हम optogenetic सिस्टम के साथ प्रयोग एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ प्रवाह में छवि कोशिकाओं रोगाणुओं की संस्कृतियों और नियमित रूप से रोशन करने के लिए एक सतत संवर्धन तंत्र बनाया गया है। संवर्धन, नमूने, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण पूरी तरह से स्वचालित कर रहे हैं ताकि रोशनी करने के लिए गतिशील प्रतिक्रियाओं कई दिनों में मापा जा सकता है।
Optogenetic सिस्टम आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन है कि प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के जवाब में रचना बदल सेलुलर प्रक्रियाओं को बदलने के लिए उपयोग। संवर्धन और प्रणालियों है कि रोशनी और optogenetic सिस्टम की उत्तेजना क्रमादेशित शामिल करने को मापने के लिए एक की जरूरत है। हम निर्माण और प्रकाश का प्रोग्राम खुराक के साथ माइक्रोबियल कोशिकाओं रोशन करने के लिए, और स्वचालित रूप से हासिल करने और प्रवाह में कोशिकाओं की छवियों का विश्लेषण एक सतत संवर्धन उपकरण का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक chemostat के रूप में इस तंत्र के संचालन विकास दर और सेलुलर पर्यावरण कसकर नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है। निरंतर सेल संस्कृति के प्रवाह को नियमित रूप से जांचा जाता है और कोशिकाओं मल्टी चैनल माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged हैं। संवर्धन, नमूने, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण पूरी तरह से स्वचालित कर रहे हैं ताकि प्रतिदीप्ति तीव्रता और संस्कृति प्रवाह से जांचा कोशिकाओं के सेलुलर आकृति विज्ञान में गतिशील प्रतिक्रियाओं कई दिनों से अधिक मापा जाता हैउपयोगकर्ता इनपुट के बिना। हम गतिशील Saccharomyces cerevisiae के एक तनाव एक optogenetic प्रणाली है कि प्रतिलेखन को सक्रिय करता है के साथ इंजीनियर में प्रोटीन के उत्पादन उत्प्रेरण द्वारा इस संवर्धन तंत्र की उपयोगिता का प्रदर्शन।
Optogenetic सिस्टम प्रकाश का उपयोग जीन अभिव्यक्ति, 1, 2, 3, 4, 5 प्रोटीन स्थानीयकरण, 6 प्रोटीन गतिविधि, 6, 7, 8 प्रोटीन बाध्यकारी, 8, 9, 10 और प्रोटीन गिरावट सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की बढ़ती सूची को नियंत्रित करने के। 11 प्रोग्राम ऑप्टिकल उत्तेजना के साथ एक नियंत्रित वातावरण में संवर्धन कोशिकाओं के लिए और जैविक रूप से प्रासंगिक timescales पर उनकी प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक विधि कोशिका जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए इन उपकरणों की क्षमता का दोहन करने के लिए आवश्यक है। हमारे विधि, एक अच्छी तरह से मिश्रित में एक निरंतर सेल के विकास दर को बनाए रखने के लिए chemostasis का लाभ लेता है एईदर्ज़ा दिया गया है, और तापमान नियंत्रित कांच संवर्धन के पोत 12, 13 है कि क्रमादेशित रोशनी के संपर्क में है। हम छवि एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ संस्कृति प्रवाह में व्यक्ति की कोशिकाओं प्रोग्राम किया रोशनी करने के लिए संस्कृति की प्रतिक्रिया को मापने के लिए। संवर्धन, नमूने, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण पूरी तरह से स्वचालित कर रहे हैं ताकि प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रवाह सेल संस्कृति के सेलुलर आकृति विज्ञान उपयोगकर्ता इनपुट के बिना कई दिनों से अधिक मापा जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल सबसे बढ़ रही सेल संस्कृति और माइक्रोस्कोपी के साथ परिचित प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है और इस्तेमाल तंत्र सस्ती है और आसानी से उपलब्ध घटकों से बना है। एक पारदर्शी संवर्धन पोत प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) उत्सर्जन 1 μW / 2 सेमी -10 मेगावाट / प्रकाश के 2 सेमी के लिए सक्षम के एक मैट्रिक्स से ऊपर रखा गया है। रोगाणुओं संवर्धन पोत लगातार में बड़े हो रहे हैं; एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर मीडिया से जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता हैकमजोर पड़ने दर, एक और माइक्रोस्कोप के लिए एक कम दर पर संस्कृति वापस लेने के लिए प्रयोग किया जाता है, और अंतर एक अतिप्रवाह आउटलेट के माध्यम से निकल जाता है। एक हीटिंग पैड तापमान बनाए रखता है। एयर लगातार एक सकारात्मक दबाव बनाए रखने के साथ-साथ मिश्रण और संस्कृति aerate करने के लिए संवर्धन पोत में पंप है। वायु पंप के अलावा, इन उपकरणों के लिए बिजली एक microcontroller है कि यह भी एक थर्मामीटर और एक जुड़ा डेस्कटॉप कंप्यूटर से प्राप्त इनपुट के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। प्रवाह सेल संस्कृति एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर एक microfluidic डिवाइस के लिए पंप है। गैर फ्लोरोसेंट और फ्लोरोसेंट छवियों को स्वचालित अर्जित कर रहे हैं। छवियों में कोशिकाओं को एक एल्गोरिथ्म है कि ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र के रूप में प्रत्येक कोशिका रेखांकित और प्रत्येक रॉय के गुणों के उपाय की विशेषता है।
इस प्रोटोकॉल के एक आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, हम Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं की बदलती प्रकाश तीव्रता एक नीली बत्ती जिम्मेदारी के साथ इंजीनियर के जवाब मापाoptogenetic प्रणाली है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रतिलेखन को नियंत्रित किया है। एस cerevisiae, सामान्यतः बेकर की खमीर के रूप में जाना जाता है, का चयन किया गया है क्योंकि इस प्रणाली में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए कई optogenetic सिस्टम पहले से मौजूद 14, 15, 16। इसके अलावा, इस मॉडल जीव आमतौर पर सिस्टम जीव विज्ञान में 17 और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के 18, 19, 20 के लिए एक हवाई जहाज़ के पहिये के रूप में अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। हमारे प्रतिनिधि परिणाम है कि इस प्रोटोकॉल इनपुट प्रकाश तीव्रता अलग-अलग और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के उत्पादन को मापने के द्वारा कई दिनों से अधिक एक संस्कृति का प्रतिलेखन को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शित करता है।
हम मन में लचीलेपन के साथ इस तंत्र बनाया गया है। सभी इस्तेमाल कोड स्वतंत्र और खुला स्रोत है। खंड कोशिकाओं को डिफ़ॉल्ट छवि विश्लेषण की प्रक्रिया आसान है और जल्दी से चलाता है। कस्टम विश्लेषण उपयोगकर्ता ?…
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी विचार विमर्श और संपादन के लिए प्रोटोकॉल, कीरन स्वीनी परीक्षण में सहायता के लिए मौली Lazar और वेरोनिका डेलगाडो स्वीकार करना चाहते हैं, और टेलर स्कॉट, मेरे एक-adirekkun, और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्टेफ़नी गेलर। मेगन निकोल McClean, पीएच.डी. बरोज़ वेलकम कोष से वैज्ञानिक इंटरफेस में एक कैरियर पुरस्कार रखती है।
Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |