Abstract
히스톤 데 아세틸 라제 1 및 2 (HDAC1,2)는 DNA 복제의 사이트 지역화. 이전 연구에서, 선택적 억제제 및 유전자 녹다운 시스템을 이용하여, 우리는 복제 포크 진행 및 포유 동물 세포의 초기 염색질 HDAC1,2 유지에 대한 새로운 기능을 보였다. 또한, 우리는 슬롯 오 점 브로 모 옥시 우리 딘 (BrdU의) 표지 된 DNA의 염색질 면역 침전 (칩)을 결합과 서양의 정량적 초기 DNA와 관련된 단백질 또는 히스톤 변형을 측정하는 분석 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용했다.
적극적으로 분열하는 세포는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료 또는 HDAC1과 Hdac2에 대한 siRNA를 형질 도입 한 후 새로 합성 된 DNA는 티미 딘 아날로그 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)으로 표시 하였다되었다. 유의 한 세포주기 정지 또는 세포 자멸사가 없을 때의 BrdU 라벨링 인해 HDAC1,2 기능 상실 시점에서 이루어졌다. 다음 LBrdU의 히스톤 아세틸 마크, 크로 마틴 면역 (칩) 또는 염색질 인부와 세포의 abeling 특정 항체로 하였다. BrdU의 표지 된 DNA 입력 및 면역 침전 (또는 ChIPed) DNA는 슬롯 블랏 기술을 이용하여 막에 발견하고 UV를 이용하여 고정화시켰다. 각각의 슬롯에있는 초기 DNA의 양을 정량적으로는 항 BrdU의 항체로 웨스턴 분석을 사용하여 평가 하였다. 새로 합성 된 DNA 관련 히스톤의 아세틸 마크 및 염색질 인부의 레벨에 HDAC1,2 기능의 손실 효과는 대조 시료에 처리 된 시료로부터 얻어진 BrdU의 칩 신호를 정규화하여 측정 하였다.
Introduction
결함 DNA 수리 및 / 또는 DNA 복제는 세포 사멸을 유발할 수 게놈 불안정성의 주요 원인이다. 단일 수리되지 않은 이중 가닥 나누기 세포 사멸 원인 1에 충분하다. 염색질 조직은 일시적으로 모두 복제시 변경 및 2,3를 복구하고, 이러한 프로세스 무결성 게놈에 위협을 초래할 것 중에 후생 유전 학적 정보를 유지하기 위해 실패한다. HDAC3 또는 HDAC1,2 기능의 손실 유전자 독성 스트레스 (DNA 손상) 및 세포 사멸 4-9로 이어지는 S 상 진행, DNA 복제 및 수리를 방해한다. 따라서, 암 세포에서 복제, 보수 및 염색질을 방해 차례로 성장을 중지하고 급속 성장하는 암세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 DNA 손상을 유발하도록 선택 HDAC 억제제를 사용하는 실제적인 전략이다.
DNA 복제 동안 염색질 빠르게 분해 한 다음 DNA 복제 다음 조립. 새로 SYnthesized 히스톤 H4는 염색질에 K5와 K12 잔류 물 (H4K5K12ac) 및 다음 증착에서 아세틸, 그들은 빠르게 히스톤 아세틸 라제 (HDACs) 10, 11에 의해 탈 아세틸된다. 히스톤 탈 아세틸 화하여 초기 염색질의 무결성을 유지하기 위해 세포의 실패는 결과적으로 DNA 손상 및 세포 사망을 초래할 수 포크 붕괴로 이어질 수 있습니다. 우리는 최근, HDAC1,2의 선택적 억제가 증가 히스톤 아세틸 화 (H4K5ac, H4K12ac 및 H4K16ac) 감소 된 복제 포크의 진행과 관련이 초기 염색질에 SMARCA5 염색질 인부 활성을 억제하는 것으로 나타났다 포크 붕괴를 증가 및 복제 스트레스에 의한 DNA 손상 (6)을 증가 . 그러므로, HDAC 억제제 치료 빠르게 이러한 세포주기로서, 암세포에서 매우 빠르게 DNA 손상 및 사망을 유발과 S 상을 통해 여러 번 통과하는 초기 염색질 구조를 변경할 수있다. 그것은 HDACs는 히스톤 아세틸 화 단백질 BINDI을 조절하는 기능을하는 방법을 이해하는 것이 중요하다NG는 포유 동물 세포에서 DNA 복제를 유지한다.
정량적으로 히스톤 아세틸 화와 DNA 복제시 초기 DNA와 관련된 SMARCA5 염색질 인부의 양을 측정하기 위해, 우리는 수정 된 칩 분석이 BrdU의 칩 슬롯 지방 기술이라고 고안했다. 슬롯을 이용하여 막에 원하는 단백질 또는 히스톤 변형 염색질 면역 침전 (칩) 다음, 초기 DNA의 양의 BrdU 표지 된 칩 DNA의 웨스턴 분석을 이용하여 검출 할 수있다 칩 샘플 (티미 딘 유사체의 BrdU를 사용하여 표지)를 전송 오 장치. 이 기술을 사용하여, 우리는 H4K16ac (염색질 포장에 관련된 표시) 및 ISWI의 가족 SMARCA5 (염색질의 SWI / SNF 관련 매트릭스 관련 굴지 의존 레귤레이터) 염색질 인부가 S 상 세포에서 초기 DNA와 연관되어 있음을 보여 주었다 6. 우리는 또한 초기 H4K16ac 표시가 DNA 복제 6시 HDAC1,2에 의해 탈 아세틸 것으로 나타났습니다. H4K16ac의 억제ISWI의 가족 SMARCA5 (12)의 크로 마틴 인부 활동. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여, 우리는 DNA 복제시 염색질 리모델링을 조절하는 HDAC1,2의 기능을 연결할 수 있습니다. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 - 서쪽 오점 기술은 정량적으로 초기 DNA에 결합되어 단백질 또는 번역 후 변형의 연결 및 분리 역학을 측정 할 수있는 강력한 방법입니다.
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Protocol
BrdU의 레이블 다음 1. 염색질 면역 (칩)
- DMSO 또는 HDAC1,2 선택적 억제제 중 하나의 존재 하에서 배양 NIH3T3 세포는 이전에 기술 된 바와 같이 6.
- DMSO 또는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료에 따라, 멸균 조직 문화 후드에있는 세포에 BrdU의를 추가합니다. 멸균 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 60 분 동안 브로 모데 옥시 우리 딘의 20 μm의 최종 농도 (BrdU의) 10 ml의 NIH3T3 미디어에 도금 2 × 10 6 NIH3T3 세포를 품어.
- 1 %의 최종 농도로 배양 배지에 직접 포름 알데히드를 첨가하여 DNA에 가교 결합은 세포 내 단백질. 진탕 기에서 10 분간 실온에서 포름 알데히드와 2 × 106 NIH3T3 세포를 배양한다.
- 125 mM의 최종 농도로, 글리신의 첨가에 의해 가교 급랭. 쉐이커에 5 분 동안 실온에서 품어.
- 용지를 제거하고 15 ml의 원심 분리기 튜브에 PBS에 세포를 수집합니다. 스핀 CEL4 ℃에서 5 분 동안 956 XG에 LS. 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세포 펠렛을 씻으십시오. 튜브에서 PBS를 제거합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 PBS (뜨는)없이 가교 세포 펠렛을 저장합니다.
- 500 μL의 FA140 버퍼를 첨가하여 가교 결합 된 세포 펠렛으로부터 분해물을 제조 (50 HEPES KOH mM의 pH가 7.5의 NaCl 140 mM의, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100, 0.1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트) 프로테아제 억제제 칵테일로 보충.
- 샘플 35 %의 전력에서와 15 초 펄스로 5 회에 0.9 초, 0.1 초 Off 설정을 초음파 처리하여 염색질 전단. 샘플의 가열을 방지하기 위해 초음파의 매 라운드 후 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 다른 sonicators 사이에 달라집니다 전단 효율성 DNA 젤에 전단을 확인합니다. 초음파를 확인하려면, 0.16 M의 농도로 염화나트륨을 첨가하여 가교 역 및 단계 1.17.1를 수행합니다. - 1.22. 실행 전단인지 확인하는 1.5 % 아가 로즈 겔상에서 DNA를 10 ㎕의 용출500 BP의 평균 강도 BP 300-700 사이.
- 4 ° C에서 17,949 XG에 10 분 동안 초음파, 원심 분리기 샘플에 따라 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질의 추정을 수행. 제어 및 실험 샘플 칩 해물의 동일한 양을 사용합니다. 일반적으로, 칩 반응 당 총 해물의 1 밀리그램을 사용합니다.
- 프로테아제 저해제 칵테일을 포함 FA140 버퍼를 사용하여 단백질 A 아가 로스의 50 % 슬러리를 제조. 프로테아제 억제제 칵테일의 1/10 볼륨을 추가합니다. 총 샘플들의 수에 기초하여 필요한 비드의 체적을 계산한다.
- FA140 버퍼 씻을 단백질 - 아가로 오스 비즈 두 번 저장 버퍼를 제거하고 50 %의 슬러리를 만들기 위해 구슬로 FA140 버퍼에 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다.
- 비 특이 비드에 결합 된 단백질을 제거 단백질 - 아가 및 50 %의 슬러리를 50 μL를 추가하려면30 분 동안 로티 세리 혼합기에서 일정한 엔드 오버 엔드로 회전을 4 ° C에서 샘플들을 cubate.
- 분 동안 4 ° C에서 956 XG에서 샘플을 스핀. 상층 액을 수집하고 8 μL H4K16ac 항체 또는 상층 액을 1 ㎎ / ㎖ SMARCA5 항체의 5 μL (5 μg의)를 추가하여 면역을 수행합니다. 불고기 믹서에 일정 엔드 오버 엔드 회전 4 ° CO / N에 품어.
- '입력'컨트롤에 대한 추출물의 1 / 10을 저장하고 옆으로 -20 ° C에서 설정합니다. 입력은 IP 샘플과 함께 가교 역방향 할 필요가있다.
- 음성 대조군 면역 샘플로 토끼의 IgG의 동일한 양 (1 ㎎ / ㎖의 5 μL)를 사용합니다.
- 다음날, 추출물 50 % 단백질 - 아가 로스 슬러리의 50 μL를 추가 한 4 회전 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
- 4 ℃에서 2 분 동안 956 XG에서 원심 분리하여 아가 로스 비드 펠렛, 조심스럽게 상층 액과 워싱턴을 제거순차적으로 다음 버퍼로 구슬을 쉬. 버퍼 준비에서 바로 사용하기 전에 프로테아제 억제제를 추가합니다.
- 낮은 소금 면역 복합체 세척 버퍼로 세척 (FA140, pH가 7.5 HEPES KOH의 50 mm의 최종 농도의 NaCl 140 밀리미터, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의)에 대한 엔드 오버 엔드 회전 4 ℃에서 5 분.
- 높은 소금 면역 복합체 세척 버퍼로 세척 (FA500, pH가 7.5 HEPES KOH의 50 mm의 최종 농도의 NaCl 500 밀리미터, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의)에 대한 엔드 오버 엔드 회전 4 ℃에서 5 분.
- LiCl을 면역 복합체 세척 버퍼 엔드 오버 엔드 회전 4 ° C에서 5 분 (트리스 (CL)의 pH 8.0, LiCl이 250 밀리미터, 0.5 % NP40 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의 10 mm의 최종 농도)로 세척.
- 전술 한 바와 같이 세척을 따르면, 200 ㎕의 용출 용액 incubat (1 % SDS, 100 mM의 중탄산 나트륨을 최종 농도)을 추가RT에서 엔드 오버 엔드 회전에 실온에서 15 분 동안 전자.
- 실온에서 956 XG에서 샘플을 스핀과 새로운 1.5 ML 튜브에 용출액을 전송합니다. 추가 200 μL 용출 용액과 단계를 반복 1.15.
- 용출액을 400 μL, 0.16 M의 염화나트륨 농도를 넣고 잘 섞는다.
- 또한, 별도로 설정 입력 된 10 μL (단계 1.11)에 400 μL의 용출 용액을 추가 할뿐만 아니라 가교 입력 샘플들을 역의 0.16 M 농도의 NaCl을 추가한다. 5 시간 동안 65 ° C의 수조에서 배양함으로써 샘플을 가교 역방향.
- 역 가교 용출액에 100 %의 EtOH 1 ML을 추가합니다. 잘 믹스 2 -80 ° C에서 부화 - 3 시간 또는 -20 ° CO / N에서. 15 분 동안 17,949 XG에서 샘플을 스핀과 에탄올을 버린다.
- 펠렛을 씻어 800 μL 70 % 에탄올을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 17,949 XG에 스핀과 에탄올을 버린다. 잔여 에탄올을 제거하기 위해 간단히 스핀. 1, 37 ° C에서 샘플을 공기 - 건조0 분 잔류 에탄올을 제거합니다.
- 90 μL RNA 분해 효소의 DNA와 DNase를 무료로 물을 용해 및 0.2 ㎎ / ㎖ 최종 농도 2 μL 10 ㎎ / ㎖의 RNase를 추가합니다. 30 분 동안 물을 욕조에 37 ° C에서 품어.
- 10 ㎕의 10 배 테 K 버퍼 (100 mM 트리스 - CL 산도 8.0, 50 mM의 EDTA의 pH 8.0, 5 % SDS)를 추가합니다. 잘 혼합하고 1 시간 동안 42 ℃에서 1 μL 테 K. 품어을 추가합니다.
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 PCR 정제 키트를 사용하여 입력 칩 DNA를 정제하여, 50 μL의 물을 용출 DNA. 더 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 DNA.
2. 슬롯 칩 DNA의 얼룩 분석
- 280 nm의 분광 광도계를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단계 1.22에 기재된 바와 같이 50 μL의 물에 용출 입력 DNA 칩의 수율을 측정한다.
- 검출의 선형 범위 내에있는 입력의 동일한 볼륨 (50 μL) 또는 면역 DNA를 가져 가라.
- 예를 들어, 입력DNA의 수율은 1.5 NG / μL가, 다음 (총 DNA 겨 45) 30 μl를 타고 물 50 μL에 볼륨을 만들 수 있습니다. 인자 칩, 2.1 단계에서 전체 50 μL의 용출액을 2.3 단계로 진행합니다.
- 0.4 N NaOH를 짧게 소용돌이 10 초 동안 956 XG에 대한 원심의 2.5 볼륨을 추가하여 50 μL 입력 또는 면역 DNA를 변성하고, 실온에서 30 분 동안 품어.
- 10 초 동안 956 XG 1 M 트리스 - 염산 175 μL, 산도 6.8, 소용돌이, 원심 분리기를 추가하여 변성 된 DNA를 중화하고 얼음에 샘플을 배치합니다.
- 후술하는 바와 같이 슬롯 블롯 분석을 위해 입력 용액을 희석하고 면역 DNA를 준비한다.
- 단계 2.3에 따라 - 350 μL의 총 샘플 볼륨을 얻기 위해 2.4 (즉, 50 μL 입력 / 칩 DNA, 125 μL를 0.4 N NaOH를 175 ㎕의 1 M 트리스 - 염산, pH를 6.8).
참고 : 인스턴스가 위에서 언급 한 내용은, 입력 DNA의 45 NG가 0.129 NG / μL 끝나게됩니다. - 입력 DNA를 들어, 세 개의 튜브에 라벨을S 100, 50, 25, 100 μL, 50 μL 및 변성 및 중화 DNA 샘플의 25 μl를 추가로. 뉴 클레아없는 물 100 μL에 최종 볼륨을 확인합니다. 칩 DNA, 라벨 200, 100, 50, 200 μl를 추가로 세 개의 튜브, 100 μL 및 변성 및 중화 DNA 샘플의 50 μL. 뉴 클레아 무료 물 200 μL에 최종 볼륨을 확인합니다.
- 단계 2.3에 따라 - 350 μL의 총 샘플 볼륨을 얻기 위해 2.4 (즉, 50 μL 입력 / 칩 DNA, 125 μL를 0.4 N NaOH를 175 ㎕의 1 M 트리스 - 염산, pH를 6.8).
- 슬롯 얼룩 장치의 크기로 막 잘라. 전에 20 배 SSC의 막과 블로 팅 서류를 사전 적시고 DNA를 추가하기 전에. 제조 업체의 프로토콜에 따라 슬롯 얼룩 장치로 조립.
- 해당 슬롯에 단계 2.5.2에서 피펫의 DNA. 제타 프로브 막 상에 DNA를 당겨 천천히 진공을 적용합니다. 모든 샘플이 장치를 통과 한 후 진공을 중지합니다.
- 장치를 분해하고 즉시 UV 가교제를 사용하여 막 위에 DNA를 고정시킨다. 자외선 가교제의 DNA의 측면을 가지고 노소를 사용가교제에 설정 tocrosslink. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오.
- 웨스턴 블 롯팅을 수행하여 슬롯 블롯에 BrdU의 검출.
- PBS에서 무 지방 분유 5 % 막에 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 1 시간 동안 실온에서 0.1 % 트윈 20 (PBST)을 포함하는 막과 차단.
- 기본 방지 BrdU의 항체 (1 : 500 희석) 추가 PBST 1 % 무 지방 건조 우유에 희석 및 통에 실온에서 3 시간 동안 차 항체와 얼룩을 품어. 일차 항체 배양 후에 PBST로 3 회 씻어 막.
- 얼룩에 HRP - 복합 항 - 마우스 이차 항체를 추가 (1 : 5,000 희석) 1 시간 동안 실온에서 품어. 이차 항체 배양 후 PBST로 3 회 막 씻으십시오.
참고 : 완전히 일차 및 이차 항체 배양 중에 막 다루 항체의 충분한 양을 사용합니다.
- ECL 믹스를 준비하고 오 교류에 추가제조업체의 프로토콜에 cording. 실온에서 5 분간 ECL 믹스와 멤브레인을 품어.
- , X 선 카세트 막 배치 X 선 필름에 노출시켜 막 제조자의 프로토콜을 이용하여 블롯을 개발한다.
- 제조사의 프로토콜에 따른 화상 J 소프트웨어를 이용하여 블롯을 스캔 한 후 입력 및 ChIPed의 DNA에 대해 얻어진 신호를 정량화. 정량 측정의 정확도를 보장하기 위하여 검출의 선형 범위 내에있는 신호를 사용한다.
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Representative Results
HDAC1,2 선택적 억제제의 특이성을 결정하기 위해, Hdac1,2 FL / FL 및 Hdac3 FL / FL 섬유 육종 세포를 사용 하였다. 아데노 바이러스 함유 Cre 호텔 재조합 효소 (AD-Cre 호텔)이 세포에서 Hdac1,2과 Hdac3을 삭제하는 데 사용되었다. Hdac1,2 FL / 플로리다의 다음 광고-Cre 호텔 감염 세포 H4K5ac에서 강력한 증가가 관찰되었다. 233 또는 898으로 Hdac1,2 녹아웃 세포의 치료는 233과 898이 세포에서 Hdac1,2하지 Hdac3을 억제하는 것을 확인 H4K5ac에서 더 이상의 증가를 초래하지 않았다. 대조적으로, Hdac3 녹아웃 세포에 233 또는 898의 첨가는, 그러므로 인해 Hdac1,2의 억제 및 (3)의 결과로서 H4K5ac 레벨에 첨가제 효과 Hdac3 녹아웃 세포에서 본 증가에 비해 H4K5ac 크게 증가 귀착 233과 898은 HDAC1, 2 선택적 억제제이다. 이들 결과에 나타낸다그림 1.
헬라 세포의 초기 DNA에에 PCNA로드의 반응 속도를보고 BrdU의 칩 슬롯 기술, BrdU의 펄스 추적 분석을 수행 한 유효성을 검사합니다. 우리의 결과는 초기 DNA와 PCNA 협회는 15 분 이내에 신속하게 발생하고 이전에 출판 된 결과 (13)와 계약의 30 분 추격 후에 사라 것으로 나타났다. 이러한 결과는 그림 2에 표시됩니다.
BrdU의-H4K16ac 칩 슬롯 웨스턴 기법 HDAC1,2 기능의 부재하에 초기 DNA와 연관된 H4K16ac의 양을 결정하는 데 사용되었다. 토끼 IgG를 제어 (도 3A 및 3B)에 비해 초기 DNA와 연관된 H4K16ac에서 강력한 농축이 관찰되었다. HDAC1,2 활동이나 Hdac1,2의 최저 억제 다음 초기 DNA 관련 H4K16ac의 증가는 그림 3C에 표시됩니다 3D 및 3E.
초기의 DNA에 SMARCA5 염색질 인부의 수준은 BrdU의-SMARCA5 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여 측정 하였다. 우리의 결과는 포유 동물 세포에서 초기 DNA와 그 SMARCA5 동료를 보였다. 도 4에 도시 된 바와 같이 또한 HDAC1,2 억제 또는 Hdac1,2의 최저은 초기 DNA 관련 SMARCA5 염색질 인부의 양을 변경하지 않았다.
HDAC1,2 선택적 억제제의 특이성 그림 1. 확인. 898이나와 광고-Cre 호텔 감염 및 치료 다음 HDAC1 FL / FL Hdac2 FL / FL 또는 Hdac3 FL / 플로리다 섬유 육종 세포로부터 제조 된 전체 세포 용 해물의 서양 분석(233) 세포는 3 μm의 898 또는 48 시간 광고-Cre 호텔 감염 다음 233 24 시간 처리 하였다. 이 그림은 이전 출판 작업 (6)에서 파생됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 HeLa 세포에서 DNA의 초기와 PCNA 협회 2. 역학. HeLa 세포를 30 분 동안 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)로 표지 하였다. 세포는 다음 시간의 표시 기간 (추적)을 위해 BrdU의없이 비법 BrdU의 미디어에서 배양을 제거하는 세척 하였다. 염색질 면역 침전 (칩) 항 증식 세포 핵 항원 (PCNA) 항체로 실시 하였다. 입력 DNA와 PCNA와 관련된 그 존재 BrdU의 표지 DNA를 방지 BRD를 사용하여 슬롯 블롯 분석에서 평가되었다그림 2와 같이 U 항체가.이 그림은 이전 출판 작업 (6)에서 파생됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
히스톤 디 아세틸 라제 (1) 및 초기 DNA. (AB) 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 펄스 추적 2 증가 H4K16ac 그림 3. 손실은 지정된 시점에서 초기 DNA와 H4K16ac의 관계를 결정하기 위해 헬라와 NIH3T3 세포에서 수행되었다. (CD) NIH3T3 세포는 DMSO 또는 24 시간 동안 HDAC1,2 선택적 억제제 (898 또는 233) 중 하나를 처리 하였다. (E) NIH3T3 세포는 어느 비 - 타겟팅 (NT) 또는 Hdac1,2 (H12) siRNA를 형질 감염시켰다. (C - E)에서 세포 BrdU의 표지 및 사용되었다안티 H4K16ac와 칩 슬롯 블로 팅 하였다. 막은 항 BrdU의 항체로 프로빙 하였다. 숫자는 발견 칩 DNA의 높은 매체 볼륨의 평균 BrdU의 신호의 이미지 J 정량을 나타냅니다. 이 그림은 이전 출판 작업 (6)에서 파생됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 초기 DNA와 SMARCA5 연결합니다. HDAC1,2 기능의 손실 다음과 같은 초기 염색질에 SMARCA5의 양이 표시됩니다. NIH3T3 세포 중 하나 HDAC1,2 선택적 억제제 (898)로 처리하거나 (NT) 비 대상 또는 Hdac1,2 (H12) siRNA를 형질 감염시켰다. 세포 항 SMARCA5 또는 토끼 IgG에와 상기 처리 칩 다음 BrdU의 (부정적인 C로 표지 된조작부)을 실시 하였다. 칩 DNA의 증가 볼륨은 슬롯 얼룩에 발견하고 막 안티 BrdU의 항체 프로브했다. 이 그림은 이전 출판 작업 (6)에서 파생됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에 기술 된 프로토콜은 새로 복제 또는 초기 DNA에 단백질 또는 번역 후 변형 된 형태의 존재를 입증하는 상대적으로 빠른 방법입니다. 또한,이 기술은 초기의 단백질 또는 DNA와의 수정 된 형태의 어소시에이션 해리 동력학을 측정하는 하나를 허용한다. 이 기술은 우아한 iPOND 기술 (13)에 상보 적이다. iPOND 기술에서, 새로 합성 된 DNA는 에틸 옥시 우리 딘 (EDU)으로 표시됩니다. 비오틴 복합체는 클릭 화학을 사용하여 EDU에 추가됩니다. 비오틴 - 태그 초기 DNA는 다음 서부 블로 팅에 의해 감지 된 스트렙 타비 딘 비즈와 공동 정화 단백질을 사용하여 면역된다. 반면에, 우리의 BrdU의 칩 슬롯 서방 기법에서, 초기 DNA와 관련된 단백질 또는 이의 변형 된 형태의 단백질 고유 또는 개질 된 형태 - 특이 적 항체 및 결합의 BrdU 표지 된 초기 DNA의 양을 사용하여 면역 침강되고 단백질은 일입니다EN은 안티 BrdU의 항체를 사용하여 슬롯 웨스턴 블로 팅에 의해 정량적으로 결정했다.
특별한주의가 필요한이 프로토콜의 중요한 단계가 있습니다. 이는 관심의 항체 고효율 칩 표준 분석법에서 잘 작동되도록하는 것이 중요하다. 그것은 BrdU의 칩 - 슬롯 웨스턴 분석을 수행하기 전에-PCR에 의한 정량 분석 칩의 항체의 효율을 시험하는 것이 중요하다. 정확한 것으로 BrdU의 칩 슬롯 서방 기술 정량 위해, BrdU의 표지 된 DNA의 일련의 희석 처음하기 위해 수행되어야 슬롯 블롯 및 항 BrdU의 항체를 사용하여 웨스턴 분석에 적용되어야 검출의 선형 범위를 결정한다. 칩의 DNA 농도를 결정하고 입력은 DNA의 BrdU 표지 된 DNA의 양을 웨스턴 블롯에서 검출의 선형 범위 내에 있도록 하나를 가능하게한다. 예를 들어, 우리는 (50)에 입력하는 DNA 12.5 ng를 NG로 판정우리의 파일럿 실험에서 선형 범위. 칩 샘플의 농도가 매우 높은 경우에도, 그 슬롯을 수행하기 전에 DNA 칩을 희석하는 것이 필수적이다. 이 기술의 한계는 염색질 전단의 효율에 의존의 해상도이다. 초음파에 의한 염색질의 전단은 주어진 단백질 또는 새로 합성 된 DNA와의 수정 된 형태의 근접을 결정합니다.
과거에는, 포유 동물 세포에서 DNA 복제 동안 염색질 및 염색질 변형 효소의 변화에 대한 연구는 적절한 기술을 사용 불가능으로 인해 해결하기 어려운 문제가 남아 있었다. 또한, G1 단계에서 세포 Hdac1,2 널 구속하기 때문에, S 상 내의 Hdac1,2위한 기능을 검사하는 것이 곤란했다. 본 연구에서 우리는 S 상 및 BrdU의 신규 칩-S 내에서의 활동을 억제하는 제 수준의 선택적 억제제의 조합을 이용하여 DNA 복제 동안 이러한 두 Hdacs위한 기능을 보였다많은 서양 기술. 미래에,이 기술은 분기점에서 히스톤 변형 및 염색질 변형 효소 연구 외에 실속 분기점에서 DNA 손상 반응과 DNA 복구 단백질의 동역학을 연구하기 위해 사용될 수있다. 또한,이 기술은 마우스 NIH3T3 세포에 한정되지 않는다. 이 기술은 성공적 효소 또는 다른 단백질의 억제제 복제 분기점에서 DNA 복제 및 복제 스트레스 유도 염색질 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 다른 세포주에서 사용될 수있다.
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Acknowledgments
이 원고의 작업은 방사선 종양학 교실과 사냥꾼 암 연구소 (SB)에 보건 부여의 국립 연구소 (R01-CA188520)에서 기금에 의해 지원되었다. 나는 프로토콜을 입증하고 그 혜택을 설명하기위한 나의 실험실에서 다니엘 존슨과 스티븐 베넷 감사합니다. 나는 원고에 중요한 의견 박사 마헤 Chandrasekharan (헌 츠맨 암 연구소)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
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