Abstract
البلعمة هي عملية أساسية من خلالها الخلايا المناعية الفطرية تبتلع البكتيريا والخلايا أفكارك أو الجسيمات الأجنبية الأخرى من أجل قتل أو تحييد المواد المبتلعة، أو تقديمه كمستضدات والشروع في الاستجابات المناعية التكيفية. الرقم الهيدروجيني للphagosomes معلمة الحرجة التي تنظم الانشطار أو الاندماج مع endomembranes وتفعيل الانزيمات المحللة للبروتين، والأحداث التي تسمح للفجوة أكلة إلى أن تنضج في عضية الهادمة. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة النبات من H + لإنتاج مستويات عالية من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، التي تعتبر ضرورية لقتل كفاءة ويشير إلى الأنسجة المضيفة الأخرى. العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا البلعمية تخريب قتل عن طريق الحد من phagosomal تحمض، وتسليط الضوء على أهمية درجة الحموضة في يبلوع علم الأحياء. نحن هنا تصف طريقة ratiometric لقياس درجة الحموضة phagosomal في العدلات باستخدام ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -labeled زيموزان كما أكلة TARGخدمات الاختبارات التربوية، والتصوير الخلية الحية. ويستند هذا الفحص على خصائص مضان FITC، التي تطفئ بواسطة الرقم الهيدروجيني الحمضية عندما متحمس في 490 نانومتر ولكن ليس عندما متحمس في 440 نانومتر، مما يتيح التقدير الكمي لنسبة تعتمد على درجة الحموضة، بدلا من مضان المطلق، من صبغة واحدة. وتقدم أيضا بروتوكول مفصلة لأداء الموقع صبغ المعايرة وتحويل النسبة إلى قيم الرقم الهيدروجيني حقيقية في. تعتبر الطرق ratiometric واحد صبغ عموما متفوقة على الطول الموجي واحد أو بروتوكولات الزائفة ratiometric ثنائي الصبغة، لأنها أقل حساسية للاضطرابات مثل تبيض، والتركيز التغييرات، والاختلافات الليزر، ووضع العلامات متفاوتا، التي تشوه الإشارة المقاسة. هذه الطريقة يمكن تعديلها بسهولة لقياس درجة الحموضة في غيرها من أنواع الخلايا البلعمية، وزيموزان يمكن الاستعاضة عن أي الجسيمات التي تحتوي على الأمينات الأخرى، من حبات الخاملة إلى الكائنات الحية المجهرية. وأخيرا، وهذه الطريقة يمكن تكييفها للاستفادة من تحقيقات الفلورسنت أخرى حساسة لدرجة الحموضة نطاقات مختلفة أو phagosom الآخرأنشطة القاعدة ويجعل من بروتوكول المعمم للتصوير وظيفي من phagosomes.
Protocol
بيان الأخلاق: تم تنفيذ جميع التلاعب الحيوانية بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية للجنة البحوث الحيوانية من جامعة جنيف.
1. إعداد الأهداف أكلة
- إضافة 20 ملغ من زيموزان المجففة إلى 10 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). دوامة والحرارة في حمام الماء المغلي لمدة 10 دقيقة. بارد وأجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف، resuspend في 1 مل PBS ويصوتن لمدة 10 دقيقة في sonicator حمام الماء. نقل 500 ميكرولتر لاثنين من 1.5 مل أنابيب. أجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 5 دقائق.
- تكرار غسل مع 500 ميكرولتر PBS. يمكن aliquoted في زيموزان المغلي، المجمدة وتخزينها في -20 ° C.
- غسل زيموزان مرتين في 500 ميكرولتر الطازجة 0.1 M نا 2 CO 3، ودرجة الحموضة 9.3 على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2).
- resuspend في 490 ميكرولتر بعد غسل النهائي. إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل المنحل FITC في ثنائي ميثيل sulfoxidه ([دمس])، دوامة، مع تغطية احباط، واحتضان مع الانفعالات لمدة 4 ساعة على RT.
- لإزالة الصبغة غير منضم، وغسل النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2)، لأول مرة مع 0.5 مل DMSO + 150 ميكرولتر PBS، ثم 0.5 مل DMSO + 300 ميكرولتر PBS، ثم 0.5 مل DMSO + 450 ميكرولتر PBS، ثم PBS وحده.
- عد زيموزان باستخدام haemocytometer. إضافة 1 ميكرولتر من زيموزان إلى 500 ميكرولتر PBS، الدوامة، ثم إضافة 10 ميكرولتر إلى حافة الغرفة haemocytometer، حيث يلتقي ساترة وضعت على الشبكة المركزية. تحميل haemocytometer على المجهر مشرق الميدان مجهزة الهدف 20X.
- التركيز على الزاوية العلوية اليسرى يحتوي على 16 الساحات والاعتماد جميع الجزيئات زيموزان في هذا المجال باستخدام عداد اليد رصيده. كرر مع الزاوية السفلى اليمنى. حساب تركيز زيموزان باستخدام المعادلة التالية: تركيز زيموزان = عدد / 2 × 500 × 10 4 زيموزان / مل. يمكن aliquoted زيموزان المسمى مثلجة وتخزينها في -20 ° C.
- يستطهي واي زيموزان المسمىث أرنب الأجسام المضادة لمكافحة زيموزان في التخفيف 1: 100. دوامة واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 ° C حمام الماء. يغسل مع 500 ميكرولتر PBS على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2).
ملاحظة: يوصى صوتنة للغاية، خصوصا بعد طهاية، حيث يميل زيموزان لتشكيل كتل التي يمكن أن تجعل تحليل أكثر صعوبة في وقت لاحق. طهاية مع 65٪ ت / ت الفئران أو المصل البشري يمكن أن تستخدم كبديل. - عد زيموزان باستخدام haemocytometer كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،8، وتمييع إلى 100 × 10 6 الجسيمات / مل. طهاية مع التحفيز والتشجيع أكلة أخرى، مثل تكملة أو لا طهاية، قد يتم تنفيذ بدلا من ذلك.
2. لايف فيديو المجهر
- عزل العدلات الماوس الأولية كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر 38.
- بدلا من ذلك، استخدام أي نوع من الخلايا البلعمية. الحفاظ العدلات على الجليد في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسطة تستكمل مع 5٪ الجنين المصل في ربلة الساق (ت / ت)، 200 U البنسلين / streptomyciن، بتركيز 10 × 10 6 خلية / مل لتصبح جاهزة للاستخدام. قد يكون المصنف أنواع الخلايا الأخرى قبل 1-4 أيام.
- إضافة 2 × 10 5 (20 ميكرولتر) العدلات إلى وسط الزجاج السفلي 35 مم طبق، ونشر انخفاض بإضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا الالتزام.
- إضافة الدفء 1 مل من محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) إلى 37 درجة C الذي يحتوي على MPO محددة هيدرازيد المانع 4-أمينو (4 ABH، 10 ميكرومتر). مثبطات MPO غير محددة، مثل أزيد الصوديوم (5 ملم)، ويمكن أيضا أن تستخدم ولكن قد اقترحت مؤخرا لممارسة تأثيرات غير محددة إضافية على درجة الحموضة 39.
- تركيب الطبق على المجهر widefield مضان مجهزة 37 ° C نظام التدفئة والهدف النفط 40X. احتضان الخلايا دون التصوير لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا ومعدات للتوازن.
- ضبط إعدادات المجهر للحصول على نقل صورة مشرق الميدان [فاحد ذاتها أو على النقيض تدخل الفرق (DIC) إن وجدت] مع 440 نانومتر أو 490 نانومتر الإثارة و 535 نانومتر انبعاث كل 30 ثانية.
- ضبط وقت التعرض وتردد الاستحواذ وفقا لنظام المجهر لتجنب الكثير من photobleaching من والضيائية واعتمادا على الأسئلة التجريبية التي طلب منها ذلك. بدء الحصول على الصور.
- بعد 2 دقيقة، وإضافة 10 × 10 6 (50 ميكرولتر) opsonized FITC-زيموزان إلى وسط الطبق. ضبط الهدف: نسب الخلايا تبعا لنوع من بلعمية والهدف المستخدمة.
- يستمر التصوير لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة وقف اكتساب الوقت الفاصل بين وبدء الموقت. تحريك خشبة المسرح والتقاط 10 أو أكثر لقطات في مختلف المجالات من أجل صورة phagosomes الآخرين، كل ذلك ضمن 5 دقائق.
3. المعايرة ومراقبة التجارب
- إعداد الحلول درجة الحموضة المعايرة (موصوفة وصفات في الجدول رقم 1) قبل يوم من التجربة وتجميد في 10 مل قسامات.ذوبان الجليد الحلول المعايرة ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. تحقق من درجة الحموضة مع متر الرقم الهيدروجيني وتسجيل الرقم الهيدروجيني الفعلية من الحلول.
- جبل مضخة تحوي على الجزء السفلي صحن من الزجاج قبل الحصول على الصور وإجراء الفحص المجهري لقطات فيديو حية كما هو موضح أعلاه (القسم 2).
- في نهاية فترة شراء 30 دقيقة تشغيل المضخة لإزالة الحل في طبق، إضافة 1 مل من محلول المعايرة الأول ووقف ضخ.
- الانتظار حتى تستقر إشارة، عادة مدة 5 دقائق. أكرر مع كل حل المعايرة.
- أداء المعايرة واحدة على الأقل في اليوم التجريبي، ومعايرة بدءا من أعلى درجة الحموضة وبالتتابع عمل إلى أدنى مستوى، فضلا عن بدء من أدنى درجة الحموضة والعمل بشكل متتالي نحو الأعلى.
- كعنصر تحكم، إضافة 100 ميكرولتر من 100 ميكرومتر NADPH أوكسيديز المانع ثنائي الفينيل propionium يوديد (DPI) المخفف في HBSS إلى الخلايا في 900 ميكرولتر HBSS في طبق زجاجي القاع، واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- بدء استحواذ وإضافة زيموزان على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 2.7). بعد 15 دقيقة من البلعمة، إضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر V-أتباز المانع concanamycin A (كونكا) المخفف في HBSS ويستمر التصوير لمدة 15 دقيقة إضافية.
تحليل 4.
- تحليل الأفلام الوقت الفاصل بين واللقطات يبلوع.
ملاحظة: الإرشادات التالية هي محددة ليماغيج. خطوة بخطوة قد تختلف الإرشادات على نطاق واسع اعتمادا على البرمجيات المستخدمة، ولكن هي وظائف الموضحة في هذا القسم متاح في معظم البرامج المهنية تحليل الصور.- فتح الصور مع البرامج المهنية تحليل الصور. طرح الخلفية في القناة 490 عن طريق رسم ROI مربع صغير مع مربع أداة التحديد المضلع في منطقة حيث لا توجد الخلايا، والنقر الإضافات> BG الطرح من العائد على الاستثمار. ثم تحميل نفس ROI على قناة 440 بالنقر فوق تحرير> اختيار> استعادة التحديد وتكرار.
- جعل 32 بت نسبة صورة القناة 490 مقسوما على قناة 440 بالضغط العملية> حاسبة صورة ...، واختيار الصور المناسبة في Image1 وو Image2 القوائم المنسدلة، ثم اختيار 'تقسيم' في القائمة المنسدلة عملية ، والتحقق من 32 بت (تعويم) نتيجة الاختيار مربع.
- تغيير نظرة متابعة الجدول الترميز اللوني لنسبة المتوافقة مع لون الترميز بالضغط صورة> طاولات بحث> قوس قزح RGB. عتبة الصورة نسبة إلى القضاء 0 واللانهاية بكسل بالضغط صورة> ضبط> العتبة .... ضبط أشرطة التمرير بحيث يظهر أن زيموزان باللون الأحمر وانقر فوق تطبيق، والتأكد من تحديد مجموعة بكسل خلفية خانة الاختيار نان ل.
- الجمع بين هذه النسبة كومة مع قناة مشرق الميدان في مركب متعدد القنوات بالضغط صورة> اللون> دمج القنوات، واختيار الصورة مشرق الميدان في القائمة قناة المنسدلة الرمادي وصورة نسبة في القائمة المنسدلة قناة خضراء، و اختيارإبقاء مصدر الصور فحص مربع. مسح الأفلام مرور الزمن أو لقطات لتحديد أي phagosomes هم لتحليلها. قناة مشرق الميدان مفيدة لهذا الغرض.
- رسم مناطق الفائدة (ROI) باستخدام أداة التحديد البيضاوي المضلع حول phagosomes، وإضافتها إلى مدير ROI بالضغط تحليل> أدوات> مدير ROI> إضافة. قياس نسبة كثافة زيموزان من خلال النقر المزيد> متعددة للقياس واجتثاث اختيار صف واحد لكل شريحة الاختيار مربع.
- للأفلام مرور الزمن، المسار phagosomes في وقت واحد من خلال الاعتماد على العائد على الاستثمار، وكتابة على Ctrl + M لقياس كل نقطة زمنية، وتحريك ROI عند الضرورة لتتبع القيم شدة مع مرور الوقت. نسخ القياسات من نافذة نتائج في برنامج جداول البيانات.
ملاحظة: تحليل 15 (5 دوام دورات في التجربة × 3) تجارب مستقلة غير مثالية، ولكن أكثر أو أقل قد تكون هناك حاجة تبعا لتقلب الملاحظة. إنقاذ رويس ينصح دائما. بعض حزم البرمجيات تسمح ريجي صورةstration والتحديث الحيوي رويس، وتسهيل هذا الجزء من التحليل.
- التحويل من مضان للقيم الرقم الهيدروجيني
- قياس نسبة 490/440 لphagosomes في معايرة الأفلام مرور الزمن كما هو موضح في القسم 4.1.
- في جدول بيانات، رسم القيم نسبة مع مرور الوقت، وحساب متوسط قيم نسبة من كل phagosomes داخل مجال الرؤية (عادة ما بين 5-20) من 5 نقاط وقت خلال منتصف الفترة الزمنية المقابلة لكل درجة الحموضة المعايرة حل. (انظر أيضا مربعات حمراء في الشكل 5A).
- رسم هذه 490/440 متوسط قيم نسبة الرقم الهيدروجيني ضد المقاسة الفعلية. الجمع بين ما لا يقل عن 3 المعايرة مستقلة في رسم بياني واحد. استخدام حزمة البرامج الإحصائية أو العددية لإجراء الانحدار غير الخطية (أفضل منحنى نوبة)، وعادة لمعادلة السيني.
ملاحظة: على سبيل المثال، في الشكل 5B كانت المعادلة المستخدمة لالسيني بولتزمان [Y = أسفل + ((من أعلى إلى أسفل)/ (1 + EXP ((V50-X) / المنحدر))]، حيث قيم Y هي نسب 490/440، X هي قيم الرقم الهيدروجيني وأعلى، أسفل، وتحسب V50 والمنحدر المعلمات من قبل البرنامج. - استخدام المعادلة التي تم الحصول عليها لتحويل القيم نسبة لدرجة الحموضة.
ملاحظة: على سبيل المثال، في الشكل 5B المعادلة التي حصل عليها لمنحنى المعايرة بحضور أزيد الصوديوم 490/440 نسبة = 1.103 + [(2،89-1،103) / (1 + EXP ((6.993 درجة الحموضة) /0.9291)] . حل لدرجة الحموضة يعطي المعادلة التالية: الرقم الهيدروجيني = 6،993-0،9291 * [LN ((1.178 / (نسبة 1.103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفيما يلي نتائج ممثل للتجربة حيث درجة الحموضة phagosomal العدلات الماوس الابتدائية معزولة عن نخاع العظام من النوع البري أو Hvcn1 - / - وتمت مقارنة الفئران. لتجربة ناجحة، فمن المهم الحصول على ما يكفي من phagosomes داخل مجال الرؤية خلال فترة كاملة من الفيلم الوقت الفاصل، مع تجنب الكثير من phagosomes، والتي سوف تكون في وقت لاحق من الصعب قطاع خلال تحليل الصور. يبين الشكل 1 أمثلة من confluencies الخير والشر. للمرة التي تعتمد على لقطة ويحلل، ويجب تمييز جزيئات زيموزان الخارجية من phagosomes ويستثنى من التحليل. الشكل 2 يوضح كيف يمكن أن تكون الصورة مشرق الميدان مفيدة للمساعدة في تمييز جزيئات زيموزان الخارجية من phagosomes. ويبين الشكل 3 أمثلة على يبلوع نموذجي درجة الحموضة الوقت دورات في البرية من نوع بالمقارنة مع Hvcn1 - / - ويوضح الشكل 4 تأثير إضافة المانع NADPH أوكسيديز DPI، مما يؤدي إلى تحمض السريع، تليها إضافة V-أتباز المانع كونكا، الذي يعكس التحميض. ويمكن لهذه التجارب ستكون حاسمة لاثبات ان تحقيقات حساسة درجة الحموضة تعمل ضمن phagosomes كما يجب. يتم تمثيل المعايرة النموذجية وقتا بالطبع في الشكل (5)، مع المستطيلات تشير إلى مجموعة من القيم نسبة المستخدمة لبناء منحنى المعايرة ويبين الشكل 5 بالإضافة إلى كيفية صبغ بالكلور من خلال النشاط الخطة الرئيسية للعمليات يمكن أن تؤثر على intraphagosomal درجة الحموضة رد FITC، وتسليط الضوء على حقيقة أن تحقيقات قد يستجيبون بشكل مختلف مما كان متوقعا في phagoso بيئة سوء وأهمية المعايرة في الموقع.
الشكل 1. المناسبة confluency والهدف: نسبة الخلايا وتظهر اللوحة اليسرى على سبيل المثال حيث الخلية confluency هو متفرق جدا والهدف: نسبة الخلايا منخفضة جدا، مما يقلل من احتمال أن بلعمة سيحدث في مجال الرؤية. تظهر لوحة المتوسطة على سبيل المثال حيث الخلية confluency مرتفع جدا وتزدحم الخلايا. في ظل هذه الظروف، قد لا يكون خلايا مساحة كافية للتحرك والبحث عن أهدافها، أو الزحف على كل تحليل صنع الآخرين أكثر صعوبة في وقت لاحق. وتظهر اللوحة اليمنى من الخلية confluency المثالي والهدف الأولي: نسبة الخلايا، حيث العديد من الخلايا والأهداف يمكن أن كان ينظر وحتى الآن لا تزال تمييزها بوضوح عن بعضها البعض. ويرد FITC-زيموزان باللون الأخضر ويمثل الشريط على نطاق و10 ميكرون. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. phagosomes التمييز وزيموزان uningested. وتظهر اللوحة اليسرى صورة مشرق الميدان المدمجة ونسبة 490/440 FITC-زيموزان، في حين تظهر اللوحة اليمنى صورة مشرق الميدان وحده. Phagosomes (الأسهم الصغيرة الخضراء) يمكن تمييزها عن جزيئات الخارجية، التي إما لا شارك في توطين مع الخلايا (السهم الأحمر القصير) أو الذين مضان لا يتطابق مع مركز الظلام (السهم الأحمر الطويل) وتحيط بها حلقة أكثر إشراقا، مميزة من phagosomes في الصورة مشرق الميدان (الأسهم الخضراء). أشرطة النطاق تمثل 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. دورات الزمن، ومتوسط درجة الحموضة ونسبة رسوم بيانية من النوع البري وHvcn1 - / -. phagosomes العدلات (A) دورات الوقت النموذجية لphagosomal درجة الحموضة وتبين أنه بينما في النوع البري العدلات (الأزرق) الرقم الهيدروجيني محايدة (الخط المنقط ) أو قلوية قليلا (خط الصلبة) في وقت مبكر خلال نقاط وقت بعد ابتلاع، وphagosomes من Hvcn1 - / - العدلات (الأحمر) إما أن يقلون (خط الصلبة) أو تحمض (الخط المنقط). (B) تجميع لقطات تؤخذ 30-35 دقيقة بعد إضافة أهداف تسمح للمتوسط phagosomal السكان الرقم الهيدروجيني إلى أن تحسب من عدد كبير من phagosomes (البرية من نوع: ن = 5/1898/383 و Hvcn1 - / -: ن = 6 / 1433/451 التجارب / phagosomes / الخلايا والحانات وسيلة ± SEM، NS يست كبيرة). (C) المدرج الإحصائي من FITC-zymosa ن نسب تكشف الاختلافات في phagosomal درجة الحموضة بين النوع البري وHvcn1 - / - العدلات. (تم تعديل هذا الرقم من [19]، مع الحصول على إذن.) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
أدى الشكل 4. آثار NADPH أوكسيديز المانع DPI وV-أتباز المانع كونكا على phagosomal درجة الحموضة. ما قبل الحضانة في 10 ميكرومتر DPI في تحمض السريع لphagosomes بعد وقت قصير من ابتلاع، الذي انعكس من خلال إضافة 100 نانومتر كونكا (السهم). (تم تعديل هذا الرقم من [19]، مع الحصول على إذن.) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
FO: المحافظة على together.within صفحة = "1"> 
الرقم 5. درجة الحموضة المعايرة وقتا بالطبع وآثار MPO تثبيط على معايرة FITC-زيموزان. (A) منحنى درجة الحموضة المعايرة النموذجية intraphagosomal FITC-زيموزان. مربعات حمراء تشير إلى مجموعة من القيم نسبة المستخدمة لبناء منحنى المعايرة. يشار إلى قيم الرقم الهيدروجيني الفعلية من الحلول المستخدمة والأوقات التي يتم تغيير الحلول التي السهام. يمثل منحنى متوسط 10 phagosomes داخل حقل واحد للعرض. (B) تثبيط MPO مع غير محددة أزيد المانع الصوديوم (5 ملم، MPO INH) يزيد النطاق الديناميكي للاستجابات التي تعتمد على درجة الحموضة FITC-زيموزان intraphagosomal. النقاط هي الوسائل ± SEM (تم تعديل هذا الرقم من [19]، مع الحصول على إذن.) الرجاء انقر هنا لعرض لانسخة rger من هذا الرقم.
| 1.1 | (2X) قاعدة | |||||
| مخازن | المخزون | النهائي (1X) | 500 مل (2X) | |||
| بوكل | 1 M | 140 ملي | 140 مل | |||
| MgCl 2 | 1 M | 1 ملم | 1 مل | |||
| EGTA | 1 M | 0.2 ملم | 0.2 مل | |||
| كلوريد الصوديوم | 1 M | 20 ملي | 20 مل | |||
| 1.2 | مخازن | المخزون | نهائي(1X) | غرض | ||
| MES | 1 M | 20 ملي | لدرجة الحموضة 5،5-6،5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 ملي | لدرجة الحموضة 7،0-7،5 | |||
| تريس | 1 M | 20 ملي | لدرجة الحموضة 5،5-6،7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 ملي | لدرجة الحموضة 5،5-6،8 | |||
| 1.3 | Ionophores | الأسهم (100٪ ETOH) | النهائي (1X) | |||
| Nigericin | 5 ملغ / مل | 5 ميكروغرام / مل | ||||
| مونينسين | 50 ملي | 5 ميكرومتر | ||||
| 1.4 | 50 مل | |||||
| درجة الحموضة | 2X قاعدة | نوع عازلة | عازلة المجلد. | Nigericin | مونينسين | |
| 5.0 | 25 مل | MES | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| 5.5 | 25 مل | MES | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| 6.0 | 25 مل | MES | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| 6.5 | MES | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | ||
| 7.0 | 25 مل | HEPES | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| 7.5 | 25 مل | HEPES | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| ثمانية | 25 مل | تريس | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| 8.5 | 25 مل | تريس | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| تسعة | 25 مل | تريس | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| 9.5 | 25 مل | NMDG | 1 مل | 50 ميكرولتر | 5 ميكرولتر | |
| ضبط درجة الحموضة معKOH أو حمض الهيدروكلوريك | ||||||
الجدول 1. وصفة لإعداد حلول المعايرة. 1.1) وصفة لإعداد 500 مل من محلول قاعدة 2X 1.2) وصفة لإعداد مخازن مختلفة تستخدم وفقا لدرجة الحموضة في حل المعايرة. 1.3) وصفة لإعداد ionophores المستخدمة في حلول المعايرة. 1.4) وصفة لإعداد 50 مل من كل حل المعايرة باستخدام قاعدة، ومخازن وionophores هو موضح في 1،1-1،3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن أكثر استهلاكا للوقت من الطرق البديلة، مثل التحليل الطيفي وFACS، التي تستخدم استراتيجية مماثلة باستخدام صبغة حساسة درجة الحموضة بالإضافة إلى أهداف ولكن قياس متوسط درجة الحموضة من سكان phagosomes و الفحص المجهري ويقدم العديد من المزايا. الأول هو أن الداخلية والخارجية ملزمة، ولكن ليس المنضوية، يمكن أن تكون الجسيمات بسهولة المتميزة دون الحاجة إلى إضافة مواد كيميائية أخرى، مثل التريبان الأزرق أو الأجسام المضادة، لإرواء أو التسمية الجسيمات الخارجية، على التوالي. هي ثاني أنه في أعقاب الخلايا في الوقت الحقيقي تسمح للباحثين لمراقبة جوانب متعددة من عملية البلعمة في وقت واحد وذلك الآثار المترتبة على الهجرة، والاستشعار عن بعد والجسيمات ملزمة يمكن تمييزها بسهولة هنا، في حين أنه يمكن التغاضي مع الأساليب القائمة على السكان. بالإضافة إلى ذلك، تزامن بدء البلعمة، وغالبا ما يؤديها خلايا وضع في 4 درجات مئوية، والتي قد التشويش على الأحداث الاتجار أخرى بسبب الصدمة الباردة 40،41، ليسر الضرورة الوقت الصفر يمكن تمييزها مباشرة. في الواقع، عند تنفيذ المجهري المباشر، لا ينصح هذا 4 ° تقنية C تزامن إذا التقاط فترات زمنية قريبة من الشروع في البلعمة كما التكثيف الذي يشكل في الجزء السفلي من الطبق خلال التحول درجة الحرارة يمكن أن تخلط مع موضوعي النفط الغمر و الاختلافات في درجة الحرارة بين مكونات الطبق والمجهر ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يسبب نوبات التركيز. والميزة الثالثة تنبع من حقيقة أن phagosomes غير متجانسة في جوهرها على العديد من المعلمات بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، ودرجة الحموضة 42، وآثار معينة على يبلوع درجة الحموضة قد تكون أكثر دهاء، وتغيير توزيع درجة الحموضة phagosomal بدلا من متوسط عدد السكان، كما كان هو موضح في الشكل 3. هذه الملاحظات قد يعطي رؤى أعمق الآلية في تنظيم phagosomal درجة الحموضة.
في هذه الدراسة، تم اختيار FITC مثل صبغة حساسة درجة الحموضة في الاختيار لأنهاغير مكلفة، وهي متاحة على نطاق واسع، ولها أهمية على الباكاف الحمضية 6.5 مع مجموعة ديناميكية تشمل درجة الحموضة 3-9 في شكل حر في 37، والذي يقابل نطاق درجة الحموضة كان متوقعا في البداية من الحياد إلى القلوية قليلا، وفقا لدراسات سابقة 29،30. في الآونة الأخيرة دراسة استخدام مسبار درجة الحموضة ودعا مختلف SNARF، التي لديها أكثر الباكاف الحمضية الأساسي من 7.5، ودرجة الحموضة القيم التقديرية بشكل غير متوقع تتراوح 1-2 وحدات درجة الحموضة أكثر قلوية لكلا من النوع البري وHvcn1 - / - phagosomes العدلة 39. وهكذا، واختيار من أجهزة الاستشعار درجة الحموضة هو معلمة هامة للنظر اعتمادا على التطبيق. من حيث المبدأ، يمكن تكييفها على الطريقة المعروضة هنا بسهولة لتوظيف غيرها من الأصباغ الحساسة درجة الحموضة، مثل SNARF و 2 "، 7'-التسويات الدولية (2-carboxyethyl) -5- (و6) -carboxyfluorescein (BCECF)، تقترن التي المشتقات succinimidyl استر بسهولة إلى amine التي تحتوي على جزيئات، مثل زيموزان. في الواقع، وأجهزة الاستشعار ليس من الضروري أن يقتصر على الأصباغ الفلورية، كما ratiometبروتينات حساسة درجة الحموضة ريك، فإن مثل هذا SypHer 43، يمكن transduced وأعرب بواسطة الكائنات الحية الدقيقة. وجود العديد من البدائل غير ratiometric أيضا، ولا سيما النسخة الأحمر من صبغة pHrodo، والتي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) -tagged البروتينات أو البروتينات الحساسة للدرجة الحموضة pHluorin. ومع ذلك، ونظرا للآثار المحتملة الكبيرة التي الوسط intraphagosomal قاسية يمكن أن يكون على الأصباغ والبروتينات المستهدفة فيه، وينبغي أن تكون هذه التحقيقات في الحد الأدنى جنبا إلى جنب مع الرقم الهيدروجيني تحقيقات حساسة لاستخدامها في اشتقاق الزائفة النسبة. كما يتضح في الشكل (5)، ويمكن معايرة التجارب يعرض آثار الضرر صبغ كما مجموعة ديناميكية تخفيض أو مشوهة. وعلى صعيد العملية والتجارب المعايرة ليست دائما مثالية وقد تكون غير مجدية يجب إتباعها بعد كل تجربة. ونتيجة لذلك، قد تنخفض قيم النسبة في بعض الأحيان خارج نطاق المعايرة والعائد القيم مستحيلة عند التحويل لدرجة الحموضة. قد يكون ذلك appropriate إما التعبير عن هذه القيم خارج نطاق بأنها "أكبر / أقل من أو يساوي" الحد الأقصى والحد الأدنى من القيم ودرجة الحموضة المعايرة، أو للتعبير عن كل القيم كما نسب وتقدير درجة الحموضة تتراوح أن متوسط نسب تمثل.
كما أكد DPI وتسيطر كونكا والإنتاج ROS والنشاط V-أتباز من العوامل الرئيسية التي تحدد phagosomal درجة الحموضة. في الواقع، في كثير من الحالات، والتغيرات في مستويات الإنتاج ROS قد تكمن وراء الاختلافات في phagosomal درجة الحموضة، وخاصة في العدلات، وقياس phagosomal ROS الإنتاج ودرجة الحموضة كثيرا ما تسير جنبا إلى جنب. كلمة واحدة من الحذر هو أن كلا من المخدرات تضفي نظرة ثاقبة في نشاط الإنزيمات التي تحول دون ولكن ليس إلى موقعها داخل الخلية. كل من الانزيمات هي مجمعات متعددة فرعية، التي يجب المرور إلى phagosomes 4، وعدم وجود النشاط على phagosomes قد تنجم عن الاتجار أو التجميع العيوب بدلا من الآثار المباشرة المكونات الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
