Abstract
Fagositoz doğuştan gelen bağışıklık hücreleri öldürmek veya etkisiz yutulur malzeme veya antijen olarak sunmak ve adaptif immün yanıtları başlatmak için bakteri, apoptotik hücreler veya diğer yabancı partikülleri yutmak hangi aracılığıyla temel süreçtir. Fagozomların pH endomembranes ve proteolitik enzimler, fagositik vakuol bir parçalayıcı organele içine olgun izin olaylar aktivasyonu ile fizyon ya da füzyon düzenleyen kritik bir parametredir. Buna ek olarak, H + translokasyon diğer konakçı dokulara etkili bir öldürme için önemli ve sinyal olan reaktif oksijen türlerinin (ROS), yüksek seviyelerinin üretimi için gereklidir. Birçok hücre içi patojenler, phagosomal asitlenmesine sınırlayıcı fagosom biyoloji pH önemini vurgulayarak fagositik öldürmeyi yıkmak. Burada floresein izotiosiyanat (FITC) kullanılarak nötrofillerde phagosomal pH ölçmek için bir yöntem tarif rasyometrik fagositik targ olarak zimosan -etiketliets ve canlı hücre görüntüleme. Deney 490 nm'de uyarıldığında, ancak tek bir boyanın, yerine mutlak floresandan daha, bir pH bağımlı oranının sayılmasına olanak tanıyan, 440 nm'de uyarıldı olmadığında asidik pH ile söndürülür FITC, floresan özelliklerine dayanır. In situ boya kalibrasyonu ve gerçek pH değerlerine oranı dönüştürme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol, aynı zamanda temin edilmektedir. Onlar böyle ağartma olarak tedirginlikler daha az duyarlı olarak tek boya rasyometrik yöntemleri genellikle tek dalga boyu veya çift boya sözde rasyometrik protokollere üstün kabul edilir, ölçülen sinyali tahrif değişiklikleri, lazer varyasyonları ve düzensiz etiketleme, odak. Bu yöntem, kolaylıkla diğer fagositik hücre tiplerinde pH ölçmek için modifiye edilebilir ve zymosan atıl tanelerden canlı mikroorganizmalara, diğer herhangi bir amin içeren bir parçacık ile ikame edilmiş olabilir. Son olarak, bu yöntem, farklı pH aralıklarında ya da diğer phagosom karşı duyarlı olan diğer floresan probları faydalanmak için adapte edilebiliral faaliyetleri, bu fagozomların fonksiyonel görüntüleme için genel bir protokol yaparak.
Protocol
Etik Beyanı: Tüm hayvan manipülasyonları Cenevre Üniversitesi Hayvancılık Araştırma Komitesi kurallarına sıkı göre yapıldı.
Fagositik Hedeflerinin 1. Hazırlık
- 10 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) kurutularak zimosan 20 mg ekleyin. 10 dakika boyunca kaynar su banyosuna Vorteks ve ısı. 5 dakika boyunca 2.000 xg'de Serin ve santrifüj.
- Bir su banyo sonikatörü içinde 10 dakika için supernatant, 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon ve sonikasyon çıkarın. Iki adet 1,5 ml'lik tüplere 500 ul aktarın. 5 dakika boyunca 11.000 x g'de santrifüjleyin.
- 500 ul PBS ile yıkama tekrarlayın. Kaynatıldı zimosan donduruldu ve -20 ° C'de saklanır, bölünmüş olabilir.
- Taze CO 3 0,1 M Na-2 hazırlanan 500 ul, pH 9,3, yukarıdaki (aşama 1,2) iki kez zimosan yıkayın.
- Son yıkamadan sonra 490 ul süspanse. 10 mg 10 ul ekle / FITC dimetil sulfoxid içinde eritildi mle (DMSO), girdap, folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca çalkalanarak kuluçkalayın.
- Önce 0.5 mi DMSO + 300 ul PBS, daha sonra 0.5 ml DMSO + 450 ul PBS, o zaman sadece PBS sonra + 150 ul PBS, 0.5 ml DMSO, yukarıda tanımlandığı gibi (aşama 1,2) yıkama, bağlanmamış boya kaldırın.
- Bir hemositometre kullanılarak zymosan güvenin. 500 ul PBS, girdabına zimosan 1 ul ekleyin, o zaman merkezi ızgara üzerine yerleştirilen lamel karşılayan hemositometre odasına kenarına 10 ul ekleyin. 20X amacı ile donatılmış bir aydınlık alan mikroskop hemositometre monte edin.
- 16 kareler içeren sol üst köşesindeki odaklanın ve bir el taksitli sayacı kullanarak bu alandaki tüm zimosan parçacıkları saymak. Sağ alt köşede tekrarlayın. = Zymosan konsantrasyon / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml Sayısı: aşağıdaki denklem kullanılarak zymosan konsantrasyonunu hesaplayın. Etiketli zimosan donduruldu ve -20 ° C'de saklanır, bölünmüş olabilir.
- Etiketli zymosan wi opsonize100 seyreltme: 1 bir tavşan anti-zimosan antikor th. Vorteks ve 37 ° C su banyosu içinde 1 saat boyunca inkübe edilir. (Adım 1.2) yukarıdaki gibi 500 ul PBS ile yıkayın.
Not: zymosan sonra analiz daha zorlaştırabilir öbekler şeklinde eğilimi Sonikasyon yüksek, özellikle de opsonızasyonu sonra, tavsiye edilir. % 65 h / h sıçan ya da insan serumu ile Opsonizasyon alternatif olarak kullanılabilir. - Adımda 1,7-1,8 de tarif edildiği gibi, bir hemositometre kullanılarak zimosan Sayısı ve 100 x 10 6 parçacık / mL'ye seyreltilir. Örneğin tamamlayıcı veya opsonızasyonu gibi diğer fagositik uyarıcıları ile Opsonizasyon alternatif gerçekleştirilebilir.
2. Canlı Video Mikroskopi
- Başka bir yerde 38 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi primer fare nötrofil izole edin.
- Alternatif olarak, herhangi fagositik hücre türünü kullanın. Roswell Park Memorial Institute (RPMI),% 5 fetal dana serumu (hacim / hacim), 200 U penisilin / streptomyci ile desteklenmiş 1640 ortam içinde buz üzerinde tutun nötrofillerin, 10 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda kullanıma hazır olana kadar. Diğer hücre tipleri 1-4 gün önce, tohumlanabilir.
- , 35 mm cam alt çanağın merkezine nötrofillerin 2 x 10: 5 (20 ul) ilave edilir ortam 50 ul ekleyerek damla yayılması ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 mi belirli bir MPO inhibitörü 4-aminobenzoik hidrazid (4-ABH, 10 uM) ihtiva eden 37 ° C'ye ısıtıldı ekleyin. Sodyum azit (5 mM) gibi Spesifik olmayan MPO inhibitörleri de kullanılabilir, ancak yakın zamanda, pH 39 ek spesifik olmayan etkiler gösterir uygulamak için önerilmiştir.
- Bir 37 ° C ısıtma sistemi ve 40X petrol amacı ile donatılmış bir geniş açılı floresan mikroskop çanak monte edin. Hücreler ve ekipmanlar denge sağlamak için 10 dakika için görüntüleme hücrelere inkübe edin.
- Parlak-alan iletim görüntü elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın [phase ya da 440 nm ya da 490 nm eksitasyon ve 535 nm emisyonda, her 30 saniyede eğer varsa diferansiyel girişim kontrast (DIC)].
- Çok fazla photobleaching ve fototoksisite ve deneysel sorular bağlı olarak soruluyor önlemek için mikroskop sistemine göre pozlama süresini ve satın alma sıklığını ayarlayın. Görüntü elde etme başlayın.
- 2 dakika sonra, 10 x 10 6 (50 ul), FITC-zimosan çanak merkezine opsonize ekleyin. Kullanılan fagosit ve hedefin tipine bağlı olarak hücre oranlarını: Hedef ayarlayın.
- 30 dakika boyunca görüntülemeyi devam edin. 30 dakika sonra time-lapse edinimi durdurmak ve bir zamanlayıcı başlar. Sahne taşıyın ve 5 dakika içinde, görüntü diğer fagozomların bakış farklı alanlarda 10 veya daha fazla anlık yakalamak.
3. Kalibrasyon ve Kontrol Deneyleri
- Deney günü (tarifleri Tablo 1'de tarif edilmektedir), önceki pH ayarlama solüsyonlarının hazırlanması ve 10 ml'lik miktarlar halinde dondurma.Bir su banyosu içinde 37 ° C 'kalibrasyon çözümleri ve sıcak çözülme. Bir pH ölçer ile pH kontrol ve çözeltiler gerçek pH kaydedilir.
- Önceki görüntü alımı için cam alt çanak peristaltik bir pompa monte edin ve (bölüm 2) Yukarıda açıklandığı gibi canlı video mikroskopi gerçekleştirin.
- 30 dakika iktisap sürenin sonunda, yemeğin içindeki çözüm kaldırmak için pompa açın ilk kalibrasyon çözeltisinin 1 ml ekleyin ve pompayı durdurun.
- Sinyal genellikle 5 dakika stabilize kadar bekleyin. Her kalibrasyon çözeltisi ile tekrarlayın.
- Deney, günde en azından bir kalibrasyon gerçekleştirin ve yüksek pH ile başlayan ve en sıralı olarak çalışma, hem de düşük pH başlayarak ve en yüksek doğru ardışık çalışma kalibre edin.
- Bir kontrol olarak, cam alt tabak içinde 900 ul HBSS içinde hücreler, HBSS içinde seyreltilmiş 100 uM NADPH oksidaz inhibitörü difenil propionium iyodür 100 ul (DPI) ekleyin ve10 dakika inkübe edilir.
- Edinimi başlatın ve (adım 2.7) yukarıdaki gibi zymosan ekleyin. Fagositoz 15 dakika sonra HBSS içinde seyreltilmiş bir (conca) konkanamisin 10 uM V-ATPaz inhibitörü 10 ul ve 15 dakika daha devam görüntüleme.
4. Analiz
- Time-lapse film ve fagosom anlık analizi.
Not: Aşağıdaki talimatlar ImageJ için özeldir. Adım adım talimatlar kullanılan yazılım bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir, ancak bu bölümde anlatılan fonksiyonlar en profesyonel görüntü analiz yazılımı mevcuttur.- Profesyonel görüntü analiz yazılımı ile görüntüleri açın. Hiçbir hücreler vardır bir alanda kare çokgen seçim aracıyla küçük bir kare yatırım getirisi çizim ve ROI Eklentiler> BG Çıkarma tıklayarak 490 kanal arka plan çıkarın. Ardından> tıklayarak Düzen> Seçim 440 kanalda aynı yatırım getirisini yüklemek Seçme ve tekrarı geri yükleyin.
- Daha sonra Operasyonu açılır menüden 'Divide' seçerek, ... Süreç> Görüntü Hesaplama tıklayarak Image1 ve image2 açılır menülerden uygun görüntüleri seçerek 440 kanala bölünür 490 kanal 32-bit oranı görüntü olun ve 32-bit (float) sonuç check-kutusunu işaretleyerek.
- > Rainbow RGB Görüntü> Arama Tabloları tıklayarak bir oran ile uyumlu renk kodlama renk kodlama look-up tablosu değiştirin. Eşik oranı görüntü> Threshold> Görüntü tıklayarak 0 ve sonsuzluk piksel ortadan Ayarlanır .... NaN onay kutusunu Set arka plan piksel seçili olduğundan emin hale o zymosan kırmızı görünür, böylece kaydırma çubuklarını ayarlayın ve Uygula'yı tıklatın.
- Görüntü tıklayarak bir çok kanallı kompozit içine parlak alan kanalı ile bu oran yığını birleştirin> Renk> Kanallar Birleştirme ve gri kanal açılır menüden parlak alan görüntü ve yeşil kanal açılır menüden oran görüntüsünü seçme ve seçmeOnay kutusunu kaynak görüntüleri tutun. Time-lapse film veya fagozomların analiz edilmelidir belirlemek için anlık tarayın. Parlak alan kanal için yararlıdır.
- Ekle> fagozomların etrafında oval poligon seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgelerini çiziniz ve Analiz> Araçlar> ROI Yöneticisi tıklayarak ROI yöneticisi ekleyebilirsiniz. Daha fazla> Çok ölçün ve dilim onay kutusunun başına bir satır de-seçilerek tıklayarak kendi zymosan yoğunluk oranını ölçün.
- Time-lapse film için, parça her zaman noktasını ölçmek için Ctrl + M yazarak, bir yatırım getirisi çizim ve zamanla yoğunluk değerlerini izlemek için gerektiğinde yatırım getirisi hareket ettirerek bir seferde bir fagozomların. Bir elektronik tablo yazılımı içine Sonuçları penceresinde ölçümleri kopyalayın.
Not: bağımsız deneyler 15 (deney x 3 başına 5 zamanlı kurslar) Analizi ideal ama daha az ya da gözlenen değişkenlik bağlı gerekebilir olduğunu. İB'leri Tasarruf her zaman tavsiye edilir. Bazı yazılım paketleri izin görüntü regiStration ve İB'nin dinamik güncelleştirme, analiz bu bölümünü kolaylaştırmak.
- Floresans pH değerlerine Dönüşüm
- Bölüm 4.1'de açıklandığı gibi kalibrasyon time-lapse filmlerde fagozomların için 490/440 oranını ölçün.
- Elektronik tabloda zamanla oran değerlerini çizmek ve her pH kalibrasyonu karşılık gelen süre ortasında içinde 5 zaman noktalardan (5-20 arası, genellikle) görüş alanı içindeki tüm fagozomların ortalama oran değerlerini hesaplamak Çözelti. (Ayrıca Şekil 5A kırmızı kutuları bakın.)
- Gerçek ölçülen pH karşı bu ortalama 490/440 oranı değerlerini çizilir. Tek bir grafiğe içine en az 3 bağımsız kalibrasyon birleştirin. Genellikle sigmoid denkleme, doğrusal olmayan regresyon (en iyi uyum eğrisi) gerçekleştirmek için bir istatistik veya sayısal bir yazılım paketi kullanın.
Not: Örneğin, Şekil 5B'de kullanılan denklem Boltzmann sigmoidal oldu [Y = Taban + ((Top-Taban)/ (1 + EXP ((V50-X) / Eğim)) Y değerleri 490/440 oranları], X pH değerleri ve Üst, Alt, V50 ve eğim parametreleri yazılım tarafından hesaplanır vardır. - PH oranı değerleri dönüştürmek için elde edilen denklemi kullanın.
Not: Örneğin, Şekil 5B'de, sodyum azid mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisi için elde edilen denklem şöyledir 490/440 oranı = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 + EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . pH Çözme aşağıdaki denklemi sağlar: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1,178 / (Oran-1,103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıda bir deney için temsili sonuçlar olduğu takdirde burada yabani tip ya da kemik-iliğinden izole edilmiş primer fare nötrofil phagosomal pH Hvcn1 - / - farenin karşılaştırıldı. Başarılı bir deneme için, daha sonra görüntü analizi sırasında segmente daha zor olacaktır çok fagozomların, kaçınarak, time-lapse film tüm süresince görüş alanı içinde yeterli fagozomların elde etmek önemlidir. Şekil 1'de görüldüğü gibi İyi ve kötü confluencies örnekleri. Zamana bağlı ve anlık analizler için dış zymosan parçacıkları fagozomların ayırt ve analiz dışında olmalıdır. 2 aydınlık alan görüntüsü fagozomların dış zymosan parçacıkları ayırt yardımcı yararlı olabilir nasıl göstermektedir Şekil. Şekil 3 tipik fagozomun örneklerini gösterir Hvcn1 kıyasla, vahşi tip pH zaman içerisinde - / - Şekil 4, asitleştirme ters V-ATPaz inhibitörü conca, ilave edildikten sonra hızlı bir asitleştirme ile sonuçlanır NADPH oksidaz inhibitörü DPI, eklenmesinin etkisini gösterir. Bu tür deneyler, pH duyarlı problar olması gerektiği gibi fagozomların içinde çalıştıklarını kanıtlamak için kritik öneme sahip olabilir. Tipik bir kalibrasyon zaman süreci kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılan oran değerleri aralığını gösteren dikdörtgenler ile, Şekil 5'de temsil edilmiştir. Ilave olarak dikkat çeken, FITC intraphagosomal pH yanıtı etkileyebilir MPO aktivitesi ile klorlama boya gösterir Şekil 5 sondalar phagoso içinde beklenenden farklı tepki olabilir mal çevre ve yerinde kalibrasyon önemi.
Şekil 1. Uygun confluency ve hedef: hücre oranı, sol paneli hücre confluency çok seyrek ve hedef örneğini göstermektedir. Hücre oranı bir fagositik olay görüş alanı oluşacak ihtimalini azalan, çok düşüktür. Orta panel hücre kaynaşma çok yüksek ve hücreler, kalabalık bir örneği göstermektedir. Bu koşullar altında, hücrelerin taşımak ve onların hedefleri bulmak, ya da daha zor, daha sonra birbirlerine yapma analizi üzerinde sürünerek olabilir için yeterli yer olmayabilir. Birçok hücre ve hedefler görülmüş olabilir ve henüz hala açıkça her diğerinden ayırt edilmesi hücre oranı: sağ panel için ideal bir hücre confluency ve ilk hedef gösterir. FITC zymosan yeşil gösterilir ve ölçek çubuğu 10 mikron temsil eder. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sağ panel yalnız aydınlık alan görüntü gösterir, oysa Şekil 2. ayırt fagozomların ve uningested zymosan. Sol panel, birleştirilmiş parlak alan görüntü ve 490/440 FITC zymosan oranını gösterir. Fagozomların (küçük yeşil oklar) ya karakteristik olan floresan karanlık bir merkeze (uzun kırmızı ok) ile eşleşmeyen bir parlak halka ile çevrili hücreleri (kısa kırmızı ok) veya birlikte-lokalize co olmadığını, dış parçacıkların ayırt edilebilir aydınlık alan görüntüde (yeşil oklar) fagozomların arasında. Ölçek çubukları 10 um temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Zaman içerisinde, yabani tip ve Hvcn1 ortalama pH değeri ve oran histogramları - / -. Nötrofil fagozomların (A) phagosomal pH tipik zaman içerisinde gösteren vahşi tip nötrofil (mavi) ve pH nötr (kesikli çizgi ise ) ya da, Hvcn1 bölgesinin fagozomların alımından sonra erken zaman noktalarında içinde (katı hat), hafif alkali - / - nötrofil (kırmızı), ya alkalinize (düz çizgi) ya da) (kesikli çizgi asitleştirin olabilir. (B) anlık derlenmesi hedeflerin yanı sıra ortalama nüfus phagosomal pH fagozomların (vahşi tipte bir çok sayıda hesaplanabilir sağlar sonra 30-35 dakika alınan: n = 5 / 1898/383 ve Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 deneyler / fagozomların / hücreler, barlar ± SEM araçlar), önemli değil ns vardır. FITC zymosa (C) Histogramlar- / - nötrofiller n oranları Yabani tip ve Hvcn1 arasındaki phagosomal pH farklılıkları ortaya koymaktadır. (Bu rakam izni ile, [19] modifiye edilmiştir.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil phagosomal pH değerine NADPH oksidaz inhibitörü DPI ve V-ATPaz'ın önleyicisi conca 4. etkileri. 10 uM DPI Ön inkübasyon 100 nM conca (ok) ilavesi ile tersine kısa bir süre, yemek yedikten sonra fagozomların hızlı bir asitlenmesi ile sonuçlanmıştır. (Bu rakam izni ile, [19] modifiye edilmiştir.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. pH kalibrasyon süresi ders ve FITC zimosan kalibrasyonu üzerinde MPO inhibisyonunun etkileri. (A) intraphagosomal FITC-zimosan tipik pH kalibrasyon eğrisi. Kırmızı kutular kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılan oran değerlerinin aralığını gösterir. Kullanılan çözümler ve çözüm olarak değiştirildiği zaman fiili pH değerleri oklar ile belirtilmiştir. Eğri görüntüsü tek bir alan içinde 10 fagozomların ortalamasını temsil etmektedir. Spesifik olmayan inhibitör sodyum azit (5 mM, MPO İNH) ile MPO (B) inhibisyonu intraphagosomal FITC zimosan pH değerine bağımlı tepkiler dinamik aralığını arttırır. Nokta ± SEM araçlar (Bu rakam izni ile, [19] modifiye edilmiştir.) Olan a la görmek için buraya tıklayınızBu rakamın rger sürümü.
| 1.1 | (2x) Baz | |||||
| Tamponlar | Stok | Final (1x) | 500 ml (2x) için | |||
| KCI | 1 M | 140 mM | 140 mi | |||
| MgCI2 | 1 M | 1 mM | 1 mi | |||
| EGTA | 1 M | 0.2 mM | 0,2 mi | |||
| NaCl | 1 M | 20 mM | 20 mi | |||
| 1.2 | Tamponlar | Stok | Final(1x) | Amaç | ||
| MES | 1 M | 20 mM | pH 5,5-6,5 için | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM | pH 7,0-7,5 için | |||
| Tris | 1 M | 20 mM | pH 5,5-6,7 için | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM | pH 5,5-6,8 için | |||
| 1.3 | İyonoforlar | Stok (% 100 EtOH) | Final (1x) | |||
| Nigericin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mM | 5 uM | ||||
| 1.4 | 50 ml | |||||
| pH | 2x Tabanı | Tampon Tipi | Tampon Vol. | Nigericin | Monensin | |
| 5.0 | 25 mi | MES | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 5.5 | 25 mi | MES | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 6 | 25 mi | MES | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 6.5 | MES | 1 mi | 50 ul | 5 ul | ||
| 7,0 | 25 mi | HEPES | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 7.5 | 25 mi | HEPES | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 8.0 | 25 mi | Tris | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 8.5 | 25 mi | Tris | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 9,0 | 25 mi | Tris | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| 9.5 | 25 mi | NMDG | 1 mi | 50 ul | 5 ul | |
| Ile pH ayarlayınKOH veya HCI | ||||||
Kalibrasyon solüsyonlarının hazırlanması için Tablo 1. Tarif. Kalibrasyon solüsyonlarında kullanılan iyonoforlar hazırlanması için bir 2x baz çözeltisi, 500 ml hazırlamak için 1,1) Tarif. 1.2) kalibrasyon çözeltinin pH değerine göre kullanılan farklı tamponlar hazırlamak için tarifi. 1,3) Tarif. 1.4) 50 hazırlanması için Tarif 1.1-1.3 tarif tabanı, tamponlar ve iyonoforlar kullanarak her kalibrasyon çözeltisi ilave edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha fazla zaman hedefleri bağlanmış bir pH duyarlı boya kullanılarak benzer bir strateji geliştirerek, ancak fagozomların bir popülasyonunun ortalama pH ölçer gibi spektroskopi ve FACS gibi alternatif yöntemler, daha zaman alıcı olmakla birlikte, mikroskopi çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, iç ve dış içsel bağlı değil, diğer bir deyişle, partiküllerin kolayca sırasıyla gidermek ya da dış parçacıklar etiket, örneğin tripan mavisi ya da antikorlar gibi diğer kimyasallar eklemeye gerek kalmadan bir şekilde ayırt edilebilir. İkinci gerçek zamanlı hücreleri aşağıdaki araştırmacılar eşzamanlı ve nüfus tabanlı yöntemlerle gözden olabilir oysa bu yüzden göç, algılama ve bağlayıcı parçacıklar üzerindeki etkileri kolayca buradan ayırt edilebilir fagositik sürecinin birden yönlerini gözlemlemek için izin vermektedir. Buna ek olarak, fagositoz başlatma senkronizasyon, genellikle, herhangi bir nedeni, soğuk şoka 40,41 diğer olay ticareti karıştırmayı olabilir, 4 ° C'de, önceki yerleştirme hücreleri tarafından gerçekleştirilenSıfır zamanında gerekli t doğrudan ayırt edilebilir. Canlı mikroskobu yaparken Nitekim, bu 4 ° C senkronizasyon tekniği ve objektif daldırma yağı ile karıştırıp sıcaklık kayması sırasında yemeğin altına oluşturan yoğuşma olarak fagositoz başlaması yakın sürelerde yakalama eğer tavsiye edilmez Isınma çanak ve mikroskop bileşenleri arasındaki sıcaklık farkı odak vardiya neden olabilir. Bir üçüncü avantaj fagozomların olarak, dahil olmak üzere çeşitli parametrelere özünde, heterojen ancak pH 42, bunlarla sınırlı olmamak ve fagosom pH bazı etkileri phagosomal pH yerine ortalama nüfusun dağılımını değiştirerek, daha ince olabilir gerçeğinden kaynaklanmaktadır Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu gözlemler, phagosomal pH regülasyonu derin mekanik bakış açısı verebilir.
Bunun nedeni, bu çalışmada, FITC seçim pH duyarlı boya olarak seçildiucuz, yaygın olarak kullanılan, ve daha da önemlisi, bir dinamik alan önceki çalışmalarda 29,30 göre hafif alkalin nötr başlangıçta beklenen pH aralığını eşleşen serbest formda 37, 9, pH 3 kapsayan 6.5 bir pKa değerine sahiptir. Daha yakın zamanda, bir 7.5 daha temel pKa'ya, hem doğal tip ve Hvcn1 1-2 pH birimi daha alkali kadar beklenmedik bir şekilde tahmin pH değerlerine sahip SNARF adı verilen farklı bir pH sondasını, kullanıldığı bir çalışmada, - / - nötrofil fagozomların 39. Bu nedenle, pH sensörünün seçimi uygulamaya bağlı olarak dikkate alınması gereken önemli bir parametredir. Prensip olarak, burada sunulan yöntem kolayca-bis-7'SNARF ve 2 ', gibi diğer pH'a duyarlı boyalar, kullanılması için adapte edilebilir (2-karboksietil) -5- (ve-6) -carboxyfluorescein (BCECF), olan süksinimidil-ester türevlerinin kolayca zimosan gibi parçacıkları ihtiva eden amin kuple edilir. Gerçekten de, sensörler ratiomet gibi floresan boyalar ile sınırlı olması gerekmezric pH duyarlı proteinler, bir Sypher 43, kalıt aktarımlı ve mikroorganizmalar tarafından ifade edilebilir. Çeşitli olmayan rasyometrik alternatifler de, yeşil flüoresan proteini (GFP) ile bağlantılı olarak kullanılabilir boya pHrodo, ve özellikle kırmızı sürümü vardır proteinler veya pH'a duyarlı protein pHluorin etiketli. Bununla birlikte, sert bir intraphagosomal ortam içinde hedeflenen boyalar ve proteinler üzerinde sahip olabileceği potansiyel olarak büyük etkileri, bu problar, bir sözde-oranı türetilmesinde kullanılabilen pH duyarlı problar ile birlikte en az olmalıdır. Şekil 5 de gösterildiği gibi, kalibrasyon deneyler azaltılmış ya da bozuk dinamik aralığı olarak boya hasarı etkilerini açığa çıkarabilir. Pratik bir not, kalibrasyon deneyler her zaman mükemmel değildir ve her deneyde sonra gerçekleştirmek olanaksız olabilir. Sonuç olarak, oran değerleri bazen kalibrasyon aralığının dışında kalan ve pH dönüşüm üzerine imkansız değerleri verebilir. Bu appropr edilebilirbirine rahmetli maksimum ve minimum kalibrasyon pH değerleri, ya da oranları ve tahmini pH gibi tüm değerleri ifade etmek aralıkları "ile eşit veya daha büyük / daha az-" ortalama oranları temsil olarak bu off-ölçekli değerleri ifade eder.
DPI tarafından vurgulanan ve Conca kontrol gibi, ROS üretimi ve V-ATPaz aktivitesi phagosomal pH'ı belirleyen en önemli faktörlerdir. Nitekim, birçok durumda, ROS üretimi düzeylerinde değişiklikler, özellikle nötrofillerindeki, phagosomal pH farklılıkları temelinde yatan olabilir ve phagosomal ROS üretiminin ölçümü ve pH genellikle el ele gider. Bir uyarı iki ilacın da değil hücre içindeki konumu inhibe enzimlerin aktivitesi içgörü ödünç olmasıdır. Her iki enzim olan bireysel bileşenleri fagozomların 4, ve fagozomların faaliyet onların eksikliği trafik kaçakçılığı veya montaj hatalarına karşı yerine doğrudan etkilerinden kaynaklanabilecek gereken çok alt birim kompleksleri bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
