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Biology

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Published: January 14, 2016 doi: 10.3791/53647
Automatic Translation
1
1Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

Abstract

Histonas desacetilasas 1 y 2 (HDAC1,2) localizar a los sitios de la replicación del ADN. En el estudio anterior, el uso de un inhibidor selectivo y un sistema de caída genética, mostramos funciones novedosas para HDAC1,2 en la replicación del tenedor progresión y mantenimiento de la cromatina naciente en células de mamífero. Además, se utilizó una técnica de BrdU-chip-Slot-occidental que combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) ADN marcado con con slot blot y análisis Western para medir cuantitativamente las proteínas o modificación de las histonas asociadas con el ADN naciente.

Activamente células que se dividen fueron tratados con HDAC1,2 inhibidor selectivo o transfectadas con siRNAs contra HDAC1 y HDAC2 y luego ADN recién sintetizado se marcó con el análogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU). El etiquetado BrdU se realizó en un punto de tiempo cuando no había detención del ciclo celular o apoptosis significativa debido a la pérdida de las funciones HDAC1,2. Después de lAbeling de las células con BrdU, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) de las marcas de acetilación de histonas o la cromatina-remodelador se realizó con anticuerpos específicos. El ADN de entrada BrdU-etiquetado y la immunoprecipitated (o chiped) ADN fue descubierto en una membrana utilizando la técnica de transferencia de ranura y inmovilizaron utilizando UV. La cantidad de ADN naciente en cada ranura a continuación, se evaluó cuantitativamente utilizando el análisis de Western con un anticuerpo anti-BrdU. A continuación, el efecto de la pérdida de las funciones HDAC1,2 sobre los niveles de ADN asociado a histonas marcas de acetilación recién sintetizadas y remodelador de la cromatina se determinó mediante la normalización de la señal BrdU-Chip obtenido a partir de las muestras tratadas a las muestras de control.

Introduction

La reparación del ADN defectuoso y / o la replicación del ADN son una causa principal de la inestabilidad del genoma, lo que puede desencadenar la muerte celular. Una sola sin reparar rotura de doble cadena es suficiente para causar la muerte celular 1. Organización de la cromatina se altera transitoriamente tanto durante la replicación y la reparación de 2,3, y el fracaso para mantener la información epigenética durante estos procesos se traducirá en una amenaza para la integridad del genoma. Pérdida de HDAC3 o función HDAC1,2 impide la progresión de la fase S, la replicación y reparación del ADN que conduce a estrés genotóxico (daño en el ADN) y la muerte celular 4-9. Es por lo tanto una estrategia práctica para usar inhibidores de HDAC selectivos para interrumpir la replicación, reparación y la cromatina en las células cancerosas y causar daño en el ADN, que a su vez puede detener el crecimiento y la muerte celular selectivamente inducir en las células cancerosas que crecen rápidamente.

Durante la replicación del ADN, la cromatina se desmonta rápidamente y luego se vuelve a montar después de la duplicación del ADN. Recién syhistona H4 nthesized es acetilada en K5 y K12 residuos (H4K5K12ac) y después de la deposición sobre la cromatina, se deacetylated rápidamente por desacetilasas de histonas (HDAC) 10,11. El fracaso de las células para mantener la integridad de la cromatina naciente por desacetilación de histonas puede conducir al colapso tenedor, que a su vez puede dar lugar a daños en el ADN y la muerte celular. Recientemente hemos demostrado que la inhibición selectiva de HDAC1,2 aumenta la acetilación de histonas (H4K5ac, H4K12ac y H4K16ac) e inhibe la actividad smarca5 remodelador de cromatina en la cromatina naciente, que se correlaciona con una menor progresión de tenedor de replicación, aumentamos colapso tenedor y el aumento de la replicación del daño en el ADN inducido por el estrés 6 . Así, el tratamiento inhibidor de HDAC puede alterar la estructura de cromatina naciente para desencadenar el daño del ADN y la muerte muy rápidamente en las células cancerosas, ya que estos ciclo de las células rápidamente y pasar muchas veces a través de la fase S. Por tanto, es importante entender cómo las HDAC funcionan para regular la acetilación de histonas y proteínas binding para mantener la replicación del ADN en células de mamífero.

Para medir cuantitativamente la cantidad de acetilación de histonas y smarca5 remodelador de cromatina asociada con el ADN naciente durante la replicación del ADN, ideamos un chip de ensayo modificado llama la técnica de BrdU-chip-Slot-occidental. Después de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de una modificación de la proteína o histona se desea, la cantidad de ADN naciente (marcó usando análogo de la timidina, BrdU) en la muestra de chip puede ser detectado mediante análisis de Western de DNA chip BrdU marcado con transfirió a una membrana usando un Slot aparato Blot. Mediante esta técnica, se demostró que H4K16ac (una marca implicada en el embalaje de la cromatina) y el miembro de la familia ISWI smarca5 (actina dependiente regulador de la matriz asociada relacionada con el SNF SWI / de la cromatina) remodelador de cromatina se asocian con el ADN naciente en las células en fase S 6. También se encontró que la marca naciente H4K16ac se desacetila por HDAC1,2 durante la replicación del ADN 6. Inhibe H4K16acactividad remodelador de cromatina del familiar ISWI smarca5 12. Por lo tanto, utilizando la técnica de BrdU-CHIP-Slot-Western, podríamos conectar las funciones para HDAC1,2 en la regulación de remodelación de la cromatina durante la replicación del ADN. Por lo tanto, la técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot es un enfoque poderoso para medir cuantitativamente la dinámica de asociación y disociación de proteínas o sus modificaciones posteriores a la traducción que se unen al ADN naciente.

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Protocol

1. La cromatina immunoprecipitation (CHIP) después de etiquetado BrdU

  1. Cultura células NIH3T3 en presencia de DMSO o inhibidores selectivos HDAC1,2 como se describió previamente 6.
  2. Tras el tratamiento con inhibidores selectivos de DMSO o HDAC1,2, añadir BrdU a las células en una campana de cultivo de tejido estéril. Incubar 2 x 10 6 NIH3T3 células sembradas en 10 ml de medio NIH3T3 con una concentración final de 20 mM de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 minutos en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos estéril.
  3. Reticular proteínas intracelulares en el ADN mediante la adición de formaldehído directamente a los medios de cultivo a una concentración final de 1%. Incubar 2 x 10 6 células NIH3T3 con formaldehído a TA durante 10 min en un agitador.
  4. Se detiene la reticulación mediante la adición de glicina a una concentración final de 125 mM. Incubar a TA durante 5 min en un agitador.
  5. Quite el papel y recoger las células en PBS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento celular dos veces con PBS enfriado con hielo. Retirar PBS desde el tubo. Almacenar el sedimento celular reticulado sin PBS (el sobrenadante) a -80 ° C hasta su uso.
  6. Preparar el lisado del sedimento celular reticulado mediante la adición de tampón FA140 500 l (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) complementado con cóctel inhibidor de proteasa.
  7. Cortar la cromatina sonicando las muestras cinco veces en el poder el 35% y con un pulso de 15 segundos, 0,9 segundos encendido y 0,1 seg de ajuste. Mantener los tubos en hielo después de cada ronda de tratamiento con ultrasonidos para evitar el calentamiento de las muestras.
    1. Compruebe la esquila en un gel de ADN como la eficiencia esquila variará entre los diferentes sonicadores. Para comprobar la sonicación, invierta reticulación mediante la adición de NaCl a una concentración de 0,16 M y realizar los pasos 1.17.1. - 1.22. Run eluyó 10 l de ADN en un gel de agarosa al 1,5% para comprobar si el cizallamiento esentre 300-700 pb con una intensidad media en 500 pb.
  8. Tras la sonicación, las muestras de centrifugación durante 10 min a 17.949 xg a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
    1. Efectuar la estimación de proteínas usando el kit de ensayo de proteína comercial según el protocolo del fabricante. Utilice la misma cantidad de lisado de chip de control y las muestras experimentales. En general, use 1 mg de lisado total por reacción chip.
  9. Preparar suspensión al 50% de la proteína A-agarosa usando tampón que contiene FA140 cóctel inhibidor de proteasa. Añadir décima volumen del cóctel inhibidor de proteasa. Calcular el volumen de los granos necesarios basado en el número de muestras en total.
    1. Wash perlas de Proteína A-agarosa con tampón FA140 dos veces para eliminar el tampón de almacenamiento y añadir un volumen igual a tampón FA140 a las perlas para hacer suspensión al 50%.
    2. Para eliminar las proteínas que se unen no específicamente a las perlas, se añaden 50 l de suspensión al 50% de proteína A-agarosa y enCubate las muestras a 4 ° C con rotación constante de extremo sobre extremo en un mezclador asador durante 30 min.
  10. Haga girar las muestras a 956 xga 4 ° C durante un minuto. Recoger el sobrenadante y llevar a cabo la inmunoprecipitación mediante la adición de ya sea 8 l de anticuerpo H4K16ac o 5 l (5 g) de 1 mg / ml de anticuerpo smarca5 al sobrenadante. Se incuba a 4 ° CO / N con la rotación de extremo a extremo constante en un mezclador rotisserie.
  11. Guardar 1 / 10o del extracto para el control de "entrada" y configurarlo como un lado a -20 ° C. La entrada tiene que ser inversa reticulado junto con las muestras IP.
  12. Utilice una cantidad igual de IgG de conejo (5 l de 1 mg / ml) como la muestra negativa inmunoprecipitación control.
  13. El día siguiente, se añaden 50 l de 50% de proteína-A agarosa suspensión para el extracto y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con rotación.
  14. Pellet perlas de agarosa por centrifugación a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, retire con cuidado el sobrenadante y wash de las bolitas con los siguientes tampones secuencialmente. En los preparativos de amortiguamiento, añadir inhibidores de proteasas justo antes de su uso.
    1. Lavar con Sal complejo inmune tampón de lavado Low (FA140; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo.
    2. Lavar con elevado de sal complejo inmune Wash Buffer (FA500; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo.
    3. Lavar con LiCl complejo inmune tampón de lavado (concentración final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% de NP40 y 0,5% de desoxicolato de sodio) durante 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo.
  15. Después de lavados como se ha descrito anteriormente, añadir 200 l solución de elución (concentración final de 1% SDS y bicarbonato de sodio 100 mM) y incubate a TA durante 15 min con rotación de extremo a extremo a TA.
  16. Girar las muestras a 956 xg a TA y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 ml. Repita el paso 1,15 con una solución adicional de elución 200 l.
  17. Para 400 l de eluato, añadir NaCl hasta una concentración de 0,16 M y mezclar bien.
    1. Además, añadir solución de elución a 400 l 10 l de entrada que se había reservado (paso 1,11) y se añade NaCl a una concentración de 0,16 M para revertir muestras de entrada de reticulación también. Invierta entrecruzar las muestras mediante la incubación de 65 ° C baño de agua durante 5 horas.
  18. Añadir 1 ml de EtOH 100% al eluato reticulado inversa. Mezclar bien e incubar a 80 ° C durante 2-3 horas oa -20 ° CO / N. Haga girar las muestras a 17.949 xg durante 15 min y deseche etanol.
  19. Añadir 800 l 70% de etanol para lavar el pellet. Vuelta a 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar etanol. Girar brevemente para eliminar cualquier etanol residual. Seque las muestras a 37 ° C durante 10 min para eliminar el etanol residual.
  20. Disolver el ADN en 90 l de RNasa y DNasa libre de agua y añadir 2 l 10 mg / ml RNasa a un / ml de concentración final 0,2 mg. Se incuba a 37 ° C en baño de agua durante 30 minutos.
  21. Añadir 10 l de 10x proteinasa K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% de SDS). Mezclar bien y añadir 1 l de proteinasa K. Incubar a 42 ° C durante 1 hora.
  22. Se purifica ADN de entrada y chip usando kit comercial de purificación de PCR según el protocolo del fabricante y eluir ADN en 50 l de agua. ADN tienda a -20 ° C hasta su uso posterior.

2. Ranura Análisis de transferencia de ADN chip

  1. Medir el rendimiento de entrada y el ADN se eluyó en ChIP 50 l de agua como se describe en el paso 1.22 usando un espectrofotómetro a 280 nm de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. Tome volúmenes iguales (50 l) de la entrada o de ADN immunoprecipitated que están dentro del rango lineal de detección.
    1. Por ejemplo, si la entradaRendimiento de ADN es de 1,5 ng / l, luego tomar 30 l (o 45 ng de ADN total) y crea volumen de 50 l con agua. Para factor de chip, tome todo el eluato 50 l a partir del paso 2.1 y vaya al paso 2.3.
  3. Desnaturalizar 50 l de entrada o ADN inmunoprecipitado mediante la adición de 2,5 volúmenes de NaOH 0,4 N, vórtice brevemente y centrifugar durante 956 xg durante 10 seg, y se incuba a TA durante 30 min.
  4. Neutralizar la DNA desnaturalizado mediante la adición de 175 l de M Tris-HCl pH 6,8, 1, vórtice, de centrífuga de 956 xg durante 10 seg y colocar las muestras en hielo.
  5. Preparar una dilución en serie de entrada y el ADN inmunoprecipitado para el ensayo de transferencia en ranura como se describe a continuación.
    1. Siga los pasos 2.3 - 2.4 para obtener un volumen de muestra total de 350 l (es decir, 50 l de entrada / DNA chip, 125 l NaOH 0,4 N, M Tris-HCl 175 l 1, pH 6,8).
      Nota: Para la instancia se ha dicho, 45 ng de ADN de entrada va a terminar siendo 0.129 ng / l.
    2. Para ADN de entrada, etiquetar tres tubos como 100, 50 y 25 y añadir 100 l, 50 l y 25 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer que el volumen final de 100 l con agua libre de nucleasa. Para chip de ADN, la etiqueta tres tubos como 200, 100 y 50 y añadir 200 l, 100 l y 50 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer volumen final de 200 l con agua libre de nucleasa.
  6. Cortar la membrana con el tamaño del aparato de slot blot. Pre-humedecer la membrana y papeles secantes en 20x SSC antes y antes de añadir el ADN. Ensamblarlos en el aparato de slot blot de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  7. ADN Pipet desde el paso 2.5.2 en las ranuras apropiadas. Aplicar el vacío lentamente para sacar el ADN sobre la membrana zeta-sonda. Deje de vacío después de haber pasado todas las muestras a través del aparato.
    1. Desmontar el aparato e inmovilizar inmediatamente el ADN sobre la membrana utilizando un agente de reticulación UV. Tener el lado del ADN en el agente de reticulación UV y usar el autocrosslink establecer en el agente de reticulación. Siga el protocolo del fabricante.
  8. Detectar BrdU en el slot blot mediante la realización de Western Blot.
    1. Bloquear la membrana con 5% de leche seca no grasa en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 hora a RT para evitar la unión no específica de anticuerpos a la membrana.
    2. Añadir anticuerpo primario anti-BrdU (1: 500 dilución) diluido en 1% de leche seca no grasa en PBST y se incuba el blot con el anticuerpo primario durante 3 horas a RT en un agitador. Se lava la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo primario.
    3. Añadir anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con HRP a la blot (1: 5000 dilución) y se incuba a RT durante 1 hr. Lavar la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo secundario.
      NOTA: Utilice un volumen suficiente de los anticuerpos para cubrir completamente la membrana durante incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios.
  9. Preparar la mezcla de ECL y agregarlo a la ac blotacuerdo con el protocolo del fabricante. Incubar la membrana con la mezcla de ECL durante 5 min a RT.
    1. Colocar la membrana en un casete de rayos X, exponer la membrana a la película de rayos X y desarrollar el blot utilizando el protocolo del fabricante.
    2. Cuantificar la señal obtenida para la entrada y el ADN chiped después de escanear las manchas utilizando la imagen J software de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la cuantificación, utilizar la señal que está dentro del intervalo lineal de detección con el fin de asegurar la exactitud de la medición.

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Representative Results

Para determinar la especificidad de los inhibidores selectivos HDAC1,2, se utilizaron Hdac1,2 FL / FL y HDAC3 FL / FL células de fibrosarcoma. Se utilizó la recombinasa Cre (Ad-Cre) que contiene Adenovirus-eliminar Hdac1,2 y HDAC3 en estas células. Después de la infección Ad-Cre de Hdac1,2 FL / FL células, se observó un fuerte incremento en H4K5ac. El tratamiento de células knockout Hdac1,2 con 233 o 898 no dio lugar a ningún incremento adicional en H4K5ac confirmando que 233 y 898 inhiben Hdac1,2 y no HDAC3 en estas células. En contraste, la adición de 233 o 898 a las células knockout HDAC3 resultó en un aumento significativo en H4K5ac en comparación con el aumento observado en las células knockout HDAC3 debido a un efecto aditivo sobre los niveles de H4K5ac como resultado de la inhibición de la Hdac1,2 y 3. Por lo tanto, 233 y 898 son HDAC1, inhibidores de la 2-selectivos. Estos resultados se muestran en laFigura 1.

Para validar la técnica de BrdU-chip-Slot, se realizó un análisis de persecución BrdU pulso a mirar la cinética de PCNA carga en el ADN naciente en células HeLa. Nuestros resultados mostraron que la asociación de PCNA con el ADN naciente se produce rápidamente en los 15 minutos y desaparece después de una persecución de 30 minutos, de acuerdo con los resultados publicados previamente 13. Estos resultados se muestran en la Figura 2.

Técnica de BrdU-H4K16ac chip-Slot-occidental se utilizó para determinar la cantidad de H4K16ac asociado con el ADN naciente en ausencia de la función HDAC1,2. Se observó un enriquecimiento robusto en H4K16ac asociado con el ADN naciente en comparación con el control de IgG de conejo (Figuras 3A y 3B). El aumento de DNA asociada a H4K16ac naciente consecuencia de la inhibición de las actividades HDAC1,2 o desmontables de Hdac1,2 se muestra en la Figura 3C strong>, 3D y 3E.

El nivel de smarca5 cromatina remodelador de ADN naciente se determina usando-smarca5 BrdU técnica de chip-Slot-occidental. Nuestros resultados mostraron que los asociados smarca5 con ADN naciente en células de mamíferos. Además, la inhibición HDAC1,2 o desmontables de Hdac1,2 no cambiaron la cantidad de ADN naciente asociada a la cromatina smarca5 remodelador como se muestra en la Figura 4.

Figura 1
Figura 1. Confirmación de la especificidad de los inhibidores selectivos HDAC1,2. El análisis de Western de lisados ​​de células enteras preparadas a partir de HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL o células de fibrosarcoma HDAC3 FL / FL después de la infección Ad-Cre y el tratamiento con 898 o233. Las células se trataron con 3 M 898 o 233 durante 24 horas después de una infección Ad-Cre 48 hr. Esta cifra se deriva de nuestro anterior trabajo publicado 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Dinámica de la Asociación PCNA con el ADN naciente en células HeLa. Las células HeLa fueron etiquetados con bromodesoxiuridina (BrdU) durante 30 min. Las células fueron lavadas para eliminar no incorporado BrdU y se cultivaron en medios sin BrdU durante períodos de tiempo indicados (Chase). Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se realizó con el antígeno nuclear de células anti-proliferación (PCNA) de anticuerpos. BrdU ADN marcado presente en el ADN de entrada y los asociados con PCNA se evaluaron en el análisis slot blot usando un anticuerpo anti-BrdAnticuerpo T como se muestra en la Figura 2. Esta cifra se deriva de nuestro anterior trabajo publicado 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Pérdida de histona desacetilasa 1 y 2 aumenta H4K16ac sobre naciente de ADN. (AB) bromodesoxiuridina (BrdU) chase pulso se realizó en células HeLa y NIH3T3 para determinar asociación de H4K16ac con el ADN naciente en los puntos de tiempo indicados. (CD) las células NIH3T3 se trataron con DMSO o un inhibidor selectivo-HDAC1,2 (898 o 233) durante 24 h. Células (E) NIH3T3 fueron transfectadas ya sea con no-objetivo (NT) o Hdac1,2 (H12) siRNA. Las células de (C - E) fueron marcadas con BrdU y se utilizanpara chip con anti-H4K16ac seguido por transferencia de Slot. La membrana se sondeó con el anticuerpo anti-BrdU. Los números indican a J Imagen cuantificación de la señal media BrdU de alto y mediano volumen de ADN chip visto. Esta cifra se deriva de nuestro anterior trabajo publicado 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. smarca5 Asociados con ADN naciente. Se muestra la cantidad de smarca5 en cromatina naciente después de la pérdida de la función HDAC1,2. NIH3T3 células fueron tratados con un inhibidor-HDAC1,2 selectiva (898) o transfectadas con no-objetivo (NT) o Hdac1,2 (H12) siRNA. Las células fueron marcadas con BrdU después de los tratamientos antes mencionados y el chip con anti-smarca5 o IgG de conejo (c negativoontrol) se realizó. El aumento de los volúmenes de ADN chip fue descubierto en el slot blot y la membrana se probaron con anticuerpo anti-BrdU. Esta cifra se deriva de nuestro anterior trabajo publicado 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo se describe en este manuscrito es un método relativamente rápido para demostrar la presencia de las proteínas o sus formas modificadas post-traduccionalmente en el ADN recién replicado o naciente. Además, esta técnica permite que un para medir la cinética de asociación-disociación de una proteína o su forma modificada con el ADN naciente. Esta técnica es complementaria a la tecnología elegante ipond 13. En la tecnología ipond, ADN recién sintetizado se etiqueta con acetato de desoxiuridina (EDU). Un conjugado biotina se añade luego a EdU usando la química clic. ADN naciente biotina-etiquetados se inmunoprecipitó después usando perlas de estreptavidina y proteínas co-purificación son detectados por el Western Blot. Por otro lado, en nuestra técnica BrdU-chip-Ranura-Western, una proteína o su forma modificada asociada con el ADN naciente se inmunoprecipitaron usando específico de la proteína o anticuerpo-forma específica modificado y la cantidad de ADN naciente BrdU-marcado unido a la proteína es THen determinó cuantitativamente mediante transferencia Western-Slot utilizando un anticuerpo anti-BrdU.

Hay pasos críticos en este protocolo que requiere una atención especial. Es crítico para asegurar que el anticuerpo de interés funciona bien en ensayos de chip estándar con una alta eficiencia. Es importante probar la eficacia de un anticuerpo en ensayos de chip por cuantitativa-PCR antes de realizar el ensayo BrdU-CHIP-Slot-occidental. Para que la cuantificación de la técnica de BrdU-CHIP-Slot-Western para ser exactos, una dilución en serie del ADN marcadas con BrdU se debe aplicar a slot blot y análisis de Western usando el anticuerpo anti-BrdU se debe realizar inicialmente con el fin de determinar el intervalo lineal de detección. La determinación de la concentración de ADN de chip y ADN de entrada permite a uno para asegurar que la cantidad de ADN marcado con BrdU se encuentra dentro del intervalo lineal de detección en transferencia Western. Por ejemplo, se determinó 50 ng a 12,5 ng de ADN de entrada para estar enel rango lineal en nuestro experimento piloto. Además, si la concentración de las muestras de chip es muy alta, es imperativo para diluir el ADN chip antes de realizar ranura. La limitación de esta técnica es su resolución, que depende de la eficiencia de cizallamiento de la cromatina. El cizallamiento de la cromatina mediante sonicación determina la proximidad de una proteína dada o su forma modificada en el ADN recién sintetizado.

En el pasado, el estudio de los cambios en la cromatina y las enzimas modificadoras de la cromatina durante la replicación del ADN en células de mamífero se mantuvo una pregunta difícil de tratar debido a la falta de disponibilidad de técnicas apropiadas. Por otra parte, desde la detención células Hdac1,2 nulos en la fase G1, era difícil para examinar las funciones para Hdac1,2 dentro de la fase S. En nuestro estudio, mostramos las funciones de estos dos HDAC durante la replicación del ADN usando una combinación de inhibidores selectivos de la primera en su clase para inhibir sus actividades dentro de la fase S y la novela BrdU-chip-Slot-Western técnica. En el futuro, esta técnica también podría ser utilizado para estudiar la dinámica de proteínas de respuesta daño del ADN y de reparación del ADN en el tenedor estancado además de estudiar las modificaciones de las histonas y la enzima de modificación de la cromatina en el tenedor. Además, esta técnica no se limita a células NIH3T3 de ratón. Esta técnica puede utilizarse con éxito en otras líneas celulares con el fin de investigar cómo otros inhibidores de enzimas o proteínas afectan a la replicación del ADN y la replicación de cambios en la cromatina inducidos por el estrés en el tenedor de replicación.

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Acknowledgments

El trabajo en este manuscrito fue apoyada por fondos del Departamento de Oncología Radioterápica y el Instituto de Cáncer Huntsman y el Instituto Nacional de la concesión de la Salud (R01-CA188520) de SB. Doy las gracias a Danielle Johnson y Steven Bennett en mi laboratorio para demostrar el protocolo y explicar sus beneficios. Agradezco al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Instituto de Cáncer Huntsman) para comentarios críticos sobre el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU (westerns) BD Biosciences B555627
Anti-SMARCA5 Abcam ab3749
Anti-H4K16ac Active Motif 39167
Zeta-Probe GT Membrane Bio-Rad 162-0197
Formaldehyde Fisher BP531-500
Protein A agarose Millipore 16-156
Rnase A Qiagen 19101
Proteinase K Sigma P4850
PCR Purification Kit Qiagen 28106
Glycine Sigma G7403
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
BrdU Sigma B9285
Rabbit IgG  Millipore 12-370
HEPES Sigma H3375
NaCl Sigma S-3014
Triton-X-100 Sigma 93443
NP40 USB Corporation 19628
Sodium deoxycholate Sigma D6750
Sodium bicarbonate Sigma S-4019
Ethanol Decon Laboratories 04-355-222
DEPC-treated water Sigma 95284
Tris Fisher BP-152-5
EDTA Invitrogen 15575-020
SDS Ambion AM9820
Sodium hydroxide Mallinckrodt GenAR  MAL7772-06
20x SSC Life Technologies 15557-036
Non-fat dry milk Lab Scientific Inc M0841
ECL Thermo Fisher 80196
X-ray film Genesee Sci 30-101
Developer Konica Minolta SRX-101A
UV Crosslinker Stratagene XLE-1000
Sonicator Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor Model: 450
Centrifuge Eppendorf Model: 5810R
Water bath Fisher Scientific Isotemp Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer ThermoScientific Model: 1000
Slot Blot apparatus  Schleicher and Schuell Minifold II 44-27570
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Molecular Número 107 HDAC1,2 ADN naciente la replicación del ADN el genoma de estabilidad la cromatina inmunoprecipitación Cáncer BrdU slot blot las histonas cromatina contratista de remodelaciones y HDAC inhibidores
El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica
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Bhaskara, S. Examination of Proteins … More

Bhaskara, S. Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using BrdU-ChIP-Slot-Western Technique. J. Vis. Exp. (107), e53647, doi:10.3791/53647 (2016).

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