Abstract
吞噬作用是通过它先天免疫细胞吞噬细菌，细胞凋亡或其它外来粒子以杀死或中和摄入材料，或提供它作为抗原并引发适应性免疫反应的基本处理。吞噬体的pH值是一个重要的参数调节裂变或融合endomembranes和活化的蛋白水解酶，事件，允许吞噬液泡成熟为一个降解细胞器。此外，需要用于生产高水平的活性氧（ROS），它是必不可少的有效杀伤和信令到其他宿主组织的H +的易位。许多细胞内病原体通过限制吞噬体酸化，突出吞噬体生物pH值的重要性颠覆吞噬杀灭。在这里，我们描述了一个比例测量方法吞噬体pH值在使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的嗜中性粒细胞酵母多糖为吞噬TARGETS和活细胞成像。该测定法是基于FITC，，它是通过酸性pH时在490nm激发而不是当在440nm激发时，允许pH依赖比率的量化，而不是绝对的荧光，一单一染料的淬灭的荧光性质。还提供了用于进行原位染料校准和转换比实际的pH值的详细协议。单染料比例的方法通常被认为优于单波长或双染料伪比例协议，因为它们对扰动如漂白较不敏感，焦点改变，激光的变化，且不均匀标签，其中扭曲测量的信号。这个方法可以很容易地修改，以测量pH在其他吞噬细胞类型，和酵母聚糖可通过任何其它的含胺粒子取代，从惰性珠活的微生物。最后，该方法可以适于以利用其它荧光探针不同的pH值范围或其它phagosom敏感的人的活动，使之成为一个广义的协议吞噬小体的功能成像。
Protocol
伦理声明：所有的动物操作均严格按照日内瓦大学的动物研究委员会的指导方针进行。
1.准备吞噬目标
- 添加20毫克干燥酵母多糖至10毫升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。涡流和热在沸水浴10分钟。凉爽和离心机在2000×g离心5分钟。
- 除去上清液，重悬在1ml PBS中并声处理用于在水浴超声波仪10分钟。转移500μl到2个1.5 mL管。离心在11000×g离心5分钟。
- 重复用500微升PBS洗涤。煮沸酵母多糖可以等分，冷冻并储存在-20℃。
- 于500μl新鲜制备的0.1M 的 Na 2 CO 3，pH值9.3如上述（步骤1.2）洗两次酵母聚糖。
- 悬浮在最后一次洗涤后490微升。添加10微升10毫克/毫升的FITC溶于二甲sulfoxidE（DMSO）中，涡旋，盖上箔和孵育在搅拌4小时，在室温。
- 去除未结合的染料，与上述（步骤1.2）洗涤，先用0.5毫升DMSO + 150微升的PBS，然后0.5毫升DMSO + 300微升的PBS，然后0.5毫升DMSO + 450微升PBS中，然后单独的PBS。
- 使用血球计数酵母聚糖。加入1μl酵母多糖的500微升PBS中，涡旋，然后加10微升到血细胞计数器室中，在那里它满足盖玻片放置在中央网格的边缘。装入血球上一个明亮的视野显微镜配备了20倍的目标。
- 专注于含有16平方上的左上角和计数用手握式计数器在这一领域的所有酵母多糖颗粒。重复与较低的右上角。计算使用下面的等式的酵母聚糖浓度：酵母聚糖浓度=计数/ 2×500×10 4的酵母多糖/毫升。标记的酵母多糖可以等分，冷冻并储存在-20℃。
- Opsonize标记的酵母多糖无线TH兔抗酵母聚糖抗体以1：100的稀释。涡孵育1小时在37℃水浴。用500μlPBS洗涤如上（步骤1.2）。
注：超声强烈建议，特别是调理后，因为酵母多糖往往形成团块，可以使分析更困难以后。调理作用用65％体积/体积的大鼠或人血清可以用作替代方法。 - 计数使用血球酵母聚糖如步骤1.7-1.8中描述，并稀释至100×10 6个颗粒/毫升。调理作用与其他吞噬刺激器，如补体或无调理作用，可以替代地执行。
2.实时视频显微镜
- 如其他地方38中详细描述隔离鼠标主中性粒细胞。
- 另外，使用任何吞噬细胞类型。保持在冰上的中性粒细胞在罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）1640培养基中补充有5％胎牛血清（体积/体积），200单位青霉素/ streptomyciN，以10×10 6细胞/ ml的浓度，直到准备使用。其它细胞类型可被1-4天前接种。
- 加入2×10 5（20微升）的嗜中性粒细胞，以35毫米玻璃底皿的中心，通过加入50μl培养基的传播降和孵育在37℃下5分钟，以使细胞粘附。
- 加入1毫升的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）加热到37℃，含有特定的MPO抑制剂4-氨基肼（4- ABH，10μM）。非特异性的MPO抑制剂，如叠氮化钠（5毫摩），也可以使用，但最近已建议施加于pH值39附加的非特异性作用。
- 安装在配有37℃的供暖系统和40X油目标的一个宽视场荧光显微镜的菜。孵育细胞无成象10分钟，以允许细胞和设备达到平衡。
- 调整显微镜设置以获得一个亮场图像传输[PHA本身或微分干涉对比（DIC）如果可用〕用440纳米或490纳米激发和535纳米的发射，每30秒。
- 根据显微镜系统，以避免过多的光漂白和光毒性，并根据实验问题被要求调整曝光时间和采集频率。开始图像采集。
- 2分钟后，加入10×10 6（50微升）调理的FITC的酵母聚糖的培养皿的中心。调整目标：细胞比率取决于所用吞噬细胞和目标的类型。
- 继续成像30分钟。 30分钟后，停止时间推移采集和启动一个定时器。移动载物台并捕获10个或更多的快照在视图像其他吞噬体不同的领域中，所有在5分钟内。
3.校准和控制实验
- 制备pH校准溶液（配方在表1中记载 ）之前实验当天和冻结在10ml等分试样。解冻校准解决方案和温暖至37℃的水浴中。检查用PH计的pH值，并记录溶液的实际pH值。
- 安装在玻璃底菜之前，图像采集蠕动泵及以上的（第2节）所描述的现场表演视频显微镜。
- 在30分钟采集期间结束打开以除去培养皿内的溶液泵，加入1毫升第一校准溶液和停止泵。
- 等到信号稳定，一般为5分钟。重复每个校准解决方案。
- 执行每个实验每天至少一个校准和校准开始具有最高pH值和工作顺序至最低，以及从最低pH值开始，并依次朝向最高工作。
- 作为对照，添加100微升100μM的NADPH氧化酶抑制剂二苯propionium碘（DPI）稀释于HBSS中的单元格900微升HBSS在玻璃底皿中，孵育10分钟。
- 开始收购并添加酵母多糖如上面（步骤2.7）。吞噬后15分钟，加入10微升10μMV-ATP酶抑制剂concanamycin A（CONCA）稀释于HBSS，并继续成像额外的15分钟。
4.分析
- 分析时间推移电影和吞噬快照。
注：以下说明是特定的ImageJ的。一步一步的说明可能很大程度上取决于所使用的软件，但在本节中描述的功能是最专业图像分析软件。- 打开与专业图像分析软件的映像。在那里有没有细胞的区域绘制一个小广场的投资回报率与方多边形选择工具，然后单击从投资回报率插件> BG减法减去了490通道的背景。然后上传的440路相同的投资回报率通过单击编辑>选项>恢复选择并重复。
- 使490路的440路划分的32位比图像通过单击流程>图像计算器...，选择在Image1的和IMAGE2下拉菜单中相应的图像，然后选择在操作下拉菜单中选择“鸿沟” ，并检查了32位（浮点）结果复选框。
- 点击图片>查找表>彩虹RGB改变颜色编码查表到比兼容的彩色编码。阈值的比例进行图像消除0到无穷大的像素通过点击图像>调整>阈值...。调整滚动条，使酵母多糖显示为红色，点击Apply，确保设置背景像素为NaN复选框被选中。
- 点击图片结合这个比例堆栈明视场通道成多路复合>颜色>合并通道，并选择在灰色通道下拉菜单中的亮场图像，并在绿色通道下拉菜单中的比例图像，选择保持源图像复选框。扫描时间推移电影或快照，以确定哪些吞噬体是待分析。明视场通道是这个有用的。
- 通过绘制吞噬体周围的椭圆形的多边形选择工具感兴趣区域（ROI），并将其通过单击分析>工具>投资回报率管理器添加到投资回报率经理>添加。点击更多>多功能测量和去选择每片复选框的一行衡量他们的酵母多糖强度比。
- 对于时间推移电影，按部就班地进行绘制的投资回报率，按Ctrl + M来衡量每一个时间点，而移动的投资回报率在必要时随着时间的推移跟踪强度值吞噬体一次。从结果窗口中的测量结果复制到一个电子表格软件。
注意：独立实验15（每实验×3 5时程）分析是理想的，但或多或少可根据观察到的变异性是必需的。保存的投资回报总是建议。有些软件包允许图像REGI共探和投资回报的动态更新，有利于这部分的分析。
- 转换，从荧光至pH值
- 测量的第4.1节所述的四百四十分之四百九十○比例在校准时间推移电影吞噬体。
- 在电子表格中，绘制比值随着时间的推移，而从视场之内的所有吞噬体5的时间点的时间段对应于每个pH校正中间内计算平均比率值（通常5-20之间）解。 （见红色框图5A）。
- 暗算实际测得的pH值，这些平均四百四十○分之四百九十零比值。结合至少3个独立校准到一个单一的图形。使用统计数值或软件包执行非线性回归（最佳拟合曲线），通常以S形方程。
注意：例如，在图5B中使用的方程为一个玻尔兹曼S形[Y =底+（（顶-底）/（1 + EXP（（V50-X）/斜率））]，其中Y值是四百四十〇分之四百九十〇比率中，X是将pH值和顶部，底部，V50和斜率参数由软件来计算。 - 使用所获得的公式来转换比的值至pH。
注意：例如，在图5B中的叠氮化钠存在下，校准曲线得到的方程是四百四十○分之四百九十○比率= 1.103 +（2.89-1.103）/（1 + EXP（（6.993-pH值）/0.9291）] 。求解用于pH给出以下等式：pH值= 6.993 - 0.9291 * [LN（（1.178 /（比-1.103）） - 1））]。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
下面是有代表性的结果做了一个试验，其中初级小鼠嗜中性粒细胞从骨髓的野生型或分离的吞噬体的pH Hvcn1 - / - 小鼠进行比较。对于一个成功的实验，这是重要的定时影片的整个持续时间期间获得的视场范围内足够吞噬体，同时避免过多的吞噬体，其中图像分析过程中稍后将更加难以段。 图1示出了好的和坏的汇合的例子。对于时间相关和快照分析，外部酵母多糖颗粒必须从吞噬体区分开来，并从分析中排除。 图2示出了明场图象如何能帮助从吞噬体区分外部酵母聚糖颗粒是有用的。 图3示出了典型的吞噬体的例子相比Hvcn1 pH值时，课程在野生型- / - 图4示出增加的NADPH氧化酶抑制剂的DPI，这导致了快速酸化，随后加入在V-ATP酶抑制剂孔卡，其反转酸化的效果。这样的实验可以是临界证明pH敏感探针吞噬体中工作，他们应该。典型的校准时间过程示于图5中，用矩形表示用于构建校准曲线比的值的范围。图5另外示出了如何染料通过MPO活性氯化可以影响的FITC的intraphagosomal pH的响应，突出的事实该phagoso内比预期的探头可以有不同的反应发作环境和原位校准的重要性。
图1.适当汇合和目标：细胞比例左侧面板显示了一个例子，其中细胞汇合过于稀疏和目标：细胞比例过低，减少一个吞噬事件将发生在视场的概率。中间面板显示了一个例子，其中细胞汇合过高和细胞拥挤。在这些条件下，细胞可能没有足够的空间来移动，并找到他们的目标，或者可以抓取更多困难以后在彼此之上制作分析。右图显示一个理想的细胞汇合和初始目标：细胞比例，其中许多小区和目标可被看见，但仍然可以清楚地从每个彼此区分。 FITC-酵母聚糖显示为绿色和比例尺条为10微米。 /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.区分吞噬体和uningested酵母多糖，左边的面板中显示了合并后的亮场图像和四百四十分之四百九十〇 FITC-酵母多糖的比例，而右边面板显示了亮场图像孤单。吞噬小体（小绿箭头）可以从外部颗粒区别开来，要么不共定位与细胞（短的红色箭头），或者其荧光不与黑暗的中心（长的红色箭头），匹配由亮环围绕，特征在亮场图像（绿色箭头）吞噬体。该比例尺代表10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.时间场，野生型和Hvcn1的平均pH值和比直方图- / - 。嗜中性粒细胞吞噬体（A）的吞噬体pH值的典型时间进程显示，而在野生型嗜中性粒细胞（蓝色）的pH为中性（虚线）或以下摄取，Hvcn1的吞噬体微碱性（实线）在早期时间点- / -嗜中性粒细胞（红色）可以碱化（实线）或酸化（虚线）。 （B）中编译的快照取30-35分钟后加入目标允许平均人口吞噬体的pH可以从大量吞噬体（野生型的计算：N = 5/1898年/ 383和Hvcn1 - / - ：N = 6 /四百五十一分之一千四百三十三实验/吞噬体/细胞，酒吧都在平均值±SEM，NS不显著）。 FITC-zymosa（三）直方图N比揭示野生型和Hvcn1之间的差异在吞噬体pH值- / -嗜中性粒细胞。 （这个数字已经被修改[19]，许可。） 点击此处查看该图的放大版本。
图上吞噬体的pH 4.影响NADPH氧化酶抑制剂的DPI和V-ATP酶抑制剂孔卡。预培养在10μM的DPI导致吞噬体的迅速酸化摄取后不久，这是通过加入100nM的孔卡（箭头）逆转。 （这个数字已经被修改[19]，许可。） 点击此处查看该图的放大版本。
图5. pH校准时间进程和FITC-酵母多糖的校准MPO的抑制效果。（A）intraphagosomal FITC-酵母多糖的典型PH校准曲线。红色的框表示用于构建校准曲线比的值的范围。所使用的解决方案，并在该溶液被改变的次数的实际的pH值由箭头指示。该曲线表示的视图中的单个场在10吞噬体的平均值。 MPO的（B）中抑制与非特异性抑制剂叠氮化钠（5mM的，MPO INH）增加的intraphagosomal FITC的酵母聚糖pH依赖性反应的动态范围。点是平均值±SEM（这个数字已经被修改[19]，许可。） 点击此处查看一拉rger版本这个数字。
| 1.1 | （2个）基地 | |||||
| 缓冲区 | 股票 | 决赛（1X） | 500毫升（2×） | |||
| 氯化钾 | 1M的 | 140毫米 | 140毫升 | |||
| 氯化镁 | 1M的 | 1毫米 | 1毫升 | |||
| EGTA | 1M的 | 0.2毫米 | 0.2毫升 | |||
| 氯化钠 | 1M的 | 20毫米 | 20毫升 | |||
| 1.2 | 缓冲区 | 股票 | 最终（1X） | 目的 | ||
| MES | 1M的 | 20毫米 | pH值5.5-6.5 | |||
| HEPES | 1M的 | 20毫米 | pH值7.0-7.5 | |||
| 三 | 1M的 | 20毫米 | pH值5.5-6.7 | |||
| NMDG | 1M的 | 20毫米 | pH值5.5-6.8 | |||
| 1.3 | 离子载体 | 库存（100％乙醇） | 决赛（1X） | |||
| 尼日利亚 | 5毫克/毫升 | 5微克/毫升 | ||||
| 莫能菌素 | 50毫米 | 5μM | ||||
| 1.4 | 对于50毫升 | |||||
| pH值 | 2个基地 | 缓冲区类型 | 缓冲卷。 | 尼日利亚 | 莫能菌素 | |
| 5 | 25毫升 | MES | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 5.5 | 25毫升 | MES | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 6 | 25毫升 | MES | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 6.5 | MES | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | ||
| 7 | 25毫升 | HEPES | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 7.5 | 25毫升 | HEPES | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 8 | 25毫升 | 三 | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 8.5 | 25毫升 | 三 | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 9 | 25毫升 | 三 | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 9.5 | 25毫升 | NMDG | 1毫升 | 50微升 | 5微升 | |
| 调节pH值KOH或HCl | ||||||
表1.配方制备的校准解决方案。 1.1）配方制备的2×基液500毫升1.2）配方制备使用了不同的缓冲液根据校准溶液的pH值1.3）配方用于制备校准溶液中使用的离子载体。1.4）配方制备50毫升用在1.1-1.3中描述的碱，缓冲液和离子载体每个校准溶液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然更多的时间比其他的方法，如光谱学和FACS，其采用使用pH敏感染料耦合到目标的一个类似的策略，但测量吞噬体的群体的平均pH值消耗，显微镜提供了几个优点。首先是，内部和外部的限制，但不内化，颗粒很容易被分辨，而无需添加其它化学品，如台盼蓝或抗体，以淬灭或标签外部粒子，分别。二是，继细胞进行实时让研究人员能观察吞噬过程中同步等迁移，传感和有约束力的粒子效果可能会很容易在这里看出端倪，而这可能与人口为基础的方法忽略的多个方面。此外，吞噬作用的启动同步，经常通过放置细胞中进行，在4℃下，这可能会扰乱其他运输事件由于冷休克40,41，是无必要的时间为0 t的直接看出端倪。实际上，在执行现场显微镜时，这4℃同步技术不推荐，如果捕获的时间段接近吞噬作为温度偏移期间形成在盘底部的缩合可与目标浸油混合的引发在气候变暖的菜和镜组件之间的温差会导致重点转移。从这一事实的第三个优点茎吞噬体是在几个参数，包括本质上异构的，但不限于，pH值42，并在吞噬体的pH一定的影响可能更细微，改变吞噬体的pH而不是平均人口的分布，作为示于图3中 。这些观察可以得到更深机械见解吞噬体的pH的调节。
在本研究中，FITC标记被选为所选择的pH值敏感的染料，因为它是便宜，随处可见，重要的有6.5的pKa与动态范围涵盖pH为3至9日在其免费的形式37，其匹配的中性至微碱性的原先预期的pH值范围内，根据以往的研究29,30。最近采用所谓SNARF不同pH探头，其具有7.5的更基本的pKa值，意外地估计的pH值范围为野生型和Hvcn1 1-2个pH单位更碱性的一项研究- / -嗜中性粒细胞吞噬体39。因此，pH传感器的选择是考虑根据应用的一个重要参数。原则上，在这里提出的方法可以容易地适合于采用其它pH值敏感的染料，如SNARF和2'，7'-二（2-羧乙基）-5-（和-6） - 羧基（BCECF），其琥珀酰亚胺基酯衍生物容易地连接到含胺颗粒，如酵母聚糖。事实上，传感器不必限制于荧光染料，如ratiometRIC pH敏感的蛋白质，这样的SypHer 43，可以被转导的和由微生物表达的。几个非比例的替代也是存在的，特别是红色版本染料pHrodo，其可在与绿色荧光蛋白（GFP）一起使用的-tagged蛋白质或pH敏感蛋白pHluorin。由于潜在的大的效果的严酷环境intraphagosomal可以对靶向于其中染料和蛋白质然而，这些探针应在最低结合pH值不敏感的探针在导出伪比率要采用。例举在图5中，校准实验可以公开的染料的损害作为减少或扭曲的动态范围的影响。在实践笔记，标定实验并不总是完美的，可能是不可行的每一个实验后执行。因此，比值可能偶尔掉出校准的范围和转换时产生不可能值至pH。它可以appropr黄昏时分要么表达这些超出量程值“大于/小于或等于”最大和最小刻度的pH值，或表达的所有值比和估计pH范围的平均比率表示。
所强调的DPI和孔卡控制，ROS的产生和V-ATP酶的活性是决定吞噬体pH值的主要因素。事实上，在许多情况下，改变ROS产生的水平可能在背后吞噬体pH值的差异，特别是在中性粒细胞和吞噬体ROS产生的测量和pH值往往齐头并进。谨慎的一个字是，两种药物借给洞察它们抑制但不向细胞内的位置中的酶的活性。两种酶是多亚基复合物，其各个组成部分必须流量吞噬体4，和缺乏对吞噬体的活性可能源于贩卖或组装缺陷而不是直接影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
