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Die Montage und Anwendung der "Shear Ringe ': A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

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DOI:

10.3791/54632

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31. Oktober 2016

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1Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport, 2Biological Sciences, Louisiana Tech University, 3Neurology, Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport, 4Institut Cochin, Inserm U1016, Cnrs Umr8104, Université Paris Descartes

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass verschiedene Niveaus und Muster der Flüssigkeitsscherung die endotheliale Genexpression, den Phänotyp und die Anfälligkeit für Krankheiten modulieren. Wir diskutieren den Aufbau und die Verwendung von "Scherringen": ein Modell, das unidirektionale, periodische Schubspannungsmuster erzeugt. Scherringe sind einfach zu montieren, wirtschaftlich und können hohe Zellausbeuten erzeugen.

Zusammenfassung

Abweichungen von normalen Niveaus und Muster der vaskulären Flüssigkeitsscher spielen eine wichtige Rolle in der Gefäß Physiologie und Pathophysiologie durch adaptive sowie pathologische Veränderungen der endothelialen Phänotyp und die Genexpression zu induzieren. Insbesondere maladaptiven Effekte von periodischen, unidirektionale Strömungs induzierte Scherbeanspruchung kann eine Vielfalt von Wirkungen auf verschiedene vaskuläre Zelltypen auszulösen, insbesondere Endothelzellen. Während mittlerweile Endothelzellen aus verschiedenen anatomischen Herkunft kultiviert worden sind, eingehende Analysen ihrer Reaktionen auf Fluid - Scher wurden durch die relative Komplexität der Schermodelle (zB Parallelplattenflusskammer, Kegel-Platte - Flow - Modell) behindert. Während diese alle guten Ansätze darstellen, sind solche Modelle technisch kompliziert und leiden unter den Nachteilen, einschließlich relativ langwierigen und komplexen Aufbauzeit, niedrige Oberflächenbereiche, Anforderungen für Pumpen und häufig Druck Dicht- und Dichtungen erfordern, Herausforderungen bot die Schaffungh Aufrechterhaltung der Sterilität und die Unfähigkeit, mehrere Experimente auszuführen. wenn ein höherer Durchsatz Modelle von Strömung und Scher jedoch zur Verfügung standen, größere Fortschritte bei der vaskulären endothelialen Scher Reaktionen, insbesondere periodische Scher Forschung auf molekularer Ebene könnte mehr sein, schnell vorangeschritten. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von Scherringe: a novel, einfach zu montieren und kostengünstig Gewebekultur-Modell mit einer relativ großen Oberfläche, die für eine hohe Zahl von experimentellen Replikate in einer Richtung, periodische Scherspannung Studien leicht ermöglicht auf Endothelzellen.

Einleitung

Fluidscherspannung wurde gezeigt , dass endotheliale Genprogramme 1 modulieren - 5 durch Aktivierung von cis-regulatorischen Elemente 6, Histon - Acetyltransferase - Aktivität 7 und Schubspannungsantwortelemente (SSRE) 8. Stress beeinflusst endotheliale Beiträge zur Koagulation durch Modulation Gewebefaktor 9 und Gewebe - Plasminogen - Aktivator (tPA) 10 - Expression scheren. Schubspannung beeinflusst auch die Kontrolle der Angiogenese 11 und Gefäßumbau durch Regulierung PDGF-B - Synthese und Reaktions 8. Die endotheliale abgeleitetes vasoaktiven Mediatoren Adrenomedullin, Endothelin-1, Urotensin II und Relaxin werden auch durch Scherung 12 geregelt. Die Transkription von endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase Produktion und die Produktion von Stickoxid sind beide Scher abhängig 10. Scher steuert auch endothelial ICAM-1 - Expression 13. Strömungsinduzierten Scherspannung kann daher powerfully beeinflussen eine Vielzahl von endothelialen Antworten. Wichtig ist , dass jetzt vaskulären Pulsationen auch eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von sowohl normalen vaskulären Alterungs- und Formen von vaskulärer Demenz 14 und kann sogar dazu beitragen, anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie Multipler Sklerose 15 spielen scheinen.

Venöse und arterielle endotheliale Zellen sind inhärent auf diverse hämodynamischen Strömungsmuster in vivo ausgesetzt ist , und viele verschiedene Phänotypen von Endothelzellen kann 16 gezeigt werden. In Abhängigkeit von der Größe und der Periodizität der Strömungs kann Wirkungen auf Endothelzellen umfassen Entzündungszellaktivierung und die Apoptose, die 17,18 Veränderungen in der Gen oder Protein - Expression widerspiegeln. Untersuchungen an endotheliale Zellantworten Phänomene abzuscheren daher durch die Schwierigkeiten kompliziert bleiben in vitro Modellen in der Herstellung , die ausreichend solchen Schermuster erzeugen.

Viele verschiedene Experimental Protokolle wurden entwickelt Fluidscherbeanspruchung aufzubringen Zellmonolayern an Endothelzellen. Eines der am häufigsten verwendeten Systeme ist der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb der Kammer 19 gleichmäßige laminare Strömung erzeugt - 21. Eine peristaltische Pumpe ist typischerweise verbunden periodischen Strömung zu erzeugen, die Eigenschaften Strömungs rekapitulieren kann typischerweise an verschiedenen Orten in vivo 22 gefunden. Ein weiteres gemeinsames Set-up verwendet die "Kegel-Platte" -Modell, in dem Schubspannung durch die Drehzahl des Kegels 23 bestimmt wird. Beide Systeme und andere Anordnungen, die ähnlich zu ihnen kann sehr mühsam sein, einzurichten und Komponenten erfordern, die relativ teuer und unzugänglich für viele Laboratorien sein kann.

Eine andere wesentliche Einschränkung dieser aktuellen Modellen ist die relativ geringe Anzahl an Wiederholungs Studien, die gleichzeitig durchgeführt werden können, die jeweils mit einer relativ geringen Oberfläche. Dies erhöht die Zeit und co mplexity solcher Ansätze. Daher ist es ein ideales Modell, das unidirektionale und periodische Scher induziert könnte sein, wo eine hohe Zahl von Studien Replikaten kann leicht auf, die jeweils mit einer relativ großen Oberfläche eingestellt werden. Darüber hinaus erfordern die oben genannten Modelle eine ziemlich anspruchsvolle Einrichtung, die für viele Anwender unerschwinglich teuer sein kann. Ein Modell, das Fluid-Scher Störungen unter Verwendung von basischen Labormaterialien produzieren kann möglicherweise mehrere Vorteile haben.

Eine einfache und sehr wirtschaftliche Verfahren unidirektional, periodische Scherspannung des Auftragens beinhaltet die Platzierung von kreisförmigen Teller auf einem Kreisschüttler 24. Dieses Protokoll ist sehr einfach und kann bis zu erreichen, eine hohe Zahl von Studie repliziert, die jeweils mit einem relativ großen Oberflächenbereich skaliert werden, wie erforderlich. Jedoch sind in der Mitte der Schale befindlichen Zellen auf unterschiedliche Strömungsmuster als Zellen, die entlang des Umfangs freigelegt, gemischten zellulären phänotypischen Reaktion in der gleichen Schale ergibt.

_content "> In diesem aktuellen Bericht beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von" Scher Ringe ', unser Modell für Stress unidirektional und periodische Scher zu schaffen. Der Entwurf für den Scherring effektiv Grenzen "gemischten" zellulären Phänotypen schub induziert durch die Strömung zu beschränken Weg innerhalb einer Kreiskulturschale an die Peripherie durch die Platzierung eines inneren Rings. der Aufbau und der Betrieb des Scherring ist einfach und wirtschaftlich und kann leicht eine breite Palette von Kreisschüttler aufzunehmen skaliert werden weit verbreitet Gewebekulturversorgungen. Diese Modell kann in Endothelzellen Experimente angewendet werden unidirektional und periodische Strömungsmuster innerhalb der physiologischen und pathophysiologischen Niveaus zur Verfügung zu stellen.

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Protokoll

1. Aufbau von 150 mm Durchmesser Shear Ringe (Abbildung 1)

HINWEIS: Shear Ringe können durch Variieren der äußeren und inneren Petrischale Größen vielen verschiedenen Abmessungen zu schaffen konstruiert werden, was zu Vorrichtungen mit unterschiedlichen Gesamtoberflächen, Zellausbeuten und entwickelten Bereiche der Scherkräfte. Dieser Bericht beschreibt eine 150 - mm - Schale mit einer inneren 100 - mm - Schale kombiniert für eine Gesamtoberfläche von 98 cm 2 (Abbildung 2).

figure-protocol-1
Abbildung 1. Scherringanordnung. Der obere Teil der Figur zeigt einen teilweise montierten Scherring. Injizieren Sie 0,5 ml Methylenchlorid durch die 3 mm Loch mit einer Transferpipette, wenn eine dichte Abdichtung hat sich zwischen den inneren und äußeren Gerichte nicht vollständig ausgebildet. Der Scherring wird durch Aufbringen einer 1 mm dicken Wulst aus Silikonkautschuk-Kleber um den inneren edg dicht verschlossene des oberen Scherring. Der untere Teil der Figur zeigt den montierten Scherring. Das Blau steht für den Bereich von plattierten Endothelzellen. Die äußeren und inneren roten Pfeile , um die Orbitalbewegung des Scherring und Medien innerhalb des Scherring zeigen , wenn sie auf einem Schüttler platziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Oberflächenmessungen für einen 150 mm Scherring (nicht maßstäblich gezeichnet). Top - Panel zeigt zentrifugale Verschiebung der Flüssigkeit in Richtung Außenring in Reaktion auf Orbitaldrehung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Erstellen Sie eine Scherring Konstruktionsvorlage durch ein Erzeugen150 mm Außenrandprofil in Präsentationssoftware mit einem 100 mm Innendurchmesser in der Mitte des Kreises 150 mm platziert. Drucken Sie die Vorlage auf ein Blatt A4 weißem Papier.
  2. Pipettieren 10 ml Methylenchlorid (Dichlormethan) in eine 150 mm Petrischale aus Glas. Es ist wichtig, dass die Schale Glas und nicht Polystyrol (oder anderen Vinyl Kunststoff), wie Methylenchlorid, die meisten Kunststoffe solubilisiert und wird verwendet, hier Kunststoffteile zu verbinden.
    ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe für alle Konstruktion mit ausreichender Belüftung Kapuze. Methylenchlorid ist ein Kontakt reizend und ist hepatotoxischer.
  3. Richten Sie ein 150 mm Kunststoff-Petrischale auf die äußere Scherring Vorlage.
  4. Bohren Sie ein 3 mm Loch in der Mitte einer 100-mm-Schale ein Drehwerkzeug. Entfernen Sie alle Kunststoff-Späne aus der Bohrung hergestellt.
  5. Während mit einer behandschuhten Hand, invertieren und die obere Kante der 100 mm Petrischale aus dem vorherigen Schritt in den Pool von Methylenchlorid für etwa 3 Sekunden tauchen.
  6. Transfer die "angefeuchtet" 100-mm-Schale Rand nach unten auf die Mitte einer 150-mm-Schale, sorgfältig Ausrichten der 100-mm-Schale auf die markierte Vorlage. Das Methylenchlorid wird die Kunststoff-Sicherung, die 100 mm und 150 mm-Schalen verbinden. Vorsichtig drehen, um die 100-mm-Schale im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn ein paar Mal auf die 150-mm-Schale eine gute Haftung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Achten Sie unbedingt auf die richtige Ausrichtung der inneren Schale in die Mitte der äußeren Schale zu gewährleisten. Exzentrischer Ausrichtung kann in Veränderungen der Scherspannung an verschiedenen Stellen in dem Scherring führen. Es ist darauf zu nicht Methylenchlorid ermöglichen versehentlich während der Platzierung der 100 mm-Schale auf die äußere Schienenabschnitt der 150 mm Petrischale tropfen. Dadurch wird der Kunststoff an der unteren Oberfläche schmelzen, wo Zellen wachsen, eine unebene Oberfläche zu schaffen, die Strömungsstörungen verursachen können.
  7. Sobald das Methylenchlorid getrocknet ist, drehen die neu gebunden Petrischalen über und sorgfältig die Berührungspunkte inspizieren, um sicherzustellen,eine dichte Abdichtung wurde zwischen den beiden Petrischalen gebildet.
  8. Wenn eine dichte Abdichtung nicht vollständig gebildet hat, injizieren 0,5 ml Methylenchlorid durch die 3 mm Loch mit einer Transferpipette. Suchen Sie sich die Schale und sanft drehen das Methylenchlorid zu ermöglichen, den Rand zu erreichen.
    HINWEIS: Wenn zu schnell gedreht wird, kann das Methylenchlorid in den äußeren Teil des 150-mm-Schale verschütten, um die Oberfläche zu verformen, wo Zellen wachsen und den Scherring ruinieren. Undichte Scherringe sind zu verwerfen.
  9. Abdichtung um das Loch in der 100-mm-Schale durch eine 3 mm Wulst aus Silikongummi Dichtungsmittel aufgebracht wird.
  10. Mit einem Drehwerkzeug mit einem flachen Schneidkopf ausgerüstet, schneiden Sie die Top-3 cm Teil eines konischen 15 ml Polystyrol-Gewebekulturrohr, so dass mindestens 1 cm des Rohres unter der Kappe. Polieren Sie die Kante des geschnittenen Rohr bis glatt und flach mit der flachen Seite des Schneidkopfes verwendet wird. Entfernen Sie alle Kunststoffspänen hergestellt durch Schleifen.
  11. Verfolgen Sie die abgeschnitten 15 ml konischen Röhrchen auf dieDeckel des 150-mm-Schale mit einem Marker, von der Kante der Schale von etwa 0,5 cm entfernt. Bohren Sie ein Loch in der gezeichneten Kreis, eine Marge in etwa 1-2 mm vom Rand des Kreises zu verlassen.
  12. Legen Sie das konische Rohr nach oben über das Bohrloch abgeschnitten. Verwendung einer Transferpipette gelten etwa 250 & mgr; l Methylenchlorid zu den Kanten abgeschnitten des konischen Rohrs die konischen Rohr an dem Deckel 150 mm zu binden.
  13. Verschließen Sie den 150 mm Deckel auf den 150-mm-Schale durch eine 1 mm dicke Raupe aus Silizium Gummidichtung um den inneren Rand der oberen Petrischale aufgebracht wird.

2. Sterilisation von Shear Ringe

  1. Pipette ca. 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung in den neu gebildeten Scherring durch den 15 ml konischen Röhrchen Port. Wirbeln um alle Ablagerungen im Inneren des Scherring zu entfernen. Entfernen Sie die phosphatgepufferte Salzlösung mit einer Pasteur-Pipette / Vakuum-Saugvorrichtung.
  2. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis Schmutz entfernt wird.
  3. Um Sterilize der Scherring, eine Kombination aus einer 70% igen Ethanolspülung mit UV-Bestrahlung.
    1. Lösen Sie die belüftete Kappe, pipettieren etwa 10 ml 70% igem Ethanol durch die Zugangsöffnung, und schrauben Sie den Deckel wieder. Drehen und Spiegeln die Scherring mehrfach über, um sicherzustellen, dass die Innenseite des Scherring wird gründlich gewaschen.
    2. Unter einem Abzug Überschuss 70% Ethanol aspirieren aus. Mit einer Sprühflasche, Spray gründlich die Kappe und Zugangsport mit 70% Ethanol.
    3. Setzen Sie den Scherring und Kappe unter UV-Strahlung in der Gewebekultur Haube, bis sie vollständig trocken.
  4. Nach dem Trocknen anschrauben und speichern sterilisierten Scherringe die Kappe wieder bei Raumtemperatur verwendet werden, bis in der Zellkultur-Beschichtung.

3. Schubspannung Studies

  1. Platte Endothelzellen in sterilisierte Scherringen nach dem Standard-Zellkulturprotokoll typischerweise unter Verwendung eines 1: 4 Aufteilungsverhältnis für transformierte endothelialen Zelllinien.
    HINWEIS: Ratte retinalen microVascular Endothelzellen wurden kommerziell erhalten. Das menschliche Gehirn-Endothelzellen (hCMEC / D3) Zellen wurden als großzügiges Geschenk von Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, Frankreich) zur Verfügung gestellt und wurden in kompletten endothelialen Basalmedium (EBM).
  2. Lassen Kulturen Einmündung vor dem Beginn der Stromuntersuchungen zu erreichen. Verwenden von 30 ml Gewebekulturmedium (10% fötales Kälberserum, Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin). Ändern Zellkulturmedium alle 3 Tage und aufrechtzuerhalten Zellen bei 37 ° C mit 7,5% CO 2 und 92,5% Raumluft.
  3. Setzen Sie den Schüttler im Inkubator.
    Hinweis: Kreisschüttler sind in der Regel schwer (> 10 kg). Setzen Sie den Schüttler auf dem unteren Regal des Inkubators zu Regal Stress und Vibration minimieren.
  4. Legen Sie die experimentellen Scherringe auf dem Schüttler. Setzen Sie statische Kontrollgruppe Scherringe im selben Inkubator.
  5. Schätzen Sie die maximale Schubspannung innerhalb des shOhrring mit der Gleichung figure-protocol-3 woher figure-protocol-4 für die orbital shaker Dreh der Radius (in cm), figure-protocol-5 ist die Viskosität des Mediums (in Poise), figure-protocol-6 ist die Dichte des Mediums (in g / ml), und figure-protocol-7 ist die Frequenz der Drehung (in Rotation / sec) 24.
  6. Starten Sie die Dreheinstellung auf dem Schüttler auf die gewünschte Drehzahl (zB 90 Umdrehungen pro Minute), die Scherringe auf dem Schüttler für die gewünschte Dauer der Schubspannung Anwendung zu verlassen (zB 72 h).
    HINWEIS: Kreisschüttler Wärme erzeugen kann, so dass die Inkubatortemperatur zunächst überwacht werden sollten, um sicherzustellen, 37 ° C während der gesamten Dauer des Experiments beibehalten. Alternativ shören Ringe können in Klimakammern (zB modulare Inkubatorkammer) und dann in einem rotierenden Inkubator übertragen werden.
  7. Nach Zellschichten wurden für die gewünschte Zeitdauer zu scheren ausgesetzt, Scherringe aus dem Inkubator entfernen. Ziehen Sie den Scherring Deckel ab und Abrufen von Zellen und / oder Medien für die gewünschten Endpunkt untersuchen Analysen (zB Western Blot, Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung, etc.) 25.

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Ergebnisse

Hier präsentieren wir repräsentative Ergebnisse aus beiden hCMEC / D3 Gehirn Endothelzellen und retinalen Ratten mikrovaskulären Endothelzellen Monolayern, kultiviert in Scherringen.

Nachdem man hCMEC / D3 Gehirn Endothel-Zellmonolayern wachsen in völliger EBM bis zur Konfluenz, die Scherringe wurden 72 Stunden auf einem Schüttler gestellt. Unter Verwendung der Gleichung aus Schritt 3.5, die maximale Schubspannung berechnet

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Diskussion

Der Aufbau des Systems Scherring zum Belichten Endothelzellen abzuscheren ist ein einfacher Ansatz Scherspannung Studien durchführen. Dennoch gibt es einige Schritte, die für den Erhalt der überlegenen Scherringe und bessere Ergebnisse kritisch sind. Eine vollständige Abdichtung sollte zwischen dem inneren und dem äußeren Ring zu verhindern Medien aus undichten gemacht werden, die im Widerspruch Scherspannung zwischen den Proben schaffen könnte. Wenn eine vollständige Abdichtung nicht durchgeführt wird, sollte eine mini...

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Offenlegungen

J. Winny Yun hat ein Forschungsstipendium von der Annette Funicello Stiftung. J. Steven Alexander hat Forschungsunterstützung von der Abteilung für Neurologie, LSUHSC-S.

Danksagungen

Die Autoren möchten die Hilfe von Herrn Christopher Nguyen, Aaron Hunter und der Shreveport Jumpstart, SMART und Biostart Trainingsprogramme sowie die Centenary College of Louisiana Abteilung für Biophysik, Shreveport, LA anzuerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 x 20 mm Kunststoff-GewebekulturschaleCorning430167Die Schalen müssen aus Polystyrol
bestehen 150 x 25 mm Kunststoff-GewebekulturschaleCorning430599Die Schalen müssen aus Polystyrol sein
150 mm Petrischale aus GlasFisher3160150BO
15 ml Polystyrol-Gewebekultur-KunststoffröhrchenFalcon352099
MethylenchloridSigma-AldrichD65100
Silikonkautschuk DichtstoffDAP7079808641
EthanolDecon2701
3 ml TransferpipetteBecton-Dickinson357524
Drucker Papierschere
Handschuhe
Rotationswerkzeug und -setDremel4000-6/50
Rotationswerkzeug SchneidkopfDremelEZ476
Rotationswerkzeug Bohrkopf
VWR57018-754
Inkubator
Rattennetzhaut mikrovaskuläre EndothelzellenZellbiologikaRA-6065
Destillationswasser-Orbitalschüttler

Referenzen

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