Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Migration, Expansion und das Überleben von Stammzellen und Vorläuferzellen im Hornhautepithel zu lokalisieren und zu verfolgen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Hornhautepithelzellbiologie in Bezug auf Homöostase, Gewebereparatur, Alterung und Pathologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht zu etablieren ist und eine nicht-invasive Abstammungsverfolgung von Zellen auf klonale Weise ermöglicht.

Zu Beginn wählen Sie zunächst einen transgenen Cree-Mausstamm mit einem induzierbaren gewebespezifischen Promotor aus, um die limbalen und hornhautepithelialen Vorläuferzellen und Stammzellen zu markieren. Zum Einsatz kommt die Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT Leitung. Wählen Sie als nächstes die passende brainbow-Kassette aus, abhängig von der Forschungsfrage und der verfügbaren Cree-Linie.

In diesem Fall kommt die Brainbow 2.1 Leitung zum Einsatz. Kreuzung des homozygoten Konfettistamms R 26 R mit dem homozygoten K 14 Cree ERT-Stamm, um Mäuse mit vier farbigen K 14-positiven Zellen zu erzeugen Um die Rekombination in den transgenen Mäusen zu induzieren. Wiegen Sie zuerst 80 Milligramm Tamoxifen und lösen Sie es in einem Milliliter Maisöl durch Vortexen auf.

Geben Sie die Lösung in ein Schüttelwasserbad, das bei 65 Grad Celsius gehalten wird, bis sie sich vollständig aufgelöst hat, und lassen Sie sie bis zur nächsten Betäubung im Bad. Eine acht Wochen alte Brainbow 2.1 Cree ERT heterozygote Maus und überprüfen Sie die Narkosetiefe mit dem Zehenkneifen sorgfältig, tragen Sie 100 Mikroliter der Tamoxifen-Lösung auf jede Augenoberfläche der Maus auf. Die direkte Anwendung von Tamoxifen führt zu einer hohen Effizienz der Cree-Induktion: Lagern Sie alle verbleibenden Tamoxifen-Lösungen bis zu einer Woche vor Licht geschützt bei vier Grad Celsius.

Erwärmen Sie die Lösung vor der Anwendung, die an drei aufeinanderfolgenden Tagen für jede Maus wiederholt wird. Lösen Sie zunächst ein Gramm Tamoxifen-Pulver in fünf Millilitern sterilem Dimethylsulfoxid auf. Um eine Lösung mit 200 Milligramm pro Milliliter herzustellen, legen Sie die Lösung in ein Schüttelwasserbad, halten Sie ihre 65 Grad Celsius, bis sie klar wird, und lassen Sie sie bis zum Gebrauch im Bad.

Betäuben Sie dann die Maus und prüfen Sie die Narkosetiefe mit einer Zehenklemme, tragen Sie Augensalbe auf das unbehandelte Auge der Maus auf, um sie während des Eingriffs vor Austrocknung zu schützen, und verabreichen Sie geeignete Analgetika. Ziehen Sie anschließend 200 Mikroliter der Tamoxifen-Lösung in eine Spritze ohne Nadel und tragen Sie sie topisch auf die gesamte Hornhaut des Auges auf. Die Flüssigkeit verfestigt sich bei Raumtemperatur auf dem Gewebe.

Kümmern Sie sich um die Maus, bis sie sternal liegend bleibt, und bringen Sie sie erst dann in die Gesellschaft anderer zurück, wenn sie bei vollem Bewusstsein ist. Nach dem Töten von Mäusen zu geeigneten Zeitpunkten nach der Induktion kam es zu einer Augenverletzung, wie im Textprotokoll beschrieben. Keime das Auge, indem du zuerst auf das Augenlid drückst, um den Augapfel aus der Augenhöhle zu heben.

Schieben Sie eine gebogene Pinzette hinter den Augapfel, um den Sehnerv zu halten, und ziehen Sie den Augapfel nach oben, um ihn zu lösen. Lege jeden Augapfel in eine 60-Millimeter-Schale, die PBS enthält. Legen Sie die Augenplatte unter ein chirurgisches Stereomikroskop.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Grundstruktur des Auges, der Hornhaut, des Limbus und des Sehnervs erkennen. Entferne den Sehnerv, die Muskeln und das Bindegewebe um das Auge. Halten Sie das Auge mit der Hornhaut nach unten an den hinteren Teil und machen Sie mit einer Federschere einen Schnitt in die Sklera an der Rückseite des Augapfels.

Vergrößern Sie den Schnitt, damit die Linse herausspringen kann, und entfernen Sie die Iris mit einer Pinzette. Machen Sie als Nächstes vier bis fünf radiale Schnitte, indem Sie von der Mitte zur Peripherie hin schneiden, um die Hornhaut abzuflachen, und entfernen Sie dann alle verbleibenden Teile der Iris mit einem dünnen, flachen Spatel. Schneiden Sie schließlich das überschüssige periphere Gewebe um den Limbus herum, um die Hornhaut zu fixieren.

Übertragen Sie das präparierte Gewebe in eine 12-Well-Schale und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in 4%para Formaldehyd. Waschen Sie dann das Gewebe kurz in PBS, um die Zellkerne zu färben. Inkubieren Sie die Hornhaut 10 Minuten lang in zwei Mikrogramm pro Milliliter DPI-Lösung, gefolgt von einer kurzen Wäsche in PBS.

Legen Sie dann die Hornhaut mit der Epithelseite nach oben auf einen Objektträger. Legen Sie dann einen Tropfen Eindeckmittel auf die Hornhaut und decken Sie diese mit einem Deckglas ab. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Verwenden Sie für die Hornhautbildgebung ein spektralkonfokales System, das die Trennung von R-F-P-Y-F-P-G-F-P- und CFP-Emissionen ermöglicht. Stellen Sie zunächst die Fluoreszenz-, Anregungs- und Emissionswellenlängen in Abhängigkeit von den fluoreszierenden Proteinen des Gehirns ein. Bo-Kassette, wobei darauf geachtet wird, dass eine Kreuzanregung oder Überlappung der Emissionssignale vermieden wird.

Nehmen Sie als Nächstes gekachelte Bilder auf, um die gesamte Hornhaut in hoher Auflösung zu visualisieren. Hier erhalten Sie ein Array von 12 x 12 Bildern in allen vier Fluoreszenzkanälen. Führen Sie abschließend die Bilder zusammen, um eine zusammengesetzte Abstammung zu erstellen.

Es wurden Rückverfolgungsexperimente mit R26 R-Konfettimäusen durchgeführt, um das Schicksal von limbalen und hornhautepithelialen Vorläuferzellen zu verfolgen. Unter Steady-State-Bedingungen wurden erwartungsgemäß 10 Tage nach der Induktion kleine Cluster von Fluoreszenzzellen beobachtet. Nach vier Monaten bildeten sich Schlieren vom Limbus zur Mitte der Hornhaut, was darauf hindeutet, dass Zellen aus dem Limbus wandern, um die Hornhaut nach einer Hornhautverletzung zu regenerieren.

Die Migration aus dem Limbus verlief schnell, wobei sich innerhalb von sieben Tagen lange, dicke Limbusstreifen entwickelten. Dieses Modell ist wertvoll für die Verfolgung und Untersuchung von Hornhautstamm- und Vorläuferzellen unter verschiedenen Bedingungen. Es wird in Zukunft die Untersuchung der Expansion, des Überlebens und der Migration klonaler Zellen im stationären Zustand und unter Stressbedingungen wie Verwundung, Mutation von chemischen Verbrennungen und mehr ermöglichen.

Dieses Modell kann auch verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die der normalen und pathologischen Hornhautregeneration zugrunde liegen. Diese Technik kann zu unserem Verständnis verschiedener pathologischer Zustände wie Hornhautdystrophien, Verbrennungen und Hornhauttraumata beitragen und zusätzlich zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf die Hornhautregeneration, Zellexpansion und -migration beitragen.