Abstract
Histondeacetylaser 1 og 2 (HDAC1,2) lokalisere de steder, hvor DNA-replikation. I den tidligere undersøgelse, under anvendelse af en selektiv inhibitor og en genetisk knockdown-system viste vi hidtil ukendte funktioner til HDAC1,2 i replikationsgaffel progression og spirende kromatin vedligeholdelse i pattedyrceller. Desuden har vi brugt en BrdU-chip-slot-vestlig teknik, der kombinerer kromatin immunoprecipitation (chip) af brom-deoxyuridin (BrdU) -mærket DNA med slot blot og vestlige analyser til kvantitativ måling af proteiner eller histon modifikation forbundet med spirende DNA.
Aktivt delende celler blev behandlet med HDAC1,2 selektiv inhibitor eller transficeret med siRNA'er mod HDAC1 og HDAC2 og nyligt syntetiserede DNA blev mærket med thymidinanalogen bromdeoxyuridin (BrdU). BrdU mærkning blev udført på et tidspunkt tidspunkt, hvor der ikke var nogen signifikant cellecyklusstop eller apoptose som følge af tab af HDAC1,2 funktioner. Efter labeling af celler med BrdU, kromatin immunofældning (chip) i histonacetylering mærker eller kromatin-remodeler blev udført med specifikke antistoffer. BrdU-mærkede input DNA og immunpræcipiteret (eller chiped) DNA blev derefter spottet på en membran ved hjælp af slot blot-teknik og immobiliseres ved hjælp af UV. Mængden af spirende DNA i hver slot blev derefter vurderes kvantitativt ved hjælp af Western-analyse med et anti-BrdU-antistof. Virkningen af tab af HDAC1,2 funktioner på niveauerne af nyligt syntetiserede DNA-associeret histonacetylering mærker og chromatin remodeler blev derefter bestemt ved at normalisere BrdU-chip signalet opnået fra de behandlede prøver til kontrolprøverne.
Introduction
Defekt DNA-reparation og / eller DNA-replikation er en væsentlig årsag til genom ustabilitet, hvilket kan udløse celledød. En enkelt udbedrede dobbeltstrengsbrud er tilstrækkelig til at forårsage celledød 1. Chromatin organisation er forbigående ændres under både replikation og reparation 2,3, og manglende evne til at opretholde epigenetisk oplysninger under disse processer vil resultere i en trussel mod genome integritet. Tab af HDAC3 eller HDAC1,2 funktion hindrer S-fase progression, DNA-replikation og reparation fører til genotoksisk stress (DNA-skade) og celledød 4-9. Det er derfor en praktisk strategi at anvende selektive HDAC-inhibitorer at forstyrre replikation, reparation og chromatin i cancerceller og forårsage DNA-skader, der på sin side kan stoppe vækst og inducere celledød selektivt i hurtigt voksende cancerceller.
Under DNA-replikation, er kromatin hurtigt adskilles og derefter samles efter DNA overlapning. Nyligt synthesized histon H4 er acetyleret på K5 og K12 rester (H4K5K12ac) og efter aflejring på kromatin, er de hurtigt deacetyleres af histondeacetylaser (HDAC) 10,11. Svigt i celler at opretholde spirende kromatin integritet ved histondeacetylering kan føre til sammenbrud gaffel, hvilket igen kan resultere i DNA-skader og celledød. Vi har for nylig vist, at selektiv hæmning af HDAC1,2 øger histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac og H4K16ac) og hæmmer SMARCA5 kromatin remodeler aktivitet på spirende kromatin, som korrelerer med reduceret replikation gaffel progression, øget gaffel sammenbrud og øget replikation stress-induceret DNA-skader 6 . Således kan HDAC inhibitor behandling ændrer spirende chromatinstruktur at udløse DNA-beskadigelse og død meget hurtigt i cancerceller, da disse celler cyklus hurtigt og passerer mange gange gennem S-fasen. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan HDAC'er funktion at regulere histonacetylering og protein binding at opretholde DNA-replikation i pattedyrceller.
Til kvantitativ måling af mængden af histonacetylering og SMARCA5 kromatin remodeler forbundet med spirende DNA under DNA-replikation, vi udtænkt en modificeret chip assay kaldet BrdU-chip-Slot-Western-teknikken. Efter chromatin immunoprecipitation (chip) af et ønsket protein eller histon modifikation, mængden af spirende DNA (mærket ved anvendelse thymidinanalog, BrdU) i chippen prøven kan detekteres under anvendelse western analyse af BrdU-mærkede chip DNA overført til en membran ved hjælp af et slot blot apparat. Med denne teknik, viste vi, at H4K16ac (et varemærke involveret i chromatin emballage) og ISWI familiemedlem SMARCA5 (SWI / SNF-relateret matrix-associeret actin-afhængig regulator af kromatin) chromatin remodeler er forbundet med spirende DNA i S-fase celler 6. Vi fandt også, at den spirende H4K16ac mærket deacetyleres af HDAC1,2 under DNA-replikation 6. H4K16ac hæmmerkromatin remodeler aktivitet ISWI familiemedlem SMARCA5 12. Derfor, ved hjælp af BrdU-CHIP-Slot-vestlig teknik, kunne vi slutte funktionerne for HDAC1,2 i reguleringen kromatin remodellering under DNA-replikation. Derfor er BrdU-chip-slot-Western Blot teknikken er en kraftfuld metode til kvantitativ måling de associerings- og dissociation dynamik proteiner eller deres post-translationelle modifikationer, der er bundet til spirende DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. chromatin immunpræcipitering (chip) efter BrdU Labeling
- Kultur NIH3T3-celler i nærværelse af enten DMSO eller HDAC1,2-selektive inhibitorer som beskrevet tidligere 6.
- Efter behandling med DMSO eller HDAC1,2 selektive inhibitorer, tilsættes BrdU til cellerne i en steril vævskultur hætte. Inkuber 2 x 10 6 NIH3T3 celler udpladet i 10 ml NIH3T3 medier med en 20 uM slutkoncentration på bromdeoxyuridin (BrdU) i 60 minutter i et sterilt 37 ° C vævsdyrkningsinkubator.
- Tværbinde intracellulære proteiner til DNA ved tilsætning af formaldehyd direkte til dyrkningsmediet ved en slutkoncentration på 1%. Inkuber 2 x 10 6 NIH3T3-celler med formaldehyd ved stuetemperatur i 10 minutter på et rysteapparat.
- Stands tværbinding ved tilsætning af glycin til en slutkoncentration på 125 mM. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter på et rysteapparat.
- Fjern mediet og indsamle celler i PBS i et 15 ml centrifugerør. Spin cells ved 956 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Vask cellepelleten to gange med iskold PBS. Fjern PBS fra røret. Opbevar tværbundet cellepellet uden PBS (supernatanten) ved -80 ° C indtil anvendelse.
- Forbered lysatet fra den tværbundne cellepellet ved tilsætning af 500 pi FA140 buffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 og 0,1% natriumdeoxycholat) suppleret med protease inhibitor cocktail.
- Forskyde kromatin ved sonikering prøverne fem gange på 35% effekt og med en 15 sek puls, 0,9 sek på og 0,1 sek off indstilling. Hold rørene på is efter hver runde af lydbehandling for at undgå opvarmning af prøverne.
- Kontroller klipning på en DNA gel som klipning effektiviteten vil variere mellem forskellige sonikatorer. For at kontrollere lydbehandling, omvendt crosslink ved at tilføje NaCl til en koncentration på 0,16 M og udføre trin 1.17.1. - 1.22. Run eluerede 10 pi DNA på en 1,5% agarosegel for at kontrollere, om forskydningen ermellem 300 - 700 bp med en gennemsnitlig intensitet på 500 bp.
- Efter ultralydsbehandling, centrifugeres prøverne i 10 minutter ved 17.949 xg ved 4 ° C og overføres supernatanten til et nyt rør.
- Udfør protein estimation under anvendelse af kommercielle proteinassaykit ifølge producentens protokol. Brug samme mængde lysat til chip med kontrol og eksperimentelle prøver. Generelt bruge 1 mg total lysat per chip reaktion.
- Forbered 50% opslæmning af protein A-agarose ved hjælp FA140 buffer indeholdende protease inhibitor cocktail. Tilføj 1/10 volumen af proteaseinhibitorcocktail. Beregn mængden af perler, der er nødvendige baseret på antallet af prøver i alt.
- Wash Protein A-agaroseperler med FA140 puffer to gange for at fjerne opbevaringsbufferen og der tilsættes samme volumen til FA140 buffer til perlerne for at gøre 50% opslæmning.
- For at fjerne proteiner, der ikke specifikt binder til perlerne, tilsættes 50 pi 50% opslæmning af protein A-agarose ogcubate prøverne ved 4 ° C under konstant ende-over-ende rotation i en mixer rotisserie i 30 minutter.
- Spin prøverne ved 956 xg ved 4 ° C i et minut. Opsaml supernatanten og udfør immunopræcipitation ved tilsætning enten 8 pi H4K16ac antistof eller 5 pi (5 ug) på 1 mg / ml SMARCA5 antistof til supernatanten. Der inkuberes ved 4 ° CO / N med konstant ende-over-ende rotation i en mixer rotisserie.
- Spar 1 / 10th af ekstraktet for "input" kontrol og indstille den som afsat ved -20 ° C. Indgangen skal være omvendt tværbundet sammen med IP prøver.
- Brug samme mængde kanin-IgG (5 pi 1 mg / ml) som negativ kontrol immunfældning prøve.
- Den følgende dag tilsættes 50 pi 50% protein A-agarose opslæmning til ekstrakten og inkuberes i 1 time ved 4 ° C med rotation.
- Pelletere agarosekugler ved centrifugering ved 956 xg i 2 min ved 4 ° C, fjern forsigtigt supernatanten og wash perlerne med følgende buffere sekventielt. I buffer præparater, tilsættes proteaseinhibitorer lige før brug.
- Vask med lav Salt immunkompleks vaskebuffer (FA140, slutkoncentration på 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 og 0,1% Natriumdeoxycholat) for 5 minutter ved 4 ° C med ende-over-ende rotation.
- Vask med High Salt immunkompleks vaskebuffer (FA500, slutkoncentration på 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 og 0,1% Natriumdeoxycholat) for 5 minutter ved 4 ° C med ende-over-ende rotation.
- Vask med LiCl immunkompleks vaskebuffer (slutkoncentration på 10 mM Tris-CI pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 og 0,5% Natriumdeoxycholat) i 5 minutter ved 4 ° C med ende-over-ende rotation.
- Efter vask som beskrevet ovenfor, tilsættes 200 pi elueringsopløsning (slutkoncentration på 1% SDS og 100 mM natriumbicarbonat) og incubate ved stuetemperatur i 15 minutter med ende-over-ende rotation ved stuetemperatur.
- Spin prøverne ved 956 xg ved stuetemperatur og overføre eluatet til et nyt 1,5 ml rør. Gentag trin 1.15 med yderligere 200 pi elueringsopløsning.
- Til 400 pi af eluatet, tilsættes NaCl til en koncentration på 0,16 M og bland godt.
- Desuden tilsættes 400 pi elueringsopløsning til 10 pi input, der blev sat til side (trin 1.11), og der tilsættes NaCl til en koncentration på 0,16 M til at vende tværbinde input prøver så godt. Reverse tværbinde prøverne ved inkubering i 65 ° C vandbad i 5 timer.
- Der tilsættes 1 ml 100% EtOH til reverse-tværbundet eluat. Bland godt og inkuber ved -80 ° C i 2 - 3 timer eller ved -20 ° CO / N. Spin prøverne ved 17.949 xg i 15 minutter og kassér ethanol.
- Tilføj 800 pi 70% ethanol til at vaske pelleten. Centrifugering ved 17.949 xg i 15 minutter ved 4 ° C og smid ethanol. Spin kort for at fjerne eventuel overskydende ethanol. Air-tørre prøverne ved 37 ° C i 10 min for at fjerne resterende ethanol.
- DNA i 90 pi RNase og DNase frit vand opløses og der tilsættes 2 pi 10 mg / ml RNase ved en 0,2 mg / ml slutkoncentration. Der inkuberes ved 37 ° C i vandbad i 30 minutter.
- Der tilsættes 10 pi 10x proteinase K Buffer (100 mM Tris-CI pH 8,0, 50 mM EDTA, pH 8,0, 5% SDS). Bland godt, og der tilsættes 1 ul proteinase K. Der inkuberes ved 42 ° C i 1 time.
- Oprense input og chip DNA under anvendelse af kommercielt PCR oprensningskit ifølge producentens protokol og eluere DNA i 50 pi vand. Store DNA ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
2. Slot blot-analyse af DNA chip
- Måle udbyttet af input og chip DNA elueret i 50 ul vand som beskrevet i trin 1.22 anvendelse af et spektrofotometer ved 280 nm i overensstemmelse med producentens protokol.
- Tag lige store volumener (50 ul) af input eller immunopræcipiterede DNA, der er inden for det lineære område for afsløring.
- For eksempel, hvis inputDNA-udbytte er 1,5 ng / pl, derefter tage 30 pi (eller 45 ng total DNA) og gøre volumen til 50 pi med vand. For faktor-chip, tage hele 50 pi eluatet fra trin 2.1 og fortsæt til trin 2.3.
- Denaturere 50 pi indgang eller immunpræcipiteret DNA ved tilsætning af 2,5 volumener 0,4 N NaOH, kort vortex og centrifugeres i 956 xg i 10 sek, og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Neutralisere denatureret DNA ved tilsætning af 175 pi 1 M Tris-HCI, pH 6,8, vortex, centrifugeres for 956 xg i 10 sek og placere prøverne på is.
- Forbered en seriel fortynding af input og immunopræcipiteret DNA til slot-blot-assay som beskrevet nedenfor.
- Følg trin 2.3 - 2.4 at få et samlet prøvevolumen på 350 pi (dvs. 50 pi Input / chip DNA, 125 pi 0,4 N NaOH, 175 pi 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
Bemærk: For eksempel anført ovenfor, vil 45 ng input DNA ender med at blive 0,129 ng / pl. - For input-DNA, mærke tre rørs til 100, 50 og 25, og der tilsættes 100 pi, 50 pi og 25 pi af denatureret og neutraliseret DNA-prøve. Gør slutvolumenet til 100 pi med nuclease-frit vand. For chip DNA, label tre rør som 200, 100 og 50, og der tilsættes 200 pi, 100 pi og 50 pi af det denaturerede og neutraliseret DNA-prøve. Gør slutvolumen til 200 pi med nuclease frit vand.
- Følg trin 2.3 - 2.4 at få et samlet prøvevolumen på 350 pi (dvs. 50 pi Input / chip DNA, 125 pi 0,4 N NaOH, 175 pi 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
- Skær membranen til størrelsen af slot blot-apparatet. Pre-våd membranen og blotting papirer i 20x SSC før og før tilsætning af DNA. Samle dem til slot blot apparat ifølge fabrikantens protokol.
- Pipet DNA fra trin 2.5.2 i passende slots. Påfør vakuum langsomt at trække DNA'et på zeta-probe-membran. Stop vakuum efter alle prøver har passeret gennem apparatet.
- Skil apparatet og straks immobilisere DNA'et på membranen ved anvendelse af UV-tværbinder. Har DNA opad i UV tværbinderen og bruge autocrosslink indstilling i tværbinderen. Følg producentens protokol.
- Detect BrdU på slot blot ved at udføre Western blotting.
- Blokere membranen med 5% fedtfri tørmælk i PBS indeholdende 0,1% Tween-20 (PBST) i 1 time ved stuetemperatur for at forhindre ikke-specifik binding af antistoffer til membranen.
- Tilføj primær anti-BrdU-antistof (1: 500 fortynding) fortyndet i 1% fedtfri tørmælk i PBST og inkuberes blottet med det primære antistof i 3 timer ved stuetemperatur på en ryster. Vask membranen med PBST tre gange, efter det primære antistof inkubation.
- Tilføj HRP-konjugeret anti-muse-sekundært antistof til blot (1: 5.000 fortynding) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Vask membranen med PBST tre gange, efter det sekundære antistof inkubation.
BEMÆRK: Brug tilstrækkelig volumen af antistofferne til helt at dække membranen under primære og sekundære antistofinkubationer.
- Forbered ECL mix og føje den til blot according til fabrikantens protokol. Inkuber membranen med ECL blanding i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Anbring membranen i en X-ray kassette, udsætte membranen for røntgenfilm og udvikle blottet under anvendelse af fabrikantens protokol.
- Kvantificere det opnåede signal for input og chiped DNA efter scanning blottene ved anvendelse af Image J software i overensstemmelse med producentens protokol. Til kvantificering, bruge det signal, der ligger inden for det lineære område for påvisning for at sikre nøjagtigheden af målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme specificiteten af HDAC1,2-selektive inhibitorer blev Hdac1,2 FL / FL og HDAC3 FL / FL fibrosarcomceller brugt. Adenovirusholdige Cre-rekombinase (Cre-Ad) blev anvendt til at slette Hdac1,2 og HDAC3 i disse celler. Efter Ad-Cre infektion af Hdac1,2 FL / FL celler, blev en solid stigning i H4K5ac observeret. Behandling af Hdac1,2 knockout celler med 233 eller 898 resulterede ikke i nogen yderligere stigning i H4K5ac bekræfter, at 233 og 898 hæmmer Hdac1,2 og ikke HDAC3 i disse celler. I modsætning hertil tilsætning af 233 eller 898 til HDAC3 knockout-celler resulterede i en signifikant stigning i H4K5ac forhold til stigningen ses i HDAC3 knockout-celler på grund af en additiv virkning på H4K5ac niveauer som følge af inhibering af Hdac1,2 og 3. Derfor 233 og 898 er HDAC1, 2-selektive inhibitorer. Disse resultater er vist iFigur 1.
For at validere BrdU-chip-teknik Slot blev BrdU-pulse chase analyse udført for at se på kinetikken af PCNA indlades til spirende DNA i HeLa-celler. Vores resultater viste, at PCNA association med spirende DNA sker hurtigt inden for 15 min, og forsvinder efter en 30 min jagt efter aftale med tidligere offentliggjorte resultater 13. Disse resultater er vist i figur 2.
BrdU-H4K16ac chip-Slot-Western-teknikken blev anvendt til at bestemme mængden af H4K16ac forbundet med spirende DNA i fravær af HDAC1,2 funktion. En robust berigelse i H4K16ac forbundet med spirende DNA blev observeret i sammenligning med kanin-IgG-kontrol (figur 3A og 3B). Stigningen i spirende DNA-associeret H4K16ac efter inhibering af HDAC1,2 aktiviteter eller knockdown af Hdac1,2 er vist i figur 3C 3D og 3E.
Niveauet af SMARCA5 kromatin remodeler på spirende DNA blev bestemt ved anvendelse BrdU-SMARCA5 chip-Slot-vestlige teknik. Vores resultater viste, at SMARCA5 associerede med spirende DNA i pattedyrceller. Desuden har HDAC1,2 hæmning eller knockdown af Hdac1,2 ikke ændre mængden af spirende DNA-associeret SMARCA5 chromatin remodeler som vist i figur 4.
Figur 1. Bekræftelse af specificitet HDAC1,2-selektive hæmmere. Western-analyse af helcellelysater fremstillet ud fra HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL eller HDAC3 FL / FL fibrosarcomaceller celler efter Ad-Cre-infektion og behandling med 898 eller233. Cellerne blev behandlet med 3 uM 898 eller 233 i 24 timer efter en 48 timers Ad-Cre-infektion. Dette tal stammer fra vores tidligere offentliggjorte arbejde 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Dynamics af PCNA Association med Nascent DNA i HeLa-celler. HeLa-celler blev mærket med bromdeoxyuridin (BrdU) i 30 minutter. Celler blev derefter vasket for at fjerne ikke-inkorporeret BrdU og dyrket i medier uden BrdU for angivne tidsperioder (chase). Kromatin immunofældning (chip) blev udført med anti-prolifererende celler (PCNA) antistof. BrdU mærkede DNA til stede i input DNA, og de er forbundet med PCNA blev vurderet i slot-blot-analyse under anvendelse af et anti-BrdU-antistof som vist i figur 2. Er Dette tal stammer fra vores tidligere offentliggjorte arbejde 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Tab af histondeacetylaseaktivitet 1 og 2 Øger H4K16ac på Nascent DNA. (AB) bromdeoxyuridin (BrdU) pulse chase blev udført i HeLa- og NIH3T3-celler for at bestemme associering H4K16ac med spirende DNA ved de angivne tidspunkter. (CD) NIH3T3-celler blev behandlet med enten DMSO eller en HDAC1,2-selektiv inhibitor (898 eller 233) i 24 timer. (E) NIH3T3-celler blev enten transficeret med ikke-målretning (NT) eller Hdac1,2 (H12) siRNA. Celler fra (C - E) blev mærket med BrdU og anvendestil chip med anti-H4K16ac efterfulgt af slot blotting. Membranen blev probet med anti-BrdU-antistof. Tal angiver til Image J kvantificering af den gennemsnitlige BrdU-signal med høj og medium volumen af chip-DNA spottet. Dette tal stammer fra vores tidligere offentliggjorte arbejde 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. SMARCA5 Associates med Nascent DNA. Mængden af SMARCA5 om spirende kromatin efter tab af HDAC1,2 funktion vises. NIH3T3-celler blev enten behandlet med et HDAC1,2-selektiv inhibitor (898) eller transficeret med ikke-targeting (NT) eller Hdac1,2 (H12) siRNA. Celler blev mærket med BrdU efter ovennævnte behandlinger og chip med anti-SMARCA5 eller kanin IgG (negativ Control) blev udført. Stigende mængder Chip DNA blev spottet på slot blot, og membranen blev probet med anti-BrdU-antistof. Dette tal stammer fra vores tidligere offentliggjorte arbejde 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet i dette manuskript protokol er et relativt hurtig metode til at påvise tilstedeværelsen af proteiner eller deres posttranslationelt modificerede former på nyligt replikeret eller spirende DNA. Desuden er denne teknik tillader én at måle associering-dissociationskinetikken af et protein eller sin ændrede form med spirende DNA. Denne teknik er et supplement til den elegante iPOND teknologi 13. I iPOND teknologi, er nyligt syntetiseret DNA mærket med ethyl deoxyuridin (edu). En biotin-konjugat tilsættes derefter på edu ved hjælp af et klik kemi. Biotin-mærkede spirende DNA derefter immunpræcipiteret under anvendelse streptavidinkugler og co-oprensning af proteiner detekteres ved western blotting. På den anden side, i vores BrdU-chip-slot-Western teknikken, er et protein eller sin ændrede form er forbundet med spirende DNA immunpræcipiteret under anvendelse af protein-specifikke eller modificeret form-specifikt antistof og mængden af BrdU-mærkede spirende DNA bundet til protein er then bestemt kvantitativt ved slot-Western blotting under anvendelse af et anti-BrdU-antistof.
Der er kritiske skridt i denne protokol, der kræver særlig opmærksomhed. Det er afgørende at sikre, at antistoffet af interesse fungerer godt i standard chip assays med en høj effektivitet. Det er vigtigt at teste effektiviteten af et antistof i chip assays ved kvantitativ PCR-før udførelse af BrdU-CHIP-Slot-Western assay. For at kvantificering af BrdU-CHIP-slot-Western teknik til at være korrekte, bør en seriel fortynding af BrdU-mærkede DNA anvendes på slot blot og western-analyse under anvendelse af anti-BrdU-antistof skal indledningsvis udføres med henblik på at bestemme det lineære område for påvisning. Bestemmelse af DNA-koncentration på chip og Input DNA gør det muligt at sikre, at mængden af BrdU-mærkede DNA er inden for det lineære område for detektion i Western blotting. For eksempel har vi bestemt 50 ng til 12,5 ng input-DNA til at være idet lineære område i vores pilotforsøg. Også, hvis koncentrationen af chippen prøver er meget høj, er det nødvendigt at fortynde chip DNA før udførelse slot. Begrænsningen af denne teknik er sin beslutning, som er afhængig af effektiviteten af kromatin klipning. Klipning af kromatin ved lydbehandling bestemmer nærhed af et bestemt protein eller sin ændrede form til den nyligt syntetiserede DNA.
I fortiden, studiet af ændringer i kromatin og kromatin-modificerende enzymer under DNA-replikation i pattedyrceller forblev et svært spørgsmål at tage fat på grund af den manglende adgang til egnede teknikker. Eftersom Hdac1,2-nul-celler standsning i G1-fasen, var det vanskeligt at undersøge funktionerne for Hdac1,2 inden S-fase. I vores undersøgelse viste vi funktioner for disse to HDAC'er under DNA-replikation ved hjælp af en kombination af første-in-class selektive inhibitorer til at hæmme deres aktiviteter inden for S-fasen og romanen BrdU-chip-Sparti-vestlige teknik. I fremtiden kan denne teknik også anvendes til at studere dynamikken af DNA-skade responset og DNA reparation proteiner på stå gaffel Ud over at studere de histon modifikationer og kromatin-modificerende enzym på gaflen. Desuden er denne teknik ikke begrænset til muse NIH3T3-celler. Denne teknik med held kan anvendes i andre cellelinjer med henblik på at undersøge, hvordan andre inhibitorer af enzymer eller proteiner påvirker DNA-replikation og replikation stress-induceret kromatin ændringer på replikationsgaflen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbejdet i dette manuskript blev støttet af midler fra Institut for Radiation Oncology og Huntsman Cancer Institute og National Institute of Health tilskud (R01-CA188520) til SB. Jeg takker Danielle Johnson og Steven Bennett i mit laboratorium for at demonstrere protokollen og forklare dens fordele. Jeg er taknemmelig for Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) til kritiske kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G.
- Alabert, C., Groth, A.
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
