Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Migration, Expansion und das Überleben von Stammzellen und Vorläuferzellen im Hornhautepithel zu lokalisieren und zu verfolgen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus dem Bereich der Zellbiologie des Hornhautepithels bezüglich Homöostase, Gewebereparatur, Alterung und Pathologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie leicht etabliert werden kann und eine nichtinvasive, klonale Herkunftsverfolgung von Zellen ermöglicht.

Wählen Sie zunächst eine transgene Mauslinie von Cree mit einem induzierbaren, gewebespezifischen Promotor zur Markierung der limbalen und kornealen epithelialen Vorläuferzellen und Stammzellen aus. Verwendet wird die tamoxifeninduzierbare K14-Cre-ERT-Linie. Wählen Sie anschließend je nach Forschungsfrage und der verfügbaren Cree-Linie die geeignete Brainbow-Kassette aus.

In diesem Fall wird die Brainbow 2.1-Linie verwendet. Kreuzen Sie den homozygoten R 26 R-confetti-Stamm mit dem homozygoten K 14-Cre-ERT-Stamm, um Mäuse mit vierfarbigen, K 14-positiven Zellen zu erzeugen. Um die Rekombination in den transgenen Mäusen auszulösen, wiegen Sie zunächst 80 Milligramm Tamoxifen ab und lösen es durch Vortexen in einem Milliliter Maisöl auf.

Stellen Sie die Lösung in ein schüttelndes Wasserbad, das bei 65 Grad Celsius gehalten wird, bis sie vollständig gelöst ist, und lassen Sie sie bis zur nächsten Anwendung im Bad. Tragen Sie bei einer acht Wochen alten heterozygoten Brainbow 2.1 Cree ERT Maus vorsichtig 100 Mikroliter der Tamoxifen-Lösung auf jede okulare Oberfläche der Maus auf, nachdem Sie die Tiefe der Anästhesie mit dem Zehenquetschtest überprüft haben. Die direkte Applikation von Tamoxifen führt zu einer hohen Effizienz der Cree-Induktion. Bewahren Sie restliche Tamoxifen-Lösung lichtgeschützt bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche lang auf.

Wärmen Sie die Lösung vor der Anwendung, die an drei aufeinanderfolgenden Tagen für jede Maus wiederholt wird. Lösen Sie zunächst ein Gramm Tamoxifen-Pulver in fünf Millilitern sterilem Dimethylsulfoxid auf. Um eine 200 Milligramm pro Milliliter-Lösung herzustellen, geben Sie die Lösung in ein schwingendes Wasserbad und halten Sie sie bei 65 Grad Celsius, bis sie klar wird; lassen Sie sie bis zur Verwendung im Wasserbad.

Dann das Tier anästhesieren und die Tiefe der Anästhesie mittels Zehenquetschtest überprüfen, Augensalbe auf das unbehandelte Auge der Maus auftragen, um es während des Eingriffs vor Austrocknung zu schützen, und ausreichende Analgetika verabreichen. Anschließend 200 Mikroliter der Tamoxifen-Lösung in eine Spritze ohne angebrachte Nadel aufziehen und die Lösung topisch auf die gesamte Hornhaut des Auges auftragen. Die Flüssigkeit erstarrt bei Raumtemperatur auf dem Gewebe.

Beobachten Sie die Maus, bis sie in Sternumlage verharrt, und geben Sie sie erst dann zu anderen Tieren zurück, wenn sie vollständig bei Bewusstsein ist. Nach der Tötung der Mäuse zu den geeigneten Zeitpunkten nach der Induktion erfolgt eine Augenverletzung, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Entfernen Sie das Auge, indem Sie zuerst das Augenlid andrücken, um den Augapfel aus der Augenhöhle hervortreten zu lassen.

Führen Sie eine gebogene Pinzette hinter den Augapfel ein, um den Sehnerv zu halten, und ziehen Sie den Augapfel nach oben, um ihn zu lösen. Legen Sie jeden Augapfel in eine 60-Millimeter-Schale, die PBS enthält. Stellen Sie die Schale mit dem Auge unter ein chirurgisches Stereomikroskop.

Stellen Sie sicher, dass Sie die grundlegende Struktur des Auges erkennen, darunter die Hornhaut, die Limbusregion und den Sehnerv. Entfernen Sie den Sehnerv, die Muskulatur und das Bindegewebe um das Auge herum. Halten Sie das Auge am hinteren Teil fest, wobei die Hornhaut nach unten zeigt, und führen Sie mit einer Feder-Schere einen Schnitt in die Sklera an der Rückseite des Augapfels durch.

Vergrößern Sie den Schnitt, damit die Linse herausspringen kann, und entfernen Sie die Iris mit einer Pinzette. Als Nächstes führen Sie vier bis fünf radiale Einschnitte aus, indem Sie von der Mitte nach außen schneiden, um die Hornhaut zu glätten, und entfernen anschließend mit einem dünnen, flachen Spatel eventuell verbliebene Teile der Iris. Schneiden Sie abschließend das überschüssige periphere Gewebe um den Limbus herum ab, um die Hornhaut zu fixieren.

Überführen Sie das dissezierte Gewebe in eine 12-Loch-Platte und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Waschen Sie das Gewebe anschließend kurz in PBS, um die Zellkerne anzufärben. Inkubieren Sie die Hornhaut 10 Minuten lang in einer DPI-Lösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter, gefolgt von einem kurzen Waschschritt in PBS.

Als Nächstes wird die Hornhaut mit der epitelialen Seite nach oben auf einen Objektträger gelegt. Anschließend gibt man einen Tropfen Einbettmedium auf die Hornhaut und bedeckt sie mit einem Deckglas. Man lässt die Präparate über Nacht bei Raumtemperatur trocknen und lagert sie bei vier Grad Celsius.

Verwenden Sie für die Hornhautbildgebung ein spektrales konfokales System, das die Trennung der Emissionen von R-F-P-Y-F-P-G-F-P und CFP ermöglicht. Stellen Sie zunächst die Fluoreszenz-, Anregungs- und Emissionswellenlängen abhängig von den fluoreszierenden Proteinen des Gehirns ein. Bo-Kassette, wobei darauf zu achten ist, eine Kreuzanregung oder Überlappung der Emissionssignale zu vermeiden.

Als Nächstes erwerben Sie gekachelte Bilder, um die gesamte Hornhaut in hoher Auflösung zu visualisieren. Erstellen Sie hierzu ein Array aus 12 mal 12 Bildern in allen vier fluoreszierenden Kanälen. Schließlich fusionieren Sie die Bilder, um eine zusammengesetzte Abstammungslinie zu erzeugen.

Verfolgungsexperimente unter Verwendung von R26R-confetti-Mäusen wurden durchgeführt, um das Schicksal limbalen und des Hornhaut-Epithel-Progenitorzellen zu verfolgen. Unter stationären Bedingungen wurden, wie erwartet, kleine Zellhaufen fluoreszierender Zellen 10 Tage nach der Induktion beobachtet. Nach vier Monaten entwickelten sich Streifen von der Limbus zur Mitte der Hornhaut, was darauf hindeutet, dass Zellen von der Limbus migrieren, um die Hornhaut nach einer Hornhautverletzung zu regenerieren.

Die Migration von der Limbusregion setzte rasch ein, wobei innerhalb von sieben Tagen lange, dicke limbale Streifen entstanden. Dieses Modell ist wertvoll, um korneale Stamm- und Vorläuferzellen unter verschiedenen Bedingungen zu verfolgen und zu untersuchen. Es ermöglicht zukünftig die Untersuchung der klonalen Zellvermehrung, des Überlebens und der Migration im Gleichgewichtszustand sowie unter Stressbedingungen wie Verletzungen, chemischen Verbrennungen, Mutationen und weiteren Einflüssen.

Dieses Modell kann auch verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der normalen und pathologischen Hornhautregeneration zugrunde liegen. Diese Technik kann zu unserem Verständnis verschiedener pathologischer Zustände wie Hornhautdystrophien, Verbrennungen und Hornhautverletzungen beitragen und darüber hinaus zur Bewertung der Wirkung unterschiedlicher Therapien auf die Hornhautregeneration, Zellvermehrung und Zellmigration.