Die Montage und Anwendung der "Shear Ringe ': A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass verschiedene Niveaus und Muster der Flüssigkeitsscherung die endotheliale Genexpression, den Phänotyp und die Anfälligkeit für Krankheiten modulieren. Wir diskutieren den Aufbau und die Verwendung von "Scherringen": ein Modell, das unidirektionale, periodische Schubspannungsmuster erzeugt. Scherringe sind einfach zu montieren, wirtschaftlich und können hohe Zellausbeuten erzeugen.

Zusammenfassung

Abweichungen von normalen Niveaus und Muster der vaskulären Flüssigkeitsscher spielen eine wichtige Rolle in der Gefäß Physiologie und Pathophysiologie durch adaptive sowie pathologische Veränderungen der endothelialen Phänotyp und die Genexpression zu induzieren. Insbesondere maladaptiven Effekte von periodischen, unidirektionale Strömungs induzierte Scherbeanspruchung kann eine Vielfalt von Wirkungen auf verschiedene vaskuläre Zelltypen auszulösen, insbesondere Endothelzellen. Während mittlerweile Endothelzellen aus verschiedenen anatomischen Herkunft kultiviert worden sind, eingehende Analysen ihrer Reaktionen auf Fluid - Scher wurden durch die relative Komplexität der Schermodelle (zB Parallelplattenflusskammer, Kegel-Platte - Flow - Modell) behindert. Während diese alle guten Ansätze darstellen, sind solche Modelle technisch kompliziert und leiden unter den Nachteilen, einschließlich relativ langwierigen und komplexen Aufbauzeit, niedrige Oberflächenbereiche, Anforderungen für Pumpen und häufig Druck Dicht- und Dichtungen erfordern, Herausforderungen bot die Schaffungh Aufrechterhaltung der Sterilität und die Unfähigkeit, mehrere Experimente auszuführen. wenn ein höherer Durchsatz Modelle von Strömung und Scher jedoch zur Verfügung standen, größere Fortschritte bei der vaskulären endothelialen Scher Reaktionen, insbesondere periodische Scher Forschung auf molekularer Ebene könnte mehr sein, schnell vorangeschritten. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von Scherringe: a novel, einfach zu montieren und kostengünstig Gewebekultur-Modell mit einer relativ großen Oberfläche, die für eine hohe Zahl von experimentellen Replikate in einer Richtung, periodische Scherspannung Studien leicht ermöglicht auf Endothelzellen.

Einleitung

Fluidscherspannung wurde gezeigt , dass endotheliale Genprogramme ¹ modulieren ^{- 5} durch Aktivierung von cis-regulatorischen Elemente ^6, Histon - Acetyltransferase - Aktivität ⁷ und Schubspannungsantwortelemente (SSRE) ^8. Stress beeinflusst endotheliale Beiträge zur Koagulation durch Modulation Gewebefaktor ⁹ und Gewebe - Plasminogen - Aktivator (tPA) ¹⁰ - Expression scheren. Schubspannung beeinflusst auch die Kontrolle der Angiogenese ¹¹ und Gefäßumbau durch Regulierung PDGF-B - Synthese und Reaktions ^8. Die endotheliale abgeleitetes vasoaktiven Mediatoren A....

Protokoll

1. Aufbau von 150 mm Durchmesser Shear Ringe (Abbildung 1)

HINWEIS: Shear Ringe können durch Variieren der äußeren und inneren Petrischale Größen vielen verschiedenen Abmessungen zu schaffen konstruiert werden, was zu Vorrichtungen mit unterschiedlichen Gesamtoberflächen, Zellausbeuten und entwickelten Bereiche der Scherkräfte. Dieser Bericht beschreibt eine 150 - mm - Schale mit einer inneren 100 - mm - Schale kombiniert für eine Gesamtoberfläche von 98 cm ² (Abbildung 2).

Ergebnisse

Hier präsentieren wir repräsentative Ergebnisse aus beiden hCMEC / D3 Gehirn Endothelzellen und retinalen Ratten mikrovaskulären Endothelzellen Monolayern, kultiviert in Scherringen.

Nachdem man hCMEC / D3 Gehirn Endothel-Zellmonolayern wachsen in völliger EBM bis zur Konfluenz, die Scherringe wurden 72 Stunden auf einem Schüttler gestellt. Unter Verwendung der Gleichung aus Schritt 3.5, die maximale Schubspannung berechnet

Diskussion

Der Aufbau des Systems Scherring zum Belichten Endothelzellen abzuscheren ist ein einfacher Ansatz Scherspannung Studien durchführen. Dennoch gibt es einige Schritte, die für den Erhalt der überlegenen Scherringe und bessere Ergebnisse kritisch sind. Eine vollständige Abdichtung sollte zwischen dem inneren und dem äußeren Ring zu verhindern Medien aus undichten gemacht werden, die im Widerspruch Scherspannung zwischen den Proben schaffen könnte. Wenn eine vollständige Abdichtung nicht durchgeführt wird, sollte eine mini.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 x 20 mm Kunststoff-Gewebekulturschale	Corning	430167	Die Schalen müssen aus Polystyrol
bestehen 150 x 25 mm Kunststoff-Gewebekulturschale	Corning	430599	Die Schalen müssen aus Polystyrol sein
150 mm Petrischale aus Glas	Fisher	3160150BO
15 ml Polystyrol-Gewebekultur-Kunststoffröhrchen	Falcon	352099
Methylenchlorid	Sigma-Aldrich	D65100
Silikonkautschuk Dichtstoff	DAP	7079808641
Ethanol	Decon	2701
3 ml Transferpipette	Becton-Dickinson	357524
Drucker Papierschere
Handschuhe
Rotationswerkzeug und -set	Dremel	4000-6/50
Rotationswerkzeug Schneidkopf	Dremel	EZ476
Rotationswerkzeug Bohrkopf
	VWR	57018-754
Inkubator
Rattennetzhaut mikrovaskuläre Endothelzellen	Zellbiologika	RA-6065

Destillationswasser-Orbitalschüttler