinien transfiziert wurden bei einem Antibiotikum Druck von 400 ug / ml Zeocin selektiert. Daher wurden zwei verschiedene stabile Zelllinien, die konstitutiv die Glucose und Glutamin Sensoren geschaffen. Fig. 1 zeigt die Konfiguration der beiden Biosensoren in dieser Studie verwendet. Der Glukosesensor ist auf der Apo-Max-Prinzip und die entspreche...

Discussion

Die FIBS ermöglichen in vivo und in situ Quantifizierung von Schlüsselmoleküle, in diesem Fall das Wachstum einschränkende Nährstoffe, die Unsicherheiten, die aus dem Abschrecken und Extraktionsverfahren. Die Ergebnisse legen nahe, dass es eine gute Korrelation zwischen der FIBS Signal und die intrazellulären Konzentrationen im Bereich von 1-5 mM für Glucose und 0,3-2 mM Glutamin. Im Batch-CHO-Zellkultur, sind diese Konzentrationen in den exponentiellen, stationär, und Anfang der Rückgang Phasen aufget...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Die Zelllinie variiert je nach den Zielen der Studie
pCDNA4/TO-Vektor	Life Tecnologies
TransIT-PRO Transfektionsreagenz	Mirus Bio	MIR 5700	Transfektionen können mit jeder Methode durchgeführt werden, die für die zu untersuchende Zelllinie geeignet ist
Zeocin	Invivogen
CD-CHO Medium	Life Technologies	10743-011	Das Zellwachstumsmedium hängt von den untersuchten Zellen
ab 100x HT Supplement	Leben Technologies	11067-030
L-Glutamin 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
InfinitePRO 200 Platten-Reader	Tecan	FLx800TBI	Jeder 96-Well-Fluoreszenzplatten-Reader, der auf die erforderlichen Wellenlängen zugreifen kann, kann ersetzt werden
Filter für Platten-Reader	Tecan	30000463
Maxiprep Plasmid-Aufreinigungskit	Qiagen	12163	Jedes geeignete Kit kann ersetzt werden
Amplex Red Glukose/Glukoseoxidase Assay Kit	Invitrogen	A22189	Jedes geeignete Kit kann ersetzt werden
EnzyChrom  Glutamin-Assay-Kit	BioAssay Systems	EOAC-100	Jedes geeignete Kit kann ersetzt werden
Verbessertes Neubauer-Hämozytometer	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Inkubator	Nuaire	NU-5510E