Abstract
Histon deasetilaz 1 ve 2 (HDAC1,2) DNA replikasyonunun bölgelerine yerleşemez. Önceki bir çalışmada, seçici bir inhibitörü ve genetik demonte sistemi kullanılmasıyla, çoğalma çatala ilerlemesi ve memeli hücrelerinde doğmakta olan kromatin bakım HDAC1,2 için yeni fonksiyonlar göstermiştir. Ayrıca, yuva leke ile brom-deoksiüridin (BrdU) -etiketli DNA kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve Batı nicel doğmakta olan DNA ile ilişkili proteinler veya histon modifikasyonu ölçmek için analizler bir BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği kullanılmıştır.
Aktif bölünen hücreler HDAC1,2 selektif inhibitörü ile tedavi edilebilen veya HDAC1 ve HDAC2 karşı siRNA'lar transfekte edilmiş ve daha sonra, yeni sentezlenmiş DNA, timidin analog bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir edildi. Önemli bir hücre döngüsü tutuklama veya apoptozis varken BrdU etiketleme nedeniyle HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybına bağlı olarak bir zaman noktasında yapılmıştır. Aşağıdakı lBrdU histon asetilasyonu bakışı, Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) veya kromatin remodeler hücrelerin Abeling spesifik antikorlar ile gerçekleştirildi. BrdU etiketli giriş DNA çökeltilmiş (veya chiped) DNA daha sonra slot blot tekniği kullanılarak bir membran üzerine noktalar ve UV kullanılarak immobilize edildi. Her yuvaya doğmakta olan DNA miktarı, kantitatif bir anti-BrdU antikoru ile Western analizi kullanılarak değerlendirildi. Yeni sentezlenen DNA ile ilişkili histon asetilasyonu işaretleri ve kromatin Remodeler seviyeleri üzerindeki HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybı etkisinin daha sonra kontrol numunelerine ile muamele edilmiş örneklerde elde edilen BrdU-yongası sinyali normalize ederek belirlenir.
Introduction
Kusurlu DNA onarım ve / veya DNA replikasyon hücre ölümünü tetikleyebilir genom istikrarsızlık, önemli bir nedeni vardır. Tek onarılmamış çift iplikli sonu hücre ölümüne neden 1 için yeterlidir. Kromatin organizasyonu geçici, hem çoğaltma sırasında değişmiş ve 2,3 onarmak ve bu süreçlerin bütünlüğünü genom için bir tehdit neden olacaktır sırasında epigenetik bilgileri korumak için başarısızlık olduğunu. HDAC3 veya HDAC1,2 fonksiyon kaybı genotoksik strese (DNA hasarının) ve hücre ölümüne yol açan 4-9 S-faz ilerlemesi, DNA replikasyonu ve onarımı engellemektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde replikasyon, onarım ve kromatin bozabilir ve bu da büyümeyi durdurur ve hızlı bir şekilde büyüyen bir kanser hücrelerinde seçici hücre ölümünü teşvik DNA hasarına neden seçici HDAC inhibitörlerinin kullanımı pratik bir stratejidir.
DNA replikasyonu sırasında, kromatin hızla sökülüp ve daha sonra DNA çoğaltılması takip yeniden birleştirilen. Yeni synthesized histon H4 kromatinden üzerine K5 ve K12 kalıntılarının (H4K5K12ac) ve aşağıdaki birikimi asetillenebilir edilir hızla histon deasetilazların (HDAC'ler) 10,11 tarafından deasetile edilir. Histon deasetilasyonu ile oluşmakta olan kromatin bütünlüğünü korumak için hücrelerin hatası da, DNA hasarı ve hücre ölümüne neden olabilir çatal çöküşü, yol açabilir. Biz son zamanlarda HDAC1,2 selektif inhibisyonu artırır histon asetilasyonu (H4K5ac, H4K12ac ve H4K16ac) ve azaltılmış çoğaltma çatal ilerlemesi ile ilişkilidir doğmakta kromatin üzerinde SMARCA5 kromatin remodeler aktivitesini inhibe olduğunu gösterdi çatal çöküşü artmış ve çoğaltma strese bağlı DNA hasarı 6 arttı . Bu nedenle, HDAC inhibitörü tedavisi hızla bu hücrelerin döngüsü olarak, kanser hücrelerinde çok hızlı bir şekilde, DNA hasarı ve ölümü tetikleyebilir ve S-fazı yoluyla birçok kez geçmek için oluşmakta olan kromatin yapısını değiştirebilir. Bu HDAC'ler histon asetilasyonunu ve protein Bindi düzenleyen nasıl işlediğini anlamak önemlidirng memeli hücrelerinde DNA replikasyonu korumak için.
Kantitatif histon asetilasyonu ve DNA replikasyonu sırasında doğmakta olan DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını ölçmek için, bir modifiye ChIP tahlil BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği denilen geliştirmiştir. Bir yarık kullanılarak zar üzerine arzu edilen bir protein ya da histon modifikasyonu kromatin, immüno-çökeltme (chip) takiben, henüz olgunlaşmamış DNA miktarı BrdU etiketli yonga DNA batı analizi kullanılarak tespit edilebilir çips numunesi olarak (timidin analoğu BrdU ile işaretlenmiş) transfer Leke aygıt. Bu tekniği kullanarak, H4K16ac (kromatin paket yer alan bir marka) ve ISWI aile üyesi SMARCA5 (kromatin SWI / SNF ilişkili matris ile ilişkili aktin bağımlı regülatör) kromatin remodeler S-fazı hücrelerinde doğmakta olan DNA ile ilişkili olduğunu göstermiştir 6. Biz de doğmakta olan H4K16ac işareti DNA replikasyonu sırasında 6 HDAC1,2 tarafından deasetile olduğunu gördük. H4K16ac inhibeISWI aile üyesi SMARCA5 12 kromatin remodeler aktivitesi. Bu nedenle, BrdU-CHIP-Slot-Batı tekniği kullanılarak, DNA replikasyonu sırasında kromatin remodeling düzenlenmesinde HDAC1,2 işlevlerini bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, BrdU-çip-Slot Blot tekniği kantitatif oluşmakta olan DNA'ya bağlanan proteinlerin ya da bunların post-translasyonel modifikasyonlar, birleşme ve ayrılma dinamiklerini ölçmek için güçlü bir yaklaşım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BrdU Etiketleme aşağıdaki 1. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP)
- DMSO veya HDAC1,2 seçici önleyicileri, ya mevcudiyetinde kültür NIH3T3 hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi, 6.
- DMSO veya HDAC1,2 seçici inhibitörler ile işlendikten sonra, steril doku kültürü kaputu hücrelere BrdU ekleyin. Steril 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde 60 dakika için bromodeoksiüridin bir 20 uM nihai konsantrasyon (BrdU) ile 10 mi NIH3T3 ortamda kaplanmıştır 2 x 10 6, NIH3T3 hücreleri inkübe edin.
- % 1 bir son konsantrasyonda kültür ortamına doğrudan formaldehid eklenerek DNA çapraz bağ hücre içi proteinlerdir. Bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında formaldehid ile 2 x 10 6 NIH3T3 hücreleri inkübe edin.
- 125 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar glisinin eklenmesi ile çapraz bağlanma Quench. Bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Ortamı çıkarın ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne PBS içinde hücreleri toplamak. Spin cel4 ° C'de 5 dakika boyunca 956 x g'de ls. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez hücre pelletini yıkayın. Tüp PBS çıkarın. Kullanılana kadar -80 ° C'de PBS (süpernatant) olmadan çapraz bağlanmış hücre pelletini saklayın.
- 500 ul FA140 tamponu eklenerek çapraz bağlanmış hücre topağından lizat hazırlanması (50 HEPES KOH mM pH 7.5, NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat) proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiştir.
- Numuneleri% 35 güçte ve 15 sn darbesi ile beş kez, 0.9 sn ve 0,1 sn kapalı ayarı sonicating ile kromatin Kayma. Numunelerin ısınmasını önlemek için sonication her turdan sonra buz üzerinde tüpler tutun.
- Farklı sonicators arasında değişecektir kesme verimliliği gibi bir DNA jel üzerinde kesme kontrol edin. Sonikasyon kontrol etmek için, 0.16 M 'lik bir konsantrasyon NaCI eklenerek çapraz bağ ve ters adımları 1.17.1 gerçekleştirin. - 1.22. Run kesme olup olmadığını kontrol etmek için% 1.5 agaroz jel üzerinde 10 ul DNA yıkandı500 bp ortalama bir yoğunlukta bp 700-300 arasında.
- 4 ° C'de 17.949 x g'de 10 dakika süre ile sonikasyon santrifüj örnekleri takip eder ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.
- Imalatçının protokolüne göre, ticari protein tahlil kiti kullanılarak protein tahmin gerçekleştirin. Deney ve kontrol örneklerinin ChIP için lizatın eşit miktarda kullanın. Genellikle, ChIP reaksiyon başına toplam lizatın 1 mg kullanın.
- Proteaz inhibitörü kokteyli içeren FA140 tamponu kullanılarak protein A-agaroz% 50 bulamaç hazırlanır. Proteaz inhibitör kokteyli 1/10 hacim. Toplam numune sayısına göre gerekli boncuk hacmini hesaplayın.
- FA140 tamponu ile yıkayın Protein A-agaroz taneleri iki depolama tamponunu çıkarın ve% 50 bulamaç yapmak için tanelere FA140 tamponuna eşit hacmi ekleyin.
- , Spesifik olmayan boncuklara bağlanan proteinler kaldırmak Protein A-agaroz ve% 50 bulamaç 50 ul için30 dakika boyunca bir mikser içinde rotisserie sabit ucu-üzerinde uca döndürülerek 4 ° C'de örnekleri cubate.
- Bir dakika boyunca 4 ° C'de 956 x g'de örnekleri dönerler. Süpernatant toplayın ve 8 ul H4K16ac antikor veya süpernatana 1 mg / ml SMARCA5 antikorun 5 ul (5 ug) ya da eklenmesi ile imüno gerçekleştirin. Bir et lokantası mikserde sabit uç-over-end rotasyon ile 4 ° CO / N inkübe edin.
- 'Giriş' kontrol için ekstraktı 1 / 10th kaydedin ve kenara -20 ° C'de ayarlayın. Giriş IP örnekleri ile birlikte çapraz bağlanmış ters olması gerekmektedir.
- Negatif kontrol numunesi olarak immüno-tavşan IgG eşit miktarda (1 mg / ml 5 ul) kullanın.
- Ertesi gün, ekstraktı% 50 protein A-agaroz bulamacın 50 ul ve rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edilir.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 956 x g'de santrifüj ile agaroz boncuklar Pelet, dikkatli bir şekilde süpernatan ve wa kaldırmaardışık olarak, aşağıdaki tampon maddeleri ile boncuk sh. Tampon hazırlıkları ise, sağ kullanımdan önce proteaz inhibitörleri ekleyin.
- Düşük Tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA140 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 140 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C 'de 5 dak.
- Yüksek tuz İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ile yıkanır (FA500 pH 7.5 HEPES KOH 50 mM nihai konsantrasyona NaCl 500 mM, 1 mM EDTA (pH 8.0),% 1 Triton-X-100 ve% 0.1 sodyum deoksikolat içinde) için sonu aşırı uç rotasyon ile 4 ° C 'de 5 dak.
- LiCİ İmmun kompleksi Yıkama Tamponu ucu-üzerinde uç rotasyon ile 4 ° C 'de 5 dakika süre ile (Tris-Cl pH 8.0, LiCI 250 mM,% 0.5 NP-40 ve% 0.5 sodyum deoksikolat, 10 mM nihai konsantrasyon) ile yıkayın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi yıkama sonrasında, 200 ul yıkama çözeltisi ve incubat (% 1 SDS ve 100 mM sodyum bikarbonat nihai konsantrasyon) ekleyinoda sıcaklığında ucu-üzerinde uç rotasyon ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ör.
- Oda sıcaklığında 956 xg'de örnekleri Spin ve yeni bir 1.5 ml'lik tübe eluat aktarın. Ek 200 ul yıkama solüsyonu ile adımı yineleyin 1.15.
- Taşıma ürününden 400 ul için, 0.16 M 'lik bir konsantrasyon NaCI ekleyin ve iyice karıştırın.
- Buna ek olarak, bir kenara bırakıldı 10 ul girişi (adım 1,11) 400 ul yıkama çözeltisi eklenmekte ve hem de çapraz giriş örnekleri ters 0.16 M'lik bir konsantrasyona kadar NaCl ilave edin. 5 saat boyunca 65 ° C su banyosu içinde inkübe edilerek örnekleri çapraz bağlanması ters.
- Ters-çapraz bağlanmış, ayrılmış malzeme% 100 EtOH 1 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 2 için -80 ° C'de inkübe - 3 saat ya da -20 ° CO / N oranında. 15 dakika boyunca 17.949 x g'de örnekleri Spin ve etanol atın.
- Pelet yıkamak için 800 ul% 70 etanol ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17.949 x g'de Spin ve etanol atın. Herhangi bir kalıntı etanol çıkarmak için kısaca Spin. 1 için 37 ° C 'de numuneler hava-kurutun0 dakika geriye kalan etanolü atmak üzere.
- 90 ul RNase DNA ve DNaz serbest su içinde çözülür ve 0.2 mg / ml nihai konsantrasyonda 2 ul 10 mg / ml RNase ekleyin. 30 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C'de inkübe edin.
- 10 ul 10x Proteinaz K tamponu (100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 5 SDS) eklenir. İyice karıştırın ve 1 saat süre ile 42 ° C 'de 1 ul Proteinaz K inkübe ekleyin.
- Imalatçının protokolüne göre, ticari PCR saflaştırma kiti kullanılarak giriş ve yonga DNA saflaştınlır ve 50 ul su içinde elüt DNA. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın DNA arasında değişir.
2. Yuva yonga DNA bölgesinin Leke Analizi
- 280 değerinde bir spektrofotometre kullanılarak mil üreticinin protokolüne göre aşama 1,22 tarif edildiği gibi 50 ul su içinde elüt giriş ve yonga DNA verimini ölçün.
- Algılama lineer aralığında olan giriş eşit hacimlerde (50 | il) veya immünopresipitasyon DNA al.
- Örneğin, eğer girişDNA verimi 1.5 ng / ml, daha sonra (toplam DNA ng veya 45) 30 ul almak ve su ile 50 ul hacmi hale getirilmesidir. Faktör ChIP için Adım 2.1 tamamını 50 ul eluat alıp 2.3 adıma geçin.
- 0.4 N NaOH, kısa bir süre vorteks ve 10 saniye boyunca 956 x g'de santrifüj 2.5 hacmi eklenerek 50 ul giriş veya immünopresipitasyon DNA'yı denatüre ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 10 sn için 956 x g'de 1 M Tris-HCl, 175 ul, pH 6.8, girdap, santrifüj eklenerek denatüre DNA nötralize ve buz üzerinde örnekleri yer.
- Aşağıda tarif edildiği gibi Slot Blot analizi için bir giriş seri dilüsyonu ve immünopresipitasyon DNA hazırlayın.
- Adımları 2.3 takip - 350 ul toplam numune hacmi elde etmek için 2.4 (örneğin, 50 ul giriş / yonga DNA, 125 ul 0.4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCI, pH 6.8).
Not: Yukarıda belirtilen örnek için, giriş DNA 45 ng 0.129 ng / ml olarak sona erecek. - Giriş DNA, üç tüp etikets, 100, 50 ve 25 ve 100 ul, 50 ul ve denatüre edilmiş DNA, ve nötralize örnek 25 ul olarak. Nükleaz içermeyen su ile 100 ul son hacim sağlayın. ChIP DNA, etiket 200, 100 ve 50 ve 200 ul ekleyin üç tüp, 100 ul ve denatüre ve nötralize DNA örneği 50 ul. Nukleaz ücretsiz su ile 200 ul son hacim yapın.
- Adımları 2.3 takip - 350 ul toplam numune hacmi elde etmek için 2.4 (örneğin, 50 ul giriş / yonga DNA, 125 ul 0.4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCI, pH 6.8).
- Slot Blot düzeneğinin büyüklüğüne zar kesilir. Önce 20x SSC içinde membran ve kurutma kağıtları Öncesi ıslak ve DNA eklemeden önce. Üreticinin protokolüne uygun olarak slot blot cihazının içine monte edin.
- Uygun yuvalara adım 2.5.2 den Pipetleyin DNA. Zeta-prob zar üzerine DNA çekmek için yavaşça vakum uygulayın. Tüm numuneler aparatı sayesinde geçtikten sonra vakum durdurun.
- Aparat sökün ve hemen UV çapraz bağlayıcı kullanılarak zar üzerine DNA hareketsiz. UV çapraz bağlayıcı DNA tarafı yukarı ve au kullanınçapraz bağlayıcı ayarı tocrosslink. Üreticinin protokolü takip edin.
- Batı blotting gerçekleştirerek yuvası leke üzerinde BrdU Algılama.
- PBS içinde yağsız kuru süt,% 5 zara antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere, oda sıcaklığında 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (PBST) içeren bir membran bloke.
- Birincil anti-BrdU antikoru (1: 500 seyreltme) ilave PBST içinde% 1 yağsız kuru süt içinde seyreltilir ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 3 saat primer antikor ile leke inkübe edin. Primer antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın.
- Blot HRP-konjuge anti-fare ikincil antikor ekleyin (1: 5000 seyreltme) ile, 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. İkincil antikor inkübasyondan sonra PBST ile üç kez membran yıkayın.
NOT: Tamamen birincil ve ikincil antikor inkubasyon sırasında membran kapsayacak antikorların yeterli hacim kullanın.
- ECL karışımı hazırlayın ve leke ac eklemeküreticinin protokolüne kordlardan seçilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ECL karışımı ile membran inkübe edin.
- , Bir X-ışını kasetine membran yerleştirin X-ışını filmine maruz membranı ve üretici protokolü kullanılarak leke gelişir.
- Üreticinin protokolüne göre, Resim J yazılımı kullanılarak blot tarama sonra giriş ve chiped DNA için elde edilen sinyal, sayısal olarak. Nicelendirilmesi için, ölçüm doğruluğunu sağlamak amacıyla tespit doğrusal aralığı içindedir sinyali kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HDAC1,2 seçici önleyicileri özgüllüğünü belirlemek için, Hdac1,2 FL / FL ve HDAC3 FL / FL fibrosarkom hücreleri kullanıldı. Adenovirüs içeren Cre rekombinaz (Cre Ad-) bu hücrelerde Hdac1,2 ve HDAC3 silmek için kullanılmıştır. Hdac1,2 FL / FL ardından Ad-Cre enfeksiyonu Hücreler, H4K5ac sağlam bir artış gözlenmiştir. 233 ya da 898 ile Hdac1,2 knockout hücre tedavisi 233 ve 898, bu hücrelerde Hdac1,2 olup HDAC3 önlediğini teyit H4K5ac herhangi daha bir artış yoktu. Bunun aksine, HDAC3 nakavt hücrelere 233 ya da 898 eklenmesi Dolayısıyla bağlı Hdac1,2 inhibisyonu ve 3 sonucu H4K5ac düzeyde bir katkı maddesi etkisinden HDAC3 nakavt hücrelerde görülen artış ile karşılaştırıldığında H4K5ac önemli bir artış ile sonuçlanmıştır 233 ve 898 HDAC1, 2 selektif inhibitörleri bulunmaktadır. Bu sonuçlar gösterilmektedirŞekil 1.
HeLa hücrelerinde doğmakta olan DNA üzerindeki PCNA yükleme kinetik bakmak için BrdU ChIP-Slot tekniği, BrdU-darbe kovalamaca analizi yapılmıştır doğrulamak için. Bizim sonuçlarımız doğmakta olan DNA ile PCNA dernek 15 dakika içinde hızla ortaya çıkar ve daha önce yayınlanan sonuçlarla 13 ile anlaşarak 30 dakika kovalamaca sonra kaybolur gösterdi. Bu sonuçlar, Şekil 2'de gösterilmiştir.
BrdU-H4K16ac ChIP-Slot Batı tekniği HDAC1,2 fonksiyonunun yokluğunda doğmakta olan DNA ile ilişkili H4K16ac miktarını belirlemek için kullanılmıştır. Tavşan IgG kontrol (Şekiller 3A ve 3B) ile karşılaştırıldığında doğmakta olan DNA ile ilişkili H4K16ac bir sağlam bir zenginleşme gözlendi. HDAC1,2 faaliyetleri veya Hdac1,2 demonte inhibisyonu, aşağıdaki yeni oluşan DNA ile ilişkili H4K16ac artış Şekil 3C 'de gösterilmiştir 3D ve 3E.
Oluşmakta olan DNA üzerinde SMARCA5 kromatin Remodeler seviyesi BrdU-SMARCA5 ChIP Yuvalı Batı tekniği kullanılarak saptanmıştır. Sonuçlarımız, memeli hücrelerinde doğmakta olan DNA ile bu SMARCA5 ortakları göstermiştir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, ek, HDAC1,2 inhibisyon veya Hdac1,2 demonte olgunlaşmamış DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını değişmedi.
HDAC1,2 selektif inhibitörlerinin spesifiteye Şekil 1. teyidi. 898 ya da Ad-Cre enfeksiyonu ve tedaviden sonra HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL ve HDAC3 FL / FL fibrosarkoma hücrelerinden hazırlanan bütün hücre lizatlarının Batı analizi233. Hücreler 3 uM 898 ya da 48 saat Ad-Cre enfeksiyon sonrası 233 24 için saat ile muamele edilmiştir. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil HeLa hücrelerinde yeni oluşan DNA PCNA Association 2. Dinamik. HeLa hücreleri 30 dakika boyunca bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir. Hücreler daha sonra zaman belirtilen süreler (Chase) için BrdU olmayan unincorporated BrdU ve ortamında kültürlenmiştir çıkarmak için yıkandı. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) anti-proliferasyon hücre çekirdeği antijeni (PCNA) antikoru ile gerçekleştirilmiştir. Giriş DNA ve PCNA ile ilişkili mevcut BrdU etiketli DNA, bir anti-brd kullanılarak slot blot analizinde değerlendirildiŞekil 2'de görüldüğü gibi U antikor. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Histone Deacetylase 1 ve yeni oluşan DNA. (AB) bromodeoksiüridin (BrdU) darbe peşinde 2 artırır H4K16ac Şekil 3. kaybı, belirtilen zaman noktalarında oluşmakta olan DNA ile H4K16ac ilişkisini belirlemek için, HeLa ve, NIH3T3 hücrelerinde uygulandı. (CD) NIH3T3 hücreleri DMSO veya 24 saat boyunca, bir HDAC1,2-seçici bir inhibitör (898 veya 233) ile tedavi edildi. (E) NIH3T3 hücreleri, ya olmayan hedefleme (NT) veya Hdac1,2 (H12) siRNA ile transfekte edilmiştir. (C - E) alınan hücreler BrdU ile etiketlenir ve kullanılanAnti-H4K16ac ile ChIP için yuva lekeleme ile izledi. Membran, anti-BrdU antikoru ile problanmıştır. Sayılar benekli ChIP DNA yüksek ve orta hacimli ortalama BrdU sinyalinin Resim J kantitatif göstermek. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Nascent DNA SMARCA5 Associates. HDAC1,2 fonksiyon kaybı aşağıdaki olgunlaşmamış kromatin üzerinde SMARCA5 miktarı gösterilir. NIH3T3 hücreleri, ya bir HDAC1,2 selektif inhibitörü (898) ile muamele edilir ya da (NT) olmayan hedefleme ya Hdac1,2 (H12) siRNA ile transfekte edilmiştir. Hücreler, anti-SMARCA5 veya tavşan IgG'si ile yukarıda belirtilen tedavilerde ve yonga, aşağıdaki BrdU (negatif c ile etiketlenmişontrol) gerçekleştirildi. Yonga DNA artan miktarlar delikli benek tespit edildi ve zar, anti-BrdU antikoru ile problanmıştır. Bu rakam önceki yayınlanmış çalışmaları 6 türetilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda tarif edilen protokol, yeni çoğaltılmış ya da doğan DNA protein veya translasyon sonrası modifiye edilmiş formları varlığını göstermek için nispeten hızlı bir yöntemidir. Buna ek olarak, bu teknik, bir protein ya da doğan DNA ile değiştirilmiş bir biçiminin bağlanma-ayrılma kinetikleri ölçmek için bir olanak sağlamaktadır. Bu teknik zarif iPOND teknolojisi 13 tamamlayıcıdır. IPOND teknolojisinde, yeni sentezlenmiş DNA, etil deoksiüridin (edu) ile etiketlenir. Bir biyotin konjuge sonra tıklama kimyası kullanılarak edu üzerine eklenir. Biotin-etiketli olgunlaşmamış DNA daha sonra western blotting ile tespit edilir streptavidin boncuk ve birlikte temizleyici proteinleri kullanılarak imüno-çökeltilir. Diğer yandan, BrdU-chip-Yuva Batı tekniğinde, oluşmakta olan DNA ile bağlantılı bir protein ya da değiştirilmiş formdaki bir protein-spesifik ya da değiştirilmiş formunun özgü antikor ve bağlı BrdU etiketli oluşmakta olan DNA miktarı ile imüno-çökeltilir Protein then, bir anti-BrdU antikoru kullanılarak slot-Western blot ile kantitatif olarak belirlendi.
Özel dikkat gerektiren bu protokol kritik adımlar vardır. Bu ilgili antikor yüksek verimle standart bir çipli deneylerinde iyi çalıştığından emin olmak için önemlidir. Bu BrdU-CHIP-Slot-Batı tahlil yapmadan önce nicel-PCR ile ChIP deneyleri bir antikorun etkinliğini test etmek önemlidir. Doğru olduğu BrdU CHIP Yuvalı Batı tekniğin nicelendirilmesi için, BrdU ile işaretlenmiş DNA bir seri seyreltme, başlangıçta amacıyla yapılmalıdır yuvası blot ve anti-BrdU antikoru kullanılarak Batı analizine uygulanmalıdır algılama doğrusal aralığını belirler. Chip DNA konsantrasyonu belirlenmesi ve Giriş DNA BrdU ile işaretlenmiş DNA miktarı, Western blot saptanması lineer aralığında olmasını sağlamak için bir olanak sağlar. Örneğin, 50 olmak giriş DNA 12.5 ng ng tespitPilot deneyde doğrusal aralık. Çip sample konsantrasyonu çok yüksek ise de, bu yuva yapmadan önce yonga DNA seyreltilmesi zorunludur. Bu tekniğin bir sınırlama kromatin kesme etkinliği bağlıdır çözünürlüğü vardır. Sonikasyon ile kromatin kesme, belirli bir protein veya yeni sentezlenmiş DNA olan modifiye edilmiş bir formu yakınlığını tespit eder.
Geçmişte, memeli hücrelerinde DNA replikasyonu sırasında kromatin ve kromatin değiştirici enzimler değişikliklerin Çalışma, uygun teknikleri olmayışı nedeniyle adres için önemli bir sorun olarak kaldı. Ayrıca, G1 fazında Hdac1,2 boş hücreler tutuklanmasından bu yana, bu S-faz içinde Hdac1,2 işlevlerini incelemek için zordu. Çalışmamızda, S-faz ve yeni BrdU-ChIP-S içinde faaliyetlerini engellemek için ilk sınıfının seçici inhibitörlerinin bir arada kullanarak DNA replikasyonu sırasında bu iki HDAC'lerin fonksiyonları gösterdilot-Batı tekniği. Gelecekte, bu teknik, aynı zamanda çatal histon modifikasyonları ve kromatin modifiye enzim okuyan ek olarak durmuş çatal DNA hasar cevabı ve DNA onarım proteinlerin dinamiklerini incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik, fare NIH3T3 hücrelerinin ile sınırlı değildir. Bu teknik, başarılı bir enzim ya da proteinlerin diğer inhibitörleri, çoğaltma çatal DNA replikasyonunu ve çoğaltma stres ile indüklenen kromatin değişiklikleri etkiler araştırmak amacıyla diğer hücre çizgileri de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu yazıda iş Radyasyon Onkolojisi Bölümü ve Huntsman Kanser Enstitüsü ve SB Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü (R01-CA188520) fon tarafından desteklenmiştir. Ben protokol gösteren ve avantajlarını açıklayan benim laboratuvar Danielle Johnson ve Steven Bennett teşekkür ederiz. Ben yazının eleştirel yorumlar için Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Kanser Enstitüsü) müteşekkirim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G.
- Alabert, C., Groth, A.
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
