Abstract
肝臓は再生する素晴らしい能力を持っています。 hepatocyte-または胆管駆動の肝再生：肝細胞、肝臓の実質細胞は、次のいずれかの方法で再生することができます。胆管駆動の再生に、再生肝細胞は、胆管上皮細胞（BECS）から誘導され、一方、肝細胞主導の肝再生においては、再生肝細胞は、既存の肝細胞に由来します。肝細胞主導の肝臓再生のために、大幅に肝再生の現在の理解に貢献した優れたげっ歯類モデルがあります。しかし、そのようなげっ歯類モデルは胆汁駆動型肝再生のために存在しません。私たちは最近、BECSが広く重度の肝細胞の喪失時の肝細胞を生じさせているゼブラフィッシュの肝障害モデルについて報告しました。このモデルでは、肝細胞を特異的薬理遺伝学的手段によって切除されています。ここでは、肝細胞を切除するとBEC主導の肝再生過程を分析するために、詳細に方法を提示します。この肝細胞特異的切除モデルは、さらに胆汁ドリブン肝再生の基礎となる分子及び細胞メカニズムを発見するために使用することができます。さらに、これらの方法は、肝再生を増強または抑制する小分子を同定するために、化学的スクリーニングに適用することができます。
Introduction
肝臓は非常に再生器官です。肝臓再生中に、肝細胞の再生、肝臓の実質細胞は、既存の肝細胞（肝細胞ドリブン肝再生）またはBECS（胆汁ドリブン肝再生）1,2から誘導されます。肝臓損傷は、通常、既存の肝細胞の増殖を誘発します。肝細胞増殖が損なわれたときただし、BECS 2-4を肝細胞に寄与することができます。肝再生のこれらの2つのモードは、臨床的に重要です。 （理由肝腫瘍やライブ肝ドナーの例えば ）ヒト肝臓の一部を外科的に除去すると、残りの肝臓における肝細胞は、失われた肝臓塊を回復するために増殖します。 BECSまたは肝臓前駆細胞（たLPC）は、肝細胞の再生5,6に寄与するように見えるように対照的に、重篤な肝疾患を有する患者において、肝細胞増殖が大きく損なわれる。げっ歯類2/3部分肝切除モデル、中肝細胞は有意に肝細胞主導の肝再生7,8の現在の理解に貢献してきました、失われた肝臓塊を回復するために増殖します。しかし、再生肝細胞は、主にBECSに由来する有効なげっ歯類モデルはありません。いくつかのげっ歯類の肝臓毒素モデルは胆道駆動型肝再生2-4の同定をもたらしたが、マウスにおける最近の系譜トレースの研究では、これらのモデル9,10に肝細胞の再生にBECSの最小の寄与を示しています。部分肝切除11-13とアセトアミノフェン誘発性肝障害14,15を含むげっ歯類の肝障害モデルのいくつかは、ゼブラフィッシュに適用され、肝臓再生に関与する新規遺伝子または経路の同定につながってきました。しかし、肝細胞主導型ではなく、BECドリブン、肝再生は、これらのゼブラフィッシュの肝障害モデルで発生します。したがって、新規な肝臓損傷モデルとは、BECSは広くregeneratに寄与します肝細胞をるがBEC主導の肝再生のよりよい理解のために必要とされます。
ここで説明肝切除モデルの全体的な目標は、（1）BECSは広範囲の肝細胞の再生に寄与し、そして（2）BECドリブン肝再生の基礎となる分子及び細胞メカニズムを解明した肝損傷モデルを生成することです。私たちは、損傷の重症度は、肝臓再生のモードを決定するという仮説を立てました。このように、我々は、胆管駆動の肝再生が厳しい肝細胞傷害の際に開始するだろうと予測しました。この仮説を検証するため、我々はトランスジェニック系統を生成することにより、ゼブラフィッシュの肝臓損傷モデルを開発し、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）S931は 、ことは非常に肝細胞特異的fabp10a下シアン蛍光タンパク質（CFP）と融合した細菌ニトロレダクターゼ（NTR）を発現しますプロモーター。 NTRは、非毒性のプロドラッグを変換するので、メトロニダゾール（MTZ）は、細胞傷害性薬物に、それだけで意図アブレーションNTR-この場合、16-18肝細胞発現細胞。 MTZ治療の持続時間を操作することによって、肝切除の程度を制御することができます。このモデルを使用して、我々は最近、重度の肝細胞の喪失時に、BECSは広く、さらに他の二つの独立した研究20,21によって確認された肝細胞19を 、再生を生じさせることを報告しました。したがって、上記の齧歯類及びゼブラフィッシュ肝臓損傷モデルと比較して、我々の肝切除モデルはBEC駆動型肝再生を研究するため、より有利です。
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ肝切除モデルを用いて、肝再生の実験を行うための手順を記載しています。このモデルは、胆汁駆動型肝再生のメカニズムを決定するための、および化学スクリーンが抑制または肝再生を増強することができる小分子を同定するために適切です。
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Protocol
ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って上昇して飼育しました。実験は、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
胚/幼虫の調製
- 時限交配を行うために、成人男性と女性のTg（fabp10a：CFP-NTR）を設定S931半接合またはホモ接合性魚類のO / Nを、それらの間の仕切りを配置します。相手が所望される場合は、次の朝、この分周器を取り外します。細かいプラスチックメッシュストレーナーを用いて水を負担することによって胚を収集します。
- 逆さまにストレーナを回して、スクイーズボトルから分配卵の水の細い流れにメッシュ表面をすすぎます。卵、水25mlで100ミリメートルペトリ皿に100胚を移します。ペトリ皿当たりない100以上の胚を維持し、28℃でそれらを発生させます。
- 色素沈着を抑制するために、10時間後に受精（HPF）の前にペトリ皿にフェニルチオ尿素（PTU）を追加し、電子メールを上げます80 HPFまでmbryos /幼虫。 PTUの最終濃度は0.2 mMです。注意：PTUは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
- ペトリ皿の中に0.016％の最終濃度で、3-アミノ安息香酸エチルエステル（トリカイン）を加えることにより、幼虫を麻酔。そして、落射蛍光顕微鏡、ソートCFP陽性幼虫を使用。同様の肝臓サイズで幼虫を使用して、小さいまたは大きい肝臓のものを捨てます。
注：ヘミ接合性およびホモ接合性幼虫の間に肝切除の程度の差がないため、任意のCFP陽性幼虫は関係なく、強度、使用することができます。注意：トリカインは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。 - トリカインを含む卵の水を除去し、0.2 mMのPTUを補充した卵の水を加えます。 28℃での胚/幼虫を保管してください。
2. MTZトリートメント
- 1にMTZ粉末0.171グラムを溶解することにより、新鮮な10mMのMTZ溶液を調製します00ミリリットルの卵の水は、0.2％DMSOおよび0.2 mMのPTUを補いました。完全にMTZを溶解するために、20〜30分間急速に撹拌しながら室温で溶液を混合。 MTZを製造する場合MTZを可溶化するために役立つと幼虫にMTZの浸透を高めるために、DMSOを追加します。注意：長時間の暴露またはMTZ濃度の増加は、毒性です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
- 二つの異なるの100mmペトリ皿またはマルチウェルプレートに幼虫の所望の数を転送することにより、対照群と実験群に幼虫を区切り。実験群では、10 mMのMTZ溶液中の幼虫を保ちます。対照群のために、0.2％のDMSOを含む卵水に保管してください。
- MTZの光不活性化を防止するために、プレート又はアルミニウム箔でMTZ溶液を含むペトリ皿を覆い、そして28℃でインキュベートします。 MTZ処理の時間は、幼虫期およびトランスジェニックラインに依存しています。
- で同様の重度の肝切除を観察するために、
胆道主導の肝再生の3分析
- アブレーション期間の終わりに、プレートからMTZ溶液を除去。卵の水25mlを添加することにより、MTZ処理した幼虫を洗ってください。卵の水を廃棄する前に幼虫を洗浄し、プレートを2〜3回渦巻きます。 3回繰り返し、その後、もう一度卵水に幼虫を浸します。 MTZ処理した幼虫における心臓浮腫と幼虫の死を回避するために、幼虫を固定化するために0.008％の最終濃度で、トリカインの低濃度を追加します。
- 肝臓分析のために、CFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下でMTZ処置幼虫の肝臓サイズを調べます。肝臓の相対サイズに基づいて肝切除レベルを評価：大（非アブレーション; 0〜10％の幼虫）、中（部分的に切除さを、10-20％）、及び非常に小さな（完全に切除された; 80〜90％）。
- 非アブレーションされたまたは部分的に切除された肝臓と幼虫を削除します。唯一の重度の肝切除の指標である小さな肝臓で幼虫を保ちます。再生0時間の時点（R0H）で肝臓分析のために、MTZの洗い出しとCFPのソート後の幼虫を収穫。それ以外の場合は、収穫の準備ができるまで、0.2 mMのPTUを補充した卵水にソートされた幼虫を保ちます。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに回収した幼虫を転送し、PEM緩衝液中の3％のホルムアルデヒドの固定液で卵の水を交換してください。回転子O上/ Nチューブを4℃でインキュベートします。
- PBSDT 1mlの固定液を交換し、5分間ローテーターの幼虫を含むチューブを回転させます。
- 手動で解剖顕微鏡下で卵黄と胸のフィンを取り外し、ピンセットをPBSDTを含有し、使用して100ミリメートルのペトリ皿に固定された幼虫を転送します。 1.5mlチューブにアップTP 20解剖幼虫を転送します。 <LI>ブロッキング溶液1mlのPBSDT液を交換し、2時間室温で回転体にチューブを揺すります。
- 一次抗体を含むブロッキング溶液100μlのブロッキング溶液を交換してください。ゆっくりと回転体のO / Nで4°Cのチューブを揺すります。
- 一次抗体溶液を除去し、10分間PBSDTで毎回5回洗浄します。その後、二次抗体を含む溶液を阻止する100μlのを追加し、2時間室温で回転装置上でそれを揺すります。
- 回転子に揺動することにより、室温で10分間PBSDTで毎回5回洗浄します。
- 顕微鏡スライド上に横方向に幼虫を向けると装着メディアのドロップを追加します。慎重にカバーガラスでそれらをカバーし、ネイルポリッシャーでカバーガラスをシール。今は、共焦点顕微鏡のための準備ができています。
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Representative Results
3.5へのDPF劇的に低減肝臓サイズ（ 図1B）から36時間、MTZ処理（A36h、Aは、アブレーションの略）。 MTZのウォッシュアウト後、肝再生（R）の始まりと考え、強いfabp10a：CFP-NTRとfabp10a：DsRedの発現は、30時間（ 図1B）内に再び現れました。肝内胆管ネットワークBECS 22の膜中に存在するALCAMの発現によって評価されるように、最初に崩壊したが54時間後にウォッシュアウト（R54h）（ 図1C）で再確立されました。これらのデータは、肝臓の再生及び回復が急速に我々の肝傷害モデルで起こることを示しています。
図2は、再生肝細胞がBECSから派生していることを示しています。 Tgが（Tp1の：H2B-mCherryを）S939ラインは12 RBP-Jĸ結合部位23を含む要素の制御下にある核赤色蛍光タンパク質を発現します。このノッチRESPOnsive要素は、肝臓24にBECSでのみ遺伝子発現を駆動するために表示されます。しかしながら、それは、Notchシグナリングが密接たLPC 25に関連しているので、それがたLPCにおける遺伝子発現を駆動することが可能です。したがって、このトランスジェニック系統は、BECを容易に検出を可能にし、おそらくLPC、核。また、H2B-mCherryを融合タンパク質の拡張安定性は短期的系譜トレースを可能にします。 R0Hで再生肝のほとんどのH2B-mCherryを+細胞が肝細胞ではなく、BECSで、コントロール肝臓で発現しているHNF4α（ 図2A）を 、表明しました。肝細胞は、fabp10aによって評価されるように：H2B-mCherryを発現（ 図2B、矢印）：CFP-NTR発現、R48hではまだTp1とを保持していました。これらのデータは、永続的な系統が19をトレースすることで確認された重篤な肝細胞の喪失時の肝細胞へのBEC変換を示しています。
図1.ゼブラフィッシュ肝臓損傷モデルは、（A）スキームMTZ治療と肝再生の期間を示します。 （B）36時間MTZ処理が大幅に減少、肝臓のサイズとfabp10a：CFPとfabp10a：R0HでのDsRed蛍光;しかし、強力なCFP及びDsRedの蛍光をR30hに再び現れました。矢印は、肝臓（Li）とを指します。 BECSを標識抗ALCAM抗体で免疫染色肝臓全体の（C）共焦点投影図。肝内胆管ネットワークはR0Hで崩壊したが、急速にR54hで再確立されました。点線の領域は、肝臓の概要を説明します。スケールバー：100（B）、20（C）μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図2. BECSは、重度の肝細胞の喪失時の肝細胞を生じさせる HNF4α（緑）、Tp1を示す肝臓の（A）共焦点の投影ビュー：R0HでH2B-mCherryを（赤）の発現を。 （B）fabp10aを示す共焦点単一の光学部の画像：（グレー）CFP-NTRとTp1の肝臓でのH2B-mCherryを（赤）の発現。 mCherryを発現抗mCherryを免疫染色によって明らかにしました。 CFP +肝細胞（矢印）の核に弱いmCherryを発現に注意してください。強いmCherryを+細胞はBECSです。スケールバー：20μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
重度、軽度ではない、肝切除は、胆管駆動の肝臓の再生を誘発します。 CFP-NTR導入遺伝子：したがって、MTZの治療およびウォッシュアウトの後、それはfabp10aから固有のCFPの蛍光によって評価することができるMTZ処理した幼虫の肝臓サイズを調べることが重要です。 MTZ処理した幼虫の小さな割合は、非アブレーション表示（0-5％）または（10〜20％）の肝臓の一部アブレーションされますので、整理し、非常に小さな肝臓で幼虫を分析することが不可欠であり、その重度の肝切除の指標です。
我々のプロトコルでは、我々は5 DPF（36時間の処理期間）に3.5からMTZとゼブラフィッシュの幼虫を処理しているが、代替のステージとMTZ処理の時間も可能です。例えば、6 DPF（24時間の処理期間）5から処理された幼虫は、前述の36時間の処理期間に類似重症肝切除を示しました。独立して生成された二つの追加のグループ類似fabp10a：NTRトランスジェニック系統とは、肝細胞特異的切除次胆汁主導の肝再生の過程について報告しました。 1グループは21 DPF 6から7 MTZで幼虫を処理したのに対し、他は同様の結論20に達し、3.5から4.5 DPFにそのようにしました。各fabp10a以来：NTRトランスジェニックラインはNTR発現の異なるレベルを示すことができる、MTZ処理の時間および投与量は、使用するトランスジェニックラインのそれぞれに対して個別に決定されるべきです。それはまた、3つの点突然変異の導入は、その酵素活性26の増加をもたらすでNTR遺伝子の拡張版とのトランスジェニック系統を生成するために有用であろう。この変異体NTRは、野生型NTR 26よりも速いアブレーションイベントになります。野生型のNTR速度が所望の段階で完全な細胞除去の可能性を制限することができる場合に特に有利です。
幼虫の数百ので、同時に肝切除を受けることができる、このゼブラフィッシュ肝臓損傷モデルは、胆汁駆動型肝再生を抑制または増強することができる小分子を同定するために、化学的スクリーニングに適用することができます。例えば、このモデルを使用して、ジョージア工科大学の新基は、化学画面を行い、肝臓の再生を促進し 、いくつかの20のWntアゴニストおよびNotchのアンタゴニストを発見しました。また、小規模の化学画面を行い、（準備中、SK、TYC、JS、およびDS）肝再生を抑制することができるいくつかの化合物を同定しました。
マーカーはBECSが罹患肝臓5,6で再生肝細胞に寄与することができることを示唆したヒトでは分析しています。博士Wanless 'グループは最近、退行性肝硬変における実質の大きな割合が、肝硬変の回帰でBEC主導の肝臓再生の重要性を示唆している、ヒト27でたLPC / BECSに由来すると思われることを報告しました。という事実を考えるとBECS主ここで説明したゼブラフィッシュの肝障害モデルにおける肝細胞の再生に寄与し、このモデルはBEC駆動型肝再生の基礎となる細胞および分子メカニズムを決定するための貴重なツールとなるでしょう。そのようなメカニズムを理解することは、重篤な肝疾患患者における先天性肝再生を増強する方法に重要な洞察を提供します。さらに、化学的スクリーンとの組み合わせで、このゼブラフィッシュモデルは、ヒト患者における先天性肝再生を促進することができる潜在的な薬物を同定するのに有用であり得ます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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