Abstract
יש כבד קיבולת גדולה להתחדש. Hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, יכול להתחדש באחת משתי דרכים: התחדשות כבד hepatocyte- או מונע מרה. בהתחדשות כבד מונע hepatocyte, hepatocytes התחדשות נגזרים מhepatocytes preexisting, ואילו, בהתחדשות מונעת מרה, hepatocytes התחדשות נגזרים מתאי אפיתל מרה (BECs). להתחדשות כבד מונע hepatocyte, יש מודלים של מכרסמים מצוינים שתרמו באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד. עם זאת, אין מודל מכרסם כזה קיים להתחדשות כבד מונע מרה. אנחנו דיווחו לאחרונה על מודל פגיעה בכבד דג הזברה שבBECs הרחבה להצמיח hepatocytes על אובדן hepatocyte חמור. במודל זה, hepatocytes הם ablated במיוחד על ידי אמצעי pharmacogenetic. כאן אנו מציגים בפירוט את השיטות ללקטוע hepatocytes ולנתח את תהליך ההתחדשות הכבד מונע-BEC.מודל אבלציה hepatocyte ספציפי זה יכול לשמש נוסף כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים ותאיים הבסיסיים של התחדשות כבד מונע מרה. יתר על כן, יכול להיות מיושמות בשיטות אלה למסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שלהגדיל או לדכא התחדשות כבד.
Introduction
הכבד הוא איבר משובי מאוד. במהלך התחדשות כבד, התחדשות hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, נגזרים מhepatocytes קיים מראש (התחדשות כבד מונע hepatocyte) או BECs (התחדשות כבד מונע מרה) 1,2. פגיעה בכבד בדרך כלל מעוררת את ההתפשטות של hepatocytes קיים מראש; עם זאת, כאשר התפשטות hepatocyte נפגעת, BECs יכולה לתרום לhepatocytes 2-4. שני מצבים אלה של התחדשות כבד הם משמעותיים מבחינה קלינית. לאחר ההסרה כירורגית של חלק מהכבד האנושי (למשל, בגלל גידולים בכבדים או תורמים כבד חיים), hepatocytes בכבד שנותר להתרבות כדי לשחזר את מסת כבד לאיבוד. לעומת זאת, בחולים עם מחלות כבד חמורות, התפשטות hepatocyte נפגעת מאוד, כך שBECs או תאי כבד (LPCs) מופיעות לתרום לhepatocytes התחדשות 5,6. מודל כריתה החלקי המכרסמים 2/3, שבhepatocytes להתרבות כדי לשחזר את המסה הכבד איבדה, תרם באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד מונע hepatocyte 7,8. עם זאת, אין מודל מכרסם בתוקף שבhepatocytes התחדשות נגזרים בעיקר מBECs. למרות שכמה דגמי רעלן כבד מכרסמים הובילו לזיהוי של התחדשות כבד מונע מרה 2-4, מחקרי שושלת ההתחקות אחרונים בעכברים מצביעים תרומה מינימאלית של BECs להתחדשות hepatocytes במודלים אלה 9,10. חלק מדגמי הפגיעה בכבד מכרסמים, כולל כריתה חלקית 11-13 ונזק כבד נגרם פרצטמול 14,15, יושמו לדג זברה והוביל לזיהוי של גנים חדשים או מסלולים מעורבים בהתחדשות כבד. עם זאת, המונע על ידי hepatocyte, אבל לא מונע-BEC, התחדשות כבד מתרחשת בדגמי פגיעה בכבד דג הזברה אלה. לכן, מודל פגיעה בכבד רומן שבי BECs הרחבה לתרום לregenerating hepatocytes נחוץ להבנה טובה יותר של התחדשות כבד מונעת-BEC.
מטרות העל של מודל אבלציה hepatocyte מתואר כאן (1) כדי ליצור מודל פגיעה בכבד שבי BECs נרחבת תורם להתחדשות תאים כבדות, ו- (2) להבהיר את המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התחדשות כבד מונעת-BEC. חוקרים שערנו כי חומרת פגיעה קובעת את המצב של התחדשות כבד; כך, אנו חוזים כי התחדשות כבד מונע מרה תיזום על פציעת hepatocyte חמורה. כדי לבדוק השערה זו, פיתחנו מודל פגיעה בכבד דג הזברה על ידי יצירת קו מהונדס, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, שמאוד מבטא Nitroreductase חיידקים (NTR) התמזגה עם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) תחת fabp10a hepatocyte הספציפי אמרגן. מאז NTR ממיר את prodrug אינה רעילה, metronidazole (Mtz), לתרופה רעילה לתאים, זה ablates רק נועד NTR-לבטא בתאים 16-18, במקרה זה, hepatocytes. על ידי מניפולציה של משך טיפול Mtz, היקף אבלציה hepatocyte יכול להיות נשלט. שימוש במודל זה, שדיווחנו לאחרונה כי על אובדן hepatocyte חמור, BECs הרחבה להצמיח hepatocytes התחדשות 19, אשר אושר עוד יותר על ידי שני מחקרים עצמאיים אחרים 20,21. לכן, בהשוואה למכרסמים האמורים ודגמי פגיעה בכבד דג הזברה, מודל אבלציה hepatocyte שלנו הוא יתרון נוסף ללימוד התחדשות כבד מונעת-BEC.
פרוטוקול זה מתאר את ההליך לביצוע ניסויי התחדשות כבד באמצעות מודל אבלציה hepatocyte דג הזברה. מודל זה יהיה מתאים לקביעת מנגנוני התחדשות כבד מונע מרה ולמסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שיכול להדחיק או להגדיל את ההתחדשות כבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דג הזברה הועלתה וגדלה בהתאם לנוהל מקובל; ניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.
1. הכנת עוברים / זחלים
- לנהל הזדווגויות מתוזמן, זכר להגדיר מבוגר והנקבה Tg (fabp10a: CFP-NTR) O דגי hemizygous או הומוזיגוטים s931 / N ולמקם את מחיצה ביניהם. הסר מחיצה זו למחרת בבוקר כאשר ההזדווגות היא רצויה. איסוף עובר על ידי סינון המים באמצעות מסננת רשת פלסטיק דקה.
- הפעל את המסננת הפוכה ולשטוף את משטח הרשת עם זרם עדין של מים ביצה לוותר מבקבוק לחיץ. העבר את 100 עוברים לצלחת פטרי 100 מ"מ עם 25 מיליליטר של מים ביצה. לשמור על לא יותר מ -100 עובר לכל צלחת פטרי ולגדל אותם בגיל 28 מעלות צלזיוס.
- לעכב פיגמנטציה, להוסיף phenylthiourea (PTU) לתוך צלחות פטרי לפני 10 שעות לאחר ההפריה (hpf), ולהעלות את הדוארmbryos / זחלים עד 80 hpf. הריכוז הסופי של PTU הוא 0.2 מ"מ. זהירות: PTU הוא רעיל. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
- להרדים את הזחלים על ידי הוספת 3-אמינו אסתר benzoic אתיל החומצה (Tricaine), בריכוז סופי של 0.016%, לצלחות פטרי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, זחלי סוג CFP-חיוביים. השתמש זחלים עם גודל דומה כבד וזורקים אותם עם כבד קטן יותר או גדול יותר.
הערה: כל זחלים CFP-חיובי, ללא קשר לעוצמת, ניתן להשתמש כי אין הבדל בין זחלי hemizygous והומוזיגוטים היקף אבלציה hepatocyte. זהירות: tricaine היא רעילה. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. - הסר את המים ביצה המכילים Tricaine ולהוסיף מים ביצה בתוספת 0.2 מ"מ PTU. שמור את העוברים / הזחלים ב 28 מעלות צלזיוס.
2. Mtz טיפול
- הכן פתרון 10 מ"מ Mtz טרי על ידי המסת .171 גרם של אבקת Mtz ב 1בתוספת מים ביצה 00 מיליליטר עם 0.2% מ"מ PTU DMSO ו0.2. לפזר לגמרי Mtz, לערבב את הפתרון על RT עם ערבוב מהיר במשך 20-30 דקות. כדי לעזור solubilize Mtz וכדי לשפר את חלחול Mtz לזחלים, להוסיף DMSO בעת הכנת Mtz. זהירות: חשיפה ממושכת או ריכוז מוגבר של Mtz הוא רעילה. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
- הפרד את הזחלים לקבוצות שליטה והניסיון בהעברת מספר רצוי של זחלים לשני 100 שונים צלחת פטרי מ"מ או צלחת רב גם. לקבוצת הניסוי, לשמור על הזחלים ב 10 מ"מ פתרון Mtz; לקבוצת הביקורת, לשמור אותם במי ביצה המכילים 0.2% DMSO.
- מכסה את הצלחות או צלחות פטרי המכילות את פתרון Mtz בנייר אלומיניום כדי למנוע את צילום איון של Mtz, ולדגור על 28 מעלות צלזיוס. משך טיפול Mtz תלוי בשלב הזחל והקו המהונדס.
- להתבונן אבלציה hepatocyte החמורה דומה ב
3. ניתוח של התחדשות כבד מונעת-מרה
- בסוף תקופת אבלציה, להסיר את פתרון Mtz מהצלחות. שטוף את הזחלים שטופלו Mtz על ידי הוספת 25 מיליליטר של מים ביצה. מערבולת הצלחת 2-3 פעמים כדי לשטוף את הזחלים לפני השלכת המים הביצה. חזור שלוש פעמים ולאחר מכן לטבול את הזחלים פעם נוספת במי ביצה. כדי להימנע מבצקת לב ומות זחל בזחלים שטופלו Mtz, להוסיף ריכוז נמוך יותר של Tricaine, בריכוז סופי של 0.008%, כדי לשתק את הזחלים.
- לניתוח בכבד, לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz תחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP. להעריך רמות אבלציה hepatocyte בהתבסס על הגודל הכבד יחסית: גדולים (לא מלוטשים; זחלי% 0-10), בינוני (ablated באופן חלקי; 10-20%), וקטנים מאוד (ablated באופן מלא; 80-90%).
- הסר את הזחלים עם כבדים שאינם ablated או ablated באופן חלקי. לשמור רק זחלים עם כבד זעיר, אשר מעיד על אבלציה hepatocyte החמורה. לניתוח בכבד בזמן שעות הנקודה (R0h) התחדשות 0, לקצור את הזחלים לאחר כישלון Mtz ומיון CFP. אחרת, לשמור על הזחלים מסודרים במי ביצה בתוספת 0.2 מ"מ PTU עד מוכן לקציר.
- העבר את הזחלים שנקטפו לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהחליף מים ביצה עם פתרון הקיבעון של פורמלדהיד 3% במאגר PEM. דגירה הצינור על C ° O מסובבי / N ב 4.
- החלף את פתרון הקיבעון עם 1 מיליליטר של PBSDT ולסובב את הצינור המכיל את הזחלים על הכתף במשך 5 דקות.
- העבר את הזחלים הקבועים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילים PBSDT ובאמצעות מלקחיים, להסיר באופן ידני סנפירי חלמון וחזה תחת מיקרוסקופ לנתח. העבר את TP 20 זחלים גזור לתוך צינור 1.5 מיליליטר. <li> החלף פתרון PBSDT עם 1 מיליליטר של תמיסת חסימה ולטלטל את הצינור על הכתף ב RT עבור שעה 2.
- החלף פתרון חסימה עם החסימה של תמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים 100 μl. לאט רוק הצינור על C ° O מסובבי / N ב 4.
- הסר את פתרון הנוגדן הראשוני ולשטוף עם PBSDT 5 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן להוסיף חסימת תמיסה המכילה נוגדנים משני ורוקו על הכתף ב RT עבור 2hr 100 ul.
- לשטוף 5 פעמים עם PBSDT במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על ידי נדנדה על הכתף.
- לכוון את הזחלים רוחבי בשקופית מיקרוסקופ ולהוסיף טיפה של תקשורת הרכבה. לכסות בזהירות אותם עם מכסה זכוכית ולאטום את מכסה הזכוכית עם לטש מסמר. עכשיו, שהוא מוכן למיקרוסקופיה confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיפול Mtz במשך 36 שעות (A36h, עומד לאבלציה) מגודל כבד 3.5 עד 5 DPF מופחת באופן דרמטי (איור 1). לאחר כישלון Mtz, נחשב כתחילת התחדשות כבד (R), fabp10a החזק: CFP-NTR וfabp10a: ביטוי dsRed הופיע בתוך 30 שעות (איור 1). רשת המרה intrahepatic, כפי שהוערך על ידי ביטוי של Alcam שנמצא בקרום של 22 BECs, תחילה התמוטט אך הוקם מחדש על 54 פוסט-סחף שעה (R54h) (איור 1 ג). נתונים אלה מצביעים על כך שהתחדשות כבד והתאוששות מהירה מתרחשות במודל הפגיעה בכבד שלנו.
איור 2 מראה כי hepatocytes התחדשות נגזרים מBECs. Tg (TP1: H2B-mCherry) קו s939 מבטא חלבון ניאון אדום גרעיני תחת שליטתו של רכיב המכיל אתרי קישור 12 RBP-Jĸ 23. respo Notch זהאלמנט nsive מופיע לנהוג ביטוי גנים באופן בלעדי בBECs בכבד 24; עם זאת, ייתכן שהוא מניע את ביטוי הגנים בLPCs כי האיתות של Notch קשור קשר הדוק לLPCs 25. לכן, קו מהונדס זה מאפשר זיהוי קל של BEC, וכנראה LPC, גרעינים. יתר על כן, היציבות הממושכת של מעקב שושלת H2B-mCherry היתרי חלבון היתוך לטווח קצר. רוב תאי H2B-mCherry + בכבד ההתחדשות בR0h הביע Hnf4α (איור 2 א), המתבטא בhepatocytes, אבל לא בBECs, בכבד השליטה. Hepatocytes, כפי שהוערך על ידי fabp10a: ביטוי CFP-NTR, בR48h עדיין נשמרים TP1: ביטוי H2B-mCherry (איור 2, חיצים). נתונים אלה מצביעים על המרת BEC לhepatocytes על אובדן hepatocyte חמור, אשר אושר עוד יותר על ידי שושלת קבועה התחקות 19.
איור 1. מודל פגיעה בכבד דג הזברה. () תכנית הממחישה את תקופות טיפול Mtz והתחדשות כבד. טיפול Mtz 36 שעות (ב ') מופחת במידה ניכר גודל כבד וfabp10a: CFP וfabp10a: הקרינה dsRed בR0h; עם זאת, CFP החזק וקרינת dsRed הופיעו בR30h. חצים מצביעים על הכבד (Li). צפיות (C) Confocal השלכה של כל הכבד immunostained עם נוגדנים נגד Alcam שכותרתו BECs. רשת המרה intrahepatic הייתה התמוטטה בR0h אבל במהירות הוקמה מחדש בR54h. אזורים מקווקו מתארים את הכבד. ברים סולם:. 100 (ב), 20 מיקרומטר (C) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
_upload / 52,785 / 52785fig2.jpg "/>
BECs 2. איור להצמיח hepatocytes על אובדן hepatocyte חמור () נופי הקרנת Confocal של הכבד מראים Hnf4α (ירוק) וTP1:. H2B mCherry-ביטוי (אדום) בR0h. (ב) תמונות חד-אופטיות Confocal סעיף מראים fabp10a: CFP-NTR (אפור) וTP1: H2B mCherry-ביטוי (אדום) בכבד. ביטוי mCherry התגלה על ידי immunostaining אנטי-mCherry. שים לב לביטוי mCherry החלש בגרעינים של CFP + hepatocytes (חיצים). mCherry + תאים חזקים הם BECs. ברים סולם:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חמור, אבל לא קל, אבלציה hepatocyte מעוררת התחדשות כבד מונע מרה. לכן, לאחר טיפול Mtz וכישלון, חשוב לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz, אשר ניתן להעריך על ידי הקרינה CFP מהותית מfabp10a: transgene CFP-NTR. מאז אחוז קטן של הזחלים שטופלו Mtz יציג הלא ablated (0-5%) או באופן חלקי ablated כבדים (10-20%), הוא חיוני כדי למיין את ורק לנתח את הזחלים עם כבד קטן מאוד, ש מעיד על אבלציה hepatocyte החמורה.
למרות בפרוטוקול שלנו, התייחסנו זחלי דג הזברה עם Mtz 3.5-5 DPF (תקופת טיפול 36 שעות), שלבים ומשך טיפול Mtz חלופיים הם גם אפשריים. לדוגמא, זחלים טופלו 5-6 DPF (תקופת טיפול 24 שעות) אבלציה hepatocyte החמורה גם הציגה, בדומה לתקופה הטיפול 36 שעות האמורה. שתי קבוצות נוספות שנוצרו באופן עצמאיfabp10a דומה: קווים מהונדסים NTR ודיווחו גם על התהליך של התחדשות כבד מונע מרה הבאה אבלציה hepatocyte הספציפי. בעוד קבוצה אחת טופלה זחלים עם Mtz 6-7 DPF 21, אחר עשה זאת 3.5-4.5 DPF, הגיע למסקנות דומות 20. מאז כל fabp10a: קו מהונדס NTR עשוי להפגין רמת ביטוי NTR שונה, המשך והמינון של טיפול Mtz צריך להיקבע בנפרד עבור כל אחד מהקו המהונדס משמש. זה גם עשוי להיות שימושי כדי ליצור קו מהונדס עם גרסה משופרת של גן NTR, שבהקדמה של שלוש מוטציות נקודה מובילה לעלייה בפעילות האנזימטית שלו 26. מוטציה זו NTR יגרום אירוע אבלציה מהר יותר מאשר פרא-הסוג NTR 26. זהו יתרון במיוחד כאשר קינטיקה NTR wild-type עלולה להגביל את האפשרות של אבלציה תא המלאה בשלב רצוי.
מאז מאות זחליםבו זמנית יכול לעבור אבלציה hepatocyte, מודל פציעה זה דג הזברה כבד יכול להיות מיושם על מסכי כימיים לזהות מולקולות קטנות שיכול לדכא או להגדיל את ההתחדשות כבד מונע מרה. לדוגמא, שימוש במודל זה, קבוצת שין בג'ורג'יה טק ביצעה מסך כימי ומצאה כמה אגוניסטים Wnt ויריבי Notch שאפשרו התחדשות כבד 20. אנחנו גם ביצענו מסך כימי בקנה מידה קטן וזיהינו מספר תרכובות שיכולות לדכא את ההתחדשות כבד (SK, TYC, JS, וDS, בהכנה).
דה מרקר ניתוחים בבני האדם הראו כי BECs יכולה לתרום לhepatocytes מחדש בכבד החולה 5,6. הקבוצה 'ד"ר ואנלס דיווחה לאחרונה כי אחוז גדול של parenchyma שבחמת כבד נסוג מופיע שייגזר מLPCs / BECs בבני אדם 27, רומז על החשיבות של התחדשות כבד מונעת-BEC ברגרסיה שחמת הכבד. בהתחשב בעובדה שBECs בעיקרלתרום לhepatocytes ההתחדשות במודל פגיעה בכבד דג הזברה שתואר כאן, מודל זה יהיה כלי רב ערך לקביעת המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס התחדשות כבד מונעת-BEC. הבנת מנגנונים כאלה תספק תובנות משמעותיות לאיך להגדיל את ההתחדשות כבד מולדת בחולים עם מחלות כבד חמורות. יתר על כן, בשילוב עם מסכי כימיים, מודל דג הזברה זה עשוי להיות שימושי בזיהוי תרופה פוטנציאלית שיכול להקל על התחדשות כבד מולדת בחולים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N.
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K.
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
