Abstract
La phagocytose est un processus fondamental par lequel les cellules immunitaires innées engloutissent les bactéries, les cellules apoptotiques ou d'autres particules étrangères dans le but de tuer ou neutraliser la matière ingérée, ou de le présenter comme antigènes et d'initier des réponses immunitaires adaptatives. Le pH de phagosomes est un paramètre critique régulation de fission ou fusion avec endomembranes et l'activation des enzymes protéolytiques, des événements qui permettent à la vacuole phagocytaire à mûrir dans une organelle dégradable. En outre, la translocation des ions H + est requis pour la production de niveaux élevés d'espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont essentiels pour la destruction efficace et signalisation à d'autres tissus de l'hôte. De nombreux agents pathogènes intracellulaires subvertissent assassinat phagocytaire en limitant l'acidification du phagosome, soulignant l'importance du pH dans phagosome biologie. Nous décrivons ici une méthode pour mesurer phagosomale quotientométrique pH dans les neutrophiles en utilisant l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au zymosan que phagocytaire targETS, et imagerie des cellules vivantes. Le dosage est basé sur les propriétés de fluorescence du FITC, qui est refroidi par un pH acide lorsqu'il est excité à 490 nm mais non lorsqu'il est excité à 440 nm, ce qui permet la quantification d'un rapport dépendant du pH, au lieu de fluorescence absolue, d'un seul colorant. Un protocole détaillé pour réaliser in situ colorant étalonnage et la conversion de rapport aux valeurs réelles de pH est également fourni. Simple-dye méthodes ratiométriques sont généralement considérés comme supérieurs à longueur d'onde unique ou protocoles de pseudo-ratiométrique double teinture, car ils sont moins sensibles aux perturbations telles que le blanchiment, les changements de focus, les variations de laser, et l'étiquetage inégale, qui faussent le signal mesuré. Ce procédé peut être facilement modifié pour mesurer le pH dans d'autres types de cellules phagocytaires, et zymosan peut être remplacée par toute autre particule contenant une amine, à partir de billes inertes à des micro-organismes vivants. Enfin, ce procédé peut être adapté pour utiliser d'autres sondes fluorescentes sensibles à des gammes de pH ou d'autres phagosomactivités al, ce qui en fait un protocole généralisé pour l'imagerie fonctionnelle de phagosomes.
Protocol
Déclaration éthique: Toutes les manipulations d'animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les directives du Comité de recherche animale de l'Université de Genève.
1. Préparation des cibles phagocytaires
- Ajouter 20 mg de zymosan séché à 10 ml de solution saline stérile de phosphate tamponnée (PBS). Vortex et à la chaleur dans un bain d'eau bouillante pendant 10 min. Refroidir et centrifuger à 2000 g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de PBS et de traitement par ultrasons pendant 10 minutes dans un sonicateur à bain-marie. Transférer 500 ul de deux tubes de 1,5 ml. Centrifuger à 11 000 g pendant 5 min.
- Répétez le lavage avec 500 pi de PBS. Le zymosan bouillie peut être aliquoté, congelé et stocké à -20 ° C.
- Laver deux fois le zymosan dans 500 ul fraîchement préparées 0,1 M de Na 2 CO 3, pH 9,3 comme ci-dessus (étape 1.2).
- Remettre en suspension dans 490 pi après le lavage final. Ajouter 10 ul de 10 mg / ml dissous dans FITC diméthyl sulfoxide (DMSO), vortex, couvrir de papier, et incuber sous agitation pendant 4 heures à température ambiante.
- Pour supprimer le colorant non lié, laver comme ci-dessus (étape 1.2), d'abord avec 0,5 ml de DMSO + 150 pi de PBS, puis 0,5 ml de DMSO + 300 pi de PBS, puis 0,5 ml de DMSO + 450 pi de PBS, puis PBS seul.
- Comptez zymosane utilisant un hémocytomètre. Ajouter 1 pi de zymosan à 500 ul de PBS, vortex, puis ajouter 10 ul du bord de la chambre d'hémocytomètre, où elle rencontre la lamelle couvre-objet placé sur la grille centrale. Montez le hémocytomètre sur un microscope à champ lumineux équipé d'un objectif 20X.
- Concentrez-vous sur le coin supérieur gauche contenant 16 carrés et compter toutes les particules de zymosan dans ce domaine en utilisant un compteur à main. Répéter l'opération avec le coin inférieur droit. Calculer la concentration zymosane utilisant l'équation suivante: concentration Zymosan = comte / 2 x 500 x 10 4 zymosane / ml. Zymosane marqué peut être aliquoté, congelé et stocké à -20 ° C.
- Opsoniser le wi zymosane marquéth un anticorps anti-lapin zymosan à 1: 100 dilution. Vortex et incuber pendant 1 heure dans un bain d'eau à 37 C °. Laver avec 500 pi de PBS comme ci-dessus (étape 1.2).
Remarque: Le traitement par ultrasons est fortement recommandé, surtout après opsonisation, comme zymosane tend à former des amas qui peuvent rendre plus difficile l'analyse plus tard. Opsonisation avec 65% v / v de sérum humain ou de rat peut être utilisé comme une alternative. - Comptez zymosane utilisant un hémocytomètre comme décrit dans les étapes 1,7-1,8, et diluer à 100 x 10 6 particules / ml. Opsonisation avec d'autres stimulateurs phagocytaires, comme complément ou pas opsonisation, peut également être réalisé.
2. Live Video Microscopy
- Isoler neutrophiles primaires de souris comme décrit en détail par ailleurs 38.
- Vous pouvez également utiliser n'importe quel type de cellule phagocytaire. Gardez neutrophiles sur la glace à Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 milieu supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal (v / v), 200 U de pénicilline / streptomycin, à une concentration de 10 x 10 6 cellules / ml jusqu'à utilisation. D'autres types de cellules peuvent être ensemencées 1-4 jours avant.
- Ajouter 2 x 10 5 (20 ul) de neutrophiles au centre d'une boîte à fond de verre 35 mm, étaler la goutte par addition de 50 ul de milieu et on incube à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre aux cellules d'adhérer.
- Ajouter 1 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) chauffé à 37 ° C contenant le MPO spécifique hydrazide inhibiteur de 4-aminobenzoïque (4-ABH, 10 M). MPO inhibiteurs non spécifiques, tels que l'azoture de sodium (5 mM), peuvent également être utilisés mais ont récemment été suggéré d'exercer des effets non spécifiques supplémentaires à pH 39.
- Monter le plat sur un microscope à fluorescence à grand champ équipé d'un système de chauffage C de 37 ° et un objectif de l'huile 40X. Incuber les cellules sans imagerie pendant 10 minutes pour permettre aux cellules et du matériel à équilibrer.
- Réglez les paramètres de microscope pour acquérir une image de transmission à champ lumineux [phaSE ou contraste d'interférence différentiel (DIC) si disponible] avec 440 nm ou 490 nm excitation et 535 nm émissions toutes les 30 secondes.
- Ajuster le temps d'exposition et la fréquence d'acquisition en fonction du système de microscope pour éviter trop de photoblanchiment et de phototoxicité et en fonction de la question posée expérimentales. Commencez acquisition d'image.
- Après 2 minutes, ajouter 10 x 10 6 (50 pi) zymosan opsonisé FITC vers le centre du plat. Ajuster cible: ratios de cellules en fonction du type de phagocyte et cible utilisée.
- Continuer imagerie pendant 30 min. Après 30 min d'interrompre l'acquisition time-lapse et commencer une minuterie. Déplacez la scène et capturer 10 ou plusieurs instantanés dans différents champs de vision à l'image d'autres phagosomes, tous à moins de 5 min.
3. étalonnage et de contrôle expériences
- Préparer les solutions d'étalonnage de pH (recettes sont décrites dans le Tableau 1) avant le jour de l'expérience et de geler en portions de 10 ml.Décongeler les solutions d'étalonnage et chaude à 37 ° C dans un bain d'eau. Vérifier le pH avec un pH-mètre et d'enregistrer le pH réel de solutions.
- Monter une pompe péristaltique sur le plat de fond de verre avant l'acquisition de l'image et effectuer la microscopie de la vidéo en direct, comme décrit ci-dessus (article 2).
- A la fin de la période d'acquisition de 30 min tourner sur la pompe pour éliminer la solution à l'intérieur de la cuvette, ajouter 1 ml de la première solution d'étalonnage et d'arrêter la pompe.
- Attendre que le signal se stabilise, habituellement de 5 min. Répéter l'opération avec chaque solution d'étalonnage.
- Effectuer au moins une calibration par jour expérimental, et étalonner en commençant par le plus haut et le pH de travail de manière séquentielle à la plus basse, ainsi que le pH de départ et de travail séquentiellement le plus bas vers le plus haut.
- A titre de témoin, ajouter 100 ul de 100 uM de l'inhibiteur de la NADPH oxydase diphényl propionium iodure (DPI) dilué dans du HBSS à 900 ul de cellules dans du HBSS dans le fond plat en verre, etincuber pendant 10 min.
- Commencez acquisition et ajouter zymosane comme ci-dessus (étape 2.7). Après 15 min de la phagocytose, ajouter 10 ul de 10 uM de l'inhibiteur V-ATPase concanamycin A (ConcA) dilué dans du HBSS et continuer imagerie pour 15 minutes supplémentaires.
4. Analyse
- Analyse des films time-lapse et instantanés phagosome.
Remarque: Les instructions suivantes sont spécifiques pour ImageJ. Étape par étape les instructions peuvent varier considérablement en fonction du logiciel utilisé, mais les fonctions décrites dans cette section sont disponibles dans la plupart des logiciels professionnels d'analyse d'image.- Ouvrez les images avec un logiciel professionnel d'analyse d'image. Soustraire le fond dans le canal 490 en dessinant un petit ROI carré avec l'outil de sélection de polygone carré dans une zone où il n'y a pas de cellules, et en cliquant sur Plugins> BG Soustraction de ROI. Ensuite, téléchargez le même retour sur investissement sur le canal 440 en cliquant sur Modifier> Sélection> Restaurer la sélection et répétez.
- Faire un rapport d'image 32 bits du canal 490 divisé par le canal 440 en cliquant sur Processus> Calculatrice de l'image ..., en sélectionnant les images appropriées dans les menus déroulants ci-Image1 et Image2, puis en sélectionnant 'Divide' dans le menu déroulant Opération et la vérification de la case à cocher de résultat de 32 bits (float).
- Modifiez la table de consultation codage couleur à un codage couleur ratio compatible en cliquant sur Image> Tables de recherche> arc RVB. Seuil de l'image de rapport pour éliminer 0 et l'infini pixels en cliquant sur Image> Réglages> Seuil .... Ajustez les barres de défilement pour que zymosane apparaît en rouge et cliquez sur Appliquer, faire que le jeu des pixels de fond à case Nan est sélectionné.
- Combinez ce ratio pile avec le canal champ lumineux en un composite multi-canal en cliquant sur Image> Couleur> Fusionner les couches, et en sélectionnant l'image lumineuse-champ dans le menu gris canal de la liste déroulante et le rapport d'image dans le menu déroulant de la voie verte, et la sélection de laGardez images source case à cocher. Numérisation des films time-lapse ou des instantanés pour déterminer les phagosomes doivent être analysés. Le canal champ lumineux est utile pour cela.
- Dessiner des régions d'intérêt (ROI) en utilisant l'outil de sélection de polygones ovale autour phagosomes, et les ajouter au gestionnaire de ROI en cliquant sur Analyse> Outils> Gestionnaire de ROI> Ajouter. Mesurer leur ratio d'intensité zymosane en cliquant sur Plus> Multi-mesures et de-la sélection de la ligne par un chèque-boîte de tranche.
- Pour les films time-lapse, piste phagosomes un à la fois en dessinant un retour sur investissement, en tapant Ctrl + M pour mesurer chaque point de temps, et en déplaçant le ROI lorsque cela est nécessaire pour suivre les valeurs d'intensité au fil du temps. Copiez les mesures de la fenêtre de résultats dans un tableur.
Remarque: L'analyse de 15 (5 cours à temps par expérience x 3) expériences indépendantes est idéal, mais plus ou moins peuvent être nécessaires en fonction de la variabilité observée. Sauvegarde des Rois est toujours recommandé. Certains logiciels permettent REGI d'imagestration et mise à jour dynamique de Rois, faciliter cette partie de l'analyse.
- Conversion de fluorescence à des valeurs de pH
- Mesurer le rapport 490/440 pour phagosomes dans les films time-lapse étalonnage comme décrit dans la section 4.1.
- Dans une feuille de calcul, tracer les valeurs de ratio au fil du temps, et de calculer les valeurs moyennes du ratio de tous les phagosomes dans le champ de vue (généralement, entre 5-20) à partir de 5 points dans le temps dans le milieu de la période de temps correspondant à chaque étalonnage de pH solution. (Voir aussi les boîtes rouges dans la figure 5A.)
- Tracer ces 490/440 valeurs de ratio moyen contre le pH mesurée réelle. Combinez au moins 3 étalonnages indépendants en un seul graphique. Utilisez un logiciel de statistique ou numérique pour effectuer une régression non linéaire (le meilleur de la courbe de forme), généralement à une équation sigmoïde.
Note: Par exemple, dans la figure 5B l'équation utilisée était une sigmoïde de Boltzmann [Y = Bottom + ((Haut-Bas)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], où les valeurs y sont les ratios 490/440, X sont les valeurs de pH et haut, en bas, les paramètres V50 et la pente sont calculées par le logiciel. - Utilisez l'équation obtenue pour transformer les valeurs du rapport au pH.
Remarque: Par exemple, sur la figure 5B l'équation obtenue pour la courbe d'étalonnage en présence d'azoture de sodium est 490/440 Ratio = 1,103 + [(2,89 à 1,103) / (1 + EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . La résolution de pH donne l'équation suivante: pH = 6,993 à 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))].
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Representative Results
Voici les résultats représentatifs pour une expérience où le phagosome pH de neutrophiles de souris primaires isolées de la moelle osseuse de type sauvage ou Hvcn1 - / - les souris ont été comparés. Pour une expérience réussie, il est important d'obtenir suffisamment phagosomes dans le champ de vision pendant toute la durée du film time-lapse, tout en évitant de trop nombreux phagosomes, qui sera ensuite plus difficile de segmenter lors de l'analyse d'image. La figure 1 montre des exemples de bonnes et de mauvaises confluencies. Pour les analyses en fonction du temps et de l'instantané, les particules de zymosan externes doivent être distinguées des phagosomes et exclus de l'analyse. La figure 2 illustre comment l'image à champ lumineux peut être utile pour aider à distinguer les particules de zymosan externes de phagosomes. La figure 3 montre des exemples de phagosome typique pH-temps des cours de type sauvage par rapport à Hvcn1 - / - La figure 4 illustre l'effet de l'ajout de l'inhibiteur de la NADPH oxydase DPI, qui se traduit par une acidification rapide, suivie de l'addition de l'inhibiteur V-ATPase ConcA, ce qui inverse l'acidification. Ces expériences peuvent être critiques à prouver que les sondes de pH-sensibles travaillent dans les phagosomes comme ils le devraient. Un étalonnage typique temps-cours est représentée à la figure 5, avec des rectangles qui indiquent la gamme de valeurs de rapport utilisés pour construire la courbe d'étalonnage. La figure 5 montre en outre comment teindre chloration par l'activité MPO peuvent influencer le intraphagosomal pH-réponse de FITC, soulignant le fait que les sondes peuvent réagir différemment que prévu dans le phagoso mal environnement et l'importance de l'étalonnage in situ.
Figure 1. appropriée confluence et cible: rapport de cellule Le panneau de gauche montre un exemple où la confluence cellulaire est trop rares et la cible:. Rapport de la cellule est trop faible, ce qui diminue la probabilité qu'un événement phagocytaire se produise dans le champ de vision. Le panneau du milieu montre un exemple où la confluence cellulaire est trop élevé et les cellules sont entassés. Dans ces conditions, les cellules peuvent ne pas avoir assez de place pour se déplacer et trouver leurs cibles, ou peut ramper sur l'autre analyse de décision plus difficile plus tard. Le panneau de droite montre une confluence cellulaire idéal et objectif initial: le rapport de la cellule, où de nombreuses cellules cibles et peut être vue et pourtant encore être clairement distingués les uns des autres. FITC-zymosan est représenté en vert et la barre d'échelle représente 10 um. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. phagosomes distinctifs et zymosane uningested. Le panneau de gauche montre une image lumineuse champ fusionnée et un ratio 490/440 FITC-zymosan, alors que le panneau de droite montre l'image à champ lumineux seul. Phagosomes (petites flèches vertes) peuvent être distingués des particules extérieures, qui soit ne co-localisent pas avec les cellules (à court flèche rouge) ou dont la fluorescence ne correspond pas avec un centre foncé (longue flèche rouge) entouré par un anneau lumineux, caractéristiques des phagosomes dans l'image à champ lumineux (flèches vertes). Les barres d'échelle représente 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Temps cours de Figure 3., le pH et rapport histogrammes moyennes de type sauvage et Hvcn1 - / -. Phagosomes neutrophiles (a) des cours à temps typiques de phagosomale pH montre que tandis que dans de type sauvage neutrophiles (bleu), le pH est neutre (ligne pointillée ) ou légèrement alcalin (trait plein) au cours des premiers points de temps après l'ingestion, les phagosomes de Hvcn1 - / - neutrophiles (rouge) peuvent soit alcalinisent (trait plein) ou acidifier (ligne pointillée). (B) Compilation des instantanés pris 30-35 minutes après l'addition de cibles permet à l'phagosomale moyenne de la population pH à être calculé à partir d'un grand nombre de phagosomes (type sauvage: n = 5/1898/383 et Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 / expériences phagosomes / cellules, des bars sont des moyennes ± SEM, NS non significatif). (C) Les histogrammes de FITC-zymosan ratios révèlent des différences dans phagosomale pH entre-type sauvage et Hvcn1 - / - neutrophiles. (Ce chiffre a été modifié à partir de [19], avec permission.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effets de l'inhibiteur de la NADPH oxydase DPI et V-ATPase inhibiteur ConcA sur phagosome pH. La pré-incubation à 10 uM DPI a donné lieu à une acidification rapide du phagosomes peu de temps après l'ingestion, qui a été inversée par l'addition de 100 nM ConcA (flèche). (Ce chiffre a été modifié à partir de [19], avec permission.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. pH étalonnage cours du temps et les effets d'inhibition sur la MPO étalonnage de FITC-zymosan. (A) Une courbe d'étalonnage typique de pH de intraphagosomal FITC zymosan. Boîtes rouges indiquent la plage de valeurs de rapport utilisées pour construire la courbe d'étalonnage. Les valeurs réelles de pH des solutions utilisées et les moments auxquels les solutions sont modifiés sont indiqués par des flèches. La courbe représente la moyenne de 10 phagosomes sein d'un même champ de vision. (B) Inhibition de la MPO avec l'azoture de sodium inhibiteur non spécifique (5 mM, MPO Inh) augmente la plage dynamique des réponses dépendant du pH FITC intraphagosomal zymosan. Points sont des moyennes ± SEM (Ce chiffre a été modifié à partir de [19], avec permission.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir la uneversion rger de ce chiffre.
| 1.1 | (2x) de base | |||||
| Tampons | Stock | Finale (1x) | Pour 500 ml (2x) | |||
| KCl | M 1 | 140 mm | 140 ml | |||
| MgCl 2 | M 1 | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | M 1 | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | M 1 | 20 mM | 20 ml | |||
| 1.2 | Tampons | Stock | Final(1 fois) | Objectif | ||
| MES | M 1 | 20 mM | pH 5,5 à 6,5 pour | |||
| HEPES | M 1 | 20 mM | pH 7,0 à 7,5 pour | |||
| Tris | M 1 | 20 mM | pH de 5,5 à 6,7 pour | |||
| NMDG | M 1 | 20 mM | pH 5,5 à 6,8 pour | |||
| 1.3 | Ionophores | Stock (EtOH à 100%) | Finale (1x) | |||
| Nigéricine | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mM | 5 pM | ||||
| 1.4 | Pour 50 ml | |||||
| pH | Base de 2x | Type de mémoire tampon | Tampon Vol. | Nigéricine | Monensin | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 6.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 6.5 | MES | 1 ml | 50 ul | 5 ul | ||
| 7.0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 8.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 9.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 ul | 5 ul | |
| Ajuster le pH avecKOH ou HCl | ||||||
Tableau 1. Recette pour la préparation des solutions d'étalonnage. 1.1) Recette pour préparer 500 ml d'une solution de base 2x. 1,2) Recette pour la préparation des différents tampons utilisés selon le pH de la solution d'étalonnage. 1.3) Recette pour la préparation des ionophores utilisés dans les solutions d'étalonnage. 1.4) Recette pour la préparation 50 ml de chaque solution d'étalonnage en utilisant la base, des tampons et des ionophores décrites dans 1,1-1,3.
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Discussion
Bien que plus de temps que d'autres méthodes, telles que la spectroscopie et FACS, qui emploient une stratégie similaire en utilisant un colorant sensible au pH couplé à des objectifs, mais mesurer le pH moyen d'une population de phagosomes, microscopie offre plusieurs avantages. La première est que interne et externe lié, mais pas intériorisé, les particules peuvent être aisément distingué sans avoir à ajouter d'autres produits chimiques, comme le bleu trypan ou des anticorps, pour étancher ou étiqueter particules externes, respectivement. La deuxième est que, suite à des cellules en temps réel permet aux chercheurs d'observer les multiples aspects du processus phagocytaire simultanée et ainsi effets sur la migration, de détection et de particules de liaison pourraient être facilement discernés ici, alors il pourrait être négligé avec des méthodes de la population. En outre, la synchronisation de l'ouverture de la phagocytose, souvent réalisée par des cellules de placer à 4 ° C, ce qui pourrait perturber d'autres événements de trafic due à un choc à froid 40,41, est past nécessaire que le temps zéro peut être discerné directement. En effet, lors de l'exécution microscopie en temps réel, cette technique de synchronisation de C à 4 ° C est déconseillée si les périodes de temps à proximité de l'ouverture de la phagocytose que la condensation qui se forme sur le fond de la boîte pendant le changement de température peut mélanger avec l'huile d'immersion objectif et capturer différences de température entre le plat et le réchauffement microscope composants peuvent provoquer des changements de discussion. Un troisième avantage vient du fait que phagosomes sont intrinsèquement hétérogène de plusieurs paramètres, y compris, mais sans s'y limiter, pH 42, et certains effets sur phagosome pH pourraient être plus subtil, de changer la distribution du phagosome pH plutôt que la population moyenne, a été montré à la figure 3. Ces observations peuvent donner un aperçu plus profond mécanistes dans la régulation de pH phagosome.
Dans la présente étude, FITC a été choisi comme le colorant sensible au pH de choix parce qu'il estbon marché, largement disponible, et a surtout un pKa de 6,5 avec une plage dynamique englobant pH 3 à 9 dans sa forme libre 37, qui correspondait à la gamme de pH initialement prévu de neutre à légèrement alcalin, selon des études antérieures 29,30. Plus récemment, une étude utilisant une sonde de pH différent appelé SNARF, qui a un pKa plus basique de 7,5, des valeurs de pH allant estimés inattendue 1-2 unités de pH plus alcalin à la fois de type sauvage et Hvcn1 - / - phagosomes neutrophiles 39. Ainsi, le choix du capteur de pH est un paramètre important à prendre en considération selon l'application. En principe, le procédé présenté ici peut être facilement adapté à l'emploi d'autres colorants sensibles au pH, tels que SNARF et 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine (BCECF), les dérivés dont les succinimidyl-ester sont facilement couplés à des particules telles que des amines contenant du zymosan. En effet, les capteurs ne sont pas nécessairement limités à des colorants fluorescents, comme ratiometprotéines sensibles au pH ric, un tel Sypher 43, pourrait être transduites et exprimées par des microorganismes. Plusieurs alternatives non-ratiométrique existent également, notamment la version rouge du colorant pHrodo, qui peut être utilisé en conjonction avec la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged protéines ou la protéine sensible au pH pHluorin. Toutefois, en raison des effets potentiellement importants que le milieu intraphagosomal dur peut avoir sur les colorants et les protéines qui y sont ciblées, ces sondes doivent être au minimum de sondes de pH combinée à peu sensibles devant être utilisés dans la dérivation d'un pseudo-rapport. Comme le montre la figure 5, les étalonnages expériences peuvent exposer les effets des dommages de colorant comme une plage dynamique réduite ou déformée. Sur le plan pratique, des expériences d'étalonnage ne sont pas toujours parfaits et peuvent être irréalisable à effectuer après chaque expérience. Par conséquent, les valeurs du rapport peuvent parfois tomber hors de la portée de l'étalonnage et de donner des valeurs impossibles lors de la conversion au pH. Il peut être approprIATE soit exprimer ces valeurs hors échelle que "plus / moins-que ou égal à" valeurs minimales pH étalonnage maximum et, ou d'exprimer toutes les valeurs que les ratios et estimation pH gammes que les ratios moyens représentent.
Comme l'a souligné par le DPI et contrôle ConcA, la production de ROS et l'activité V-ATPase sont les principaux facteurs qui déterminent phagosomale pH. En effet, dans de nombreuses situations, les changements dans les niveaux de production de ROS peuvent sous-tendre les différences dans phagosomale pH, en particulier dans les neutrophiles, et la mesure de la production de ROS phagosome et le pH vont souvent main dans la main. Un mot de prudence est que les deux médicaments prêtent aperçu de l'activité des enzymes qu'ils inhibent mais pas à leur emplacement dans la cellule. Les deux enzymes sont des complexes sous-unités multiples dont les composants individu doit trafic vers phagosomes 4, et leur manque d'activité sur phagosomes peut résulter de la traite ou d'assemblage des défauts plutôt que les effets directs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
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