Abstract
Bone-dannende osteoblaster interagere med knogleresorberende osteoklaster til at koordinere omsætningen af knogle matrix og til at styre skelet homeostase. Medaka og zebrafisk larver er almindeligt anvendt til at analysere adfærden af knogleceller under knogledannelse, degeneration, og reparation. Deres optiske klarhed tillader visualisering af fluorescensmærkede knogleceller og fluorescerende farvestoffer bundet til mineraliserede skelet matrix. Vores laboratorium har genereret transgene Medaka fisk, der udtrykker osteoklast-inducerende faktor Receptor Activator of Nuclear-KB-ligand (RANKL) under kontrol af en varmechok-inducerbar promotor. Ektopisk ekspression af RANKL resulterer i overskydende dannelse af aktiverede osteoklaster, der kan visualiseres i reporter linjer med nlGFP ekspression under kontrol af den cathepsin K (ctsk) promotor. RANKL induktion og ektopisk osteoklastdannelse fører til svær osteoporose-lignende fænotyper. Forbindelse transgene Medaka liNes, der udtrykker ctsk: nlGFP i osteoklaster, samt mCherry under kontrol af den osterix (OSX) promotor i præmature osteoblaster, kan bruges til at studere interaktionen af begge celletyper. Dette letter in vivo observation af cellulær adfærd under betingelser med knoglenedbrydning og reparation. Her beskriver vi brugen af dette system til at teste et lægemiddel almindeligt anvendt i human osteoporose terapi og beskrive en protokol for direkte billedvisning. Den Medaka model supplerer studier i cellekultur og mus, og tilbyder en roman system til in vivo analyser af narkotika handling i skelettet.
Introduction
Den hvirveldyr skelet giver strukturel støtte og beskyttelse til organer, giver mobilitet, og tjener som en kilde til calcium. Gennem hele livet, er den ekstracellulære knoglematrix kontinuerligt vendes for at opretholde knoglen stabilitet og stivhed. Denne proces kræver stramt koordineret aktivitet og samspil af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster. Osteoblaster er afledt fra multipotente mesenchymale stamceller og producere kollagen til dannelse af osteoid, det proteinholdige del af knoglematrix 10. Osteoblaster interagere med osteoklaster at opnå en afbalanceret aktivitet af begge celletyper, som er nødvendigt for at styre knogle homeostase 7. På grund af disse indviklede regulatoriske interaktioner, reaktioner på lægemiddelbehandling og knogle homeostase kan ikke fuldt undersøgt ved hjælp af in vitro-undersøgelser. Der er derfor et stort behov for dyremodeller. I forhold til indstillingerne for cellekultur, kan in vivo modeller giverværdifuld indsigt i de flercellede netværk i knoglen miljø.
Talrige musemodeller findes for en række humane knoglelidelser, herunder osteoporose 16. Men størrelsen og tilgængeligheden af museembryoer udgør betydelige begrænsninger for levende billeder af skelet processer. Lille benfisk, på den anden side, tjener som et attraktivt alternativ til in vivo-billeddannelse. Zebrafisk (Danio rerio) og Medaka (Oryzias latipes) er blevet populære dyremodeller for skelet forskning i de sidste to årtier 17, 19, 22, 24. Bone i benfisk og i pattedyr er meget ens, både på en strukturel og en fysiologisk niveau, og mange af de vigtigste regulatoriske gener og signalveje er bevaret 3. Som i pattedyr, benfisk omhyggeligt regulerer aktiviteten af osteoblaster og osteoklaster på balance knogledannelse og resorption 26. Vigtigst, optiske klarhed fish larver tillader brugen af fluorescerende reportere til at mærke knogleceller og forkalkede skelet matrixen 8, 9, 12, 21, 23, hvilket letter observation af cellulære processer i levende dyr. Desuden er en række genetiske værktøjer blevet genereret til at lette biomedicinsk relevant forskning i fisk. For Medaka især metoder til målrettet genmutation af CRISPR / Cas9 2, celle-slægt opsporing 6, og stedsspecifik transgenese 14 er for nylig blevet etableret og er nu almindeligt i brug 15.
Lille teleost larver med succes er blevet anvendt til kemiske skærme, som førte til opdagelsen af flere farmakologisk relevante lægemidler 1, 18.
Fiskelarver er tolerante over for lave koncentrationer af DMSO og er i stand til at absorbere forbindelser fra deres vandmiljø, enten gennem huden eller gennem mave-tarmkanalen 1, 5. Vores laboratorium tidligere reported transgene Medaka linjer, der udtrykker fluorescerende reportere i knogleceller under kontrol af forskellige osteoblast- og osteoclast-specifikke promotorer. Disse omfatter for tidligt fødte osteoblaster (kollagen 10a1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, modne osteoblaster (osteocalcin, OSC) 27, og osteoklaster (cathepsin K, ctsk) 24. Vi genererede også en transgen linie, der udtrykker osteoklast-inducerende faktor Receptor Activator of Nuclear-KB-ligand (RANKL) under kontrol af en varmechok-inducerbar promotor 24.
Induktion af RANKL i dette system resulterer i ektopisk dannelse af aktive osteoklaster. Dette fører til øget knogleresorption og en svær osteoporose-lignende fænotype, med drastisk reduceret mineralisering i hvirvellegemerne. Vi har for nylig vist, at osteoklastaktivitet i denne model kan blive blokeret af bisfosfonater etidronat og alendronat, two lægemidler, som normalt anvendes i human osteoporose terapi, derved valideret Medaka som et egnet modelsystem for osteoporose 27.
På grund af deres store kuld størrelse, hurtig udvikling, og lille størrelse af embryoner, transgene Medaka larver er unikt egnet til storstilet screening af osteoporose narkotika og til in vivo analyse af knogle celle adfærd. Studier i Medaka kan således effektivt supplere eksperimenter i cellekulturer og i mus, der er rettet mod at opdage nye terapeutiske mål og nye behandlingsformer for humane knoglelidelser.
I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en protokol til at behandle Medaka knogle-reporter larver med det fælles osteoporose narkotika, alendronat. Vi beskriver også i detaljer, hvordan behand- let larver er monteret og forberedt til direkte billedvisning af knoglematrix og knogleceller. Disse protokoller kan let tilpasses til andre små kemiske forbindelser, der enten arbejder som knogleanabolsk eller antiresorptive lægemidler. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med godkendte Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokoller fra National University of Singapore (R14-293).
1. Fisk Husbandry og opsamling af embryoner
- Hæv WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 og OSX: mCherry 21 enkelt- eller forbindelse-transgene Medaka fisk ved 26 ° C under en kontrolleret lys cyklus (14 timer lys, 10 h mørk) for at inducere gydning.
- Daglig gydningen finder sted under de første 30 min efter at lyset er tændt. Æggene holde sammen gennem filamenter og tillægger kvindens underliv i flere timer. Brug et fintmasket net til at fange en kvindelig voksen bærer et æg klynge. Lad fisken kort hvile i nettet og derefter forsigtigt massere fiskens mave til omhyggeligt fratage det befrugtede æg klynge fra maven af den kvindelige.
BEMÆRK: En sund Medaka kvindeligekan producere 10 - 20 æg hver dag i ca. 5 måneder. - Placer æggene i en 60 mm plastik petriskål. Brug en plastik pipette til at skylle de embryoner med 5 - 10 ml 0.3x Danieau opløsning (fisk medium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCI, 0,13 mM MgSO4, 0,2 mM Ca (NO3) 2 og 1,7 mM HEPES, pH 7,0). Tilsættes 1 ml af en 0,25% (vægt / volumen) methylenblåt stamopløsning til 2,5 L af fisk medium for at forhindre svampevækst.
- Rul forsigtigt æg klynge for at danne en knude af vedhæftede filamenter. Brug pincet til forsigtigt at fjerne de vedhæftede filamenter fra det befrugtede æg klynger for at opnå individuelle embryoner (figur 1A).
- Stage embryoner i henhold til Iwamatsu 2004 13.
- Kultur 20 - 30 embryoner pr 60 mm plast petriskål i et 28 ° C inkubator. Skift mediet dagligt for at sikre en normal udvikling af fostrene.
BEMÆRK: Tiden omkring klækning fase (8-9 d postfertilization,DPF) er især kritisk for overlevelse. Fjern frit flydende chorions at holde mediet rent og at sikre gode larver overlevelsesrater.
2. Transgene Embryo Screening
- Brug et stereomikroskop udstyret med en kviksølv lampe til fluorescens billeddannelse og GFP, RFP, og den fælles fiskeripolitiks filtrene til at screene transgene embryoner til fluorescerende reporter udtryk ved hjælp 40X forstørrelse.
- Visuelt identificere OSX: mCherry embryoner ved mCherry reporter udtryk i den tidlige-dannende kranieknogler, såsom cleithrum, på begge sider af den bageste hoved (figur 1B, pil), og parasphenoid ved en central position i den ventrale kraniet ( Figur 1B, pilespids).
BEMÆRK: reporterekspression starter fra 5 DPF fremefter 21. - Identificer ctsk: nlGFP embryoner ved stærk nlGFP udtryk i hovedet (figur 1C, pil) og hale (figur 1C, pilespids), startende fra6 DPF.
BEMÆRK: Endogene osteoklaster kun dannes efter 21 DPF. nlGFP-udtrykkende celler på dette tidlige stadium (6 DPF) er ikke osteoklaster men andre, hidtil karakteriseret, ctsk -positive celler 24. - Identificer RANKL: HSE: FFP transgene embryoner ved allestedsnærværende fælles fiskeripolitik udtryk efter en kort varme chok behandling i 20 min ved 39 ° C, udført på to DPF eller senere til screening.
BEMÆRK: RANKL og FFP transgener er under kontrol af den samme tovejs Heat Shock Element (HSE). CFP udtryk indikerer vellykket RANKL induktion 24. - Udfør en 1,5 - 2 timer varmeshockbehandling 9 DPF eller senere at inducere et stort antal ektopiske osteoklaster i bagagerummet region, hvilket følgelig resulterer i en osteoporose-lignende fænotype 24.
BEMÆRK: Transgene RANKL ekspression induceret ved 9 DPF resulterer i en ektopisk aktivering af hvilende osteoklast progenitorceller, som endogent ikke udløsesinden den 21. DPF. Brug et vandbad at opnå stabile 39 ° C betingelser. Lad petriskål indeholdende Medaka embryoner flyde på vandoverfladen. Sørg for, at låget på petriskålen er tør at forhindre sænkningen af skålen. - Screen embryoner fra sammensatte linjer, såsom RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP dobbelt-transgene og OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triple-transgen, ifølge ekspressionsmønsteret for hver enkelt transgen.
BEMÆRK: hemizygote og homozygote transgene embryoner blev præget af forskellige fluorescens niveauer i reporter transgen. Homozygote embryoer havde en fluorescensintensitet, at ca. fordoblet sammenlignet med den for hemizygote transgene. Sammensatte linjer, der var homozygote for både RANKL: HSE: fælles fiskeripolitik og ctsk: nlGFP blev opnået ved gentagne incrossing over flere generationer. For triple-transgene OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP fisk, homozygot RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP fisk blev krydset med homozygot OSX: mCherry luftfartsselskaber. Den resulterende heterozygot triple-transgene afkom blev hævet og incrossed at opnå embryoner er homozygote for RANKL: HSE: CFP. RANKL: HSE: CFP transgen skal være homozygot for at opnå en effektiv induktion af ektopiske osteoklaster.
Figur 1: WT og transgene Medaka Embryoner ved 7 D Postfertilization (DPF). A. WT embryoner observeret med lysfelt belysning. B. Transgene embryoer viser OSX: mCherry udtryk omkring cleithrum (pil) og parasphenoid (pilespids). C. Transgene embryoer viser ctsk: nlGFP udtryk i hovedet (pil) og hale (pilespids). Scale barer: 500 um.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
3. bisfosfonat Behandling af Medaka Larver
- Fremstille opløsninger indeholdende forskellige koncentrationer af biphosphonater (bps) for dosis-respons undersøgelser.
BEMÆRK: eksemplariske BP anvendes i denne protokol er alendronat.- Opløs alendronat i fisk medium ved en koncentration på 100 pg / ml for at fremstille en stamopløsning.
- Brug en vortex-blander for at sikre fuldstændig opløsning. stamopløsningen ved 4 ° C opbevares.
- Forbered forskellige arbejdsopløsningerne ved at fortynde stamopløsningen med fisk medium til en række koncentrationer (dvs. 25, 37,5, 50, 62,5, og 75 ug / ml).
BEMÆRK: Forskellige stoffer kan have forskellige absorption, fordeling, metabolisme og udskillelse (ADME) parametre, der skal overvejes under test ved hjælp af denne Medaka larver system. Ligeledes kan lægemidlet opløselighed og stabilitet variere, nårpåføres som en vandig opløsning. Mindre vandopløselige forbindelser skal muligvis først opløses i organiske opløsningsmidler, såsom DMSO. I dette tilfælde bliver en stamopløsning fremstillet i DMSO, som derefter yderligere fortyndet i fisk medium. Bemærk, at de arbejdende opløsninger i vand (fisk medium) kan opbevares i køleskab i flere wk. Dog skal opløsninger indeholdende DMSO opbevares ved stuetemperatur for at forhindre krystallisation.
- Transfer Medaka larver i seks-brønds plader (seks larver / brønd) til efterfølgende BP (alendronat) behandling.
- Fjern fisken medium forsigtigt med en ren plast pipette og tilføje et lille volumen (ca.. 0,5 ml) af alendronat opløsning til hver brønd.
- Undgå tilovers fisk medium som den tilsatte BP løsning kunne fortyndes, hvilket er særligt kritisk for mindre koncentrerede alendronat løsninger.
- Fjerne en lille mængde alendronat opløsning (op til 0,5 ml) fra hver brønd med en ren plast pipette og erstatte det med et større volumig (4 ml) af alendronat opløsning.
- Skift medium dagligt for at sikre normal embryoner udvikling.
4. Levende Farvning af mineraliseret-knoglematrix
- Opløs 0,5 g Alizarin complexon (ALC; alizarin-3-methyliminodieddikesyre) eller 0,05 g af calcein i 50 ml fisk medium at forberede 1% og 0,1% stamopløsninger hhv. Brug en vortex-blander for at sikre fuldstændig opløsning.
BEMÆRK: Fish medium uden tilsætning af methylenblåt anvendes i denne og de efterfølgende trin for at reducere autofluorescens i larverne. - Brug en sprøjte og engangsbrug filter (0,2 um) til at filtrere farvningsopløsningen. den filtrerede opløsning i mørke ved RT opbevares.
BEMÆRK: Farven af den filtrerede, klar ALC farvningsopløsning er mørk gul til orange. Farven af den filtrerede, klar calcein løsning er klart gul. Opløsninger kan anvendes i adskillige måneder. - Fortynd den filtrerede ALC eller calcein stamopløsning 01:10 i fisk mediumog inkuber Medaka larver i 1,5 - 2 timer (0,1% ALC opløsning) eller 2 - 2,5 timer (0,01% calcein opløsning) i en 28 ° C inkubator, hvis larver mellem 9 og 17 DPF anvendes. Opbevar prøverne i mørke.
- Overfør larverne til frisk fisk medium med en ren plast pipette.
- Fjern fisken medium med en ren plast pipette og tilsæt frisk fisk medium. Gentag dette trin for 3 - 4 gange, indtil der ikke rød- eller gul-farvet løsning (ALC eller calcein henholdsvis) er tilovers. Lad larver i fisk medium i 30 - 60 min inden montering til afbildning for at undgå epifluorescens fra mediet.
BEMÆRK: 0,1% ALC farvning løsning er skadeligt for Medaka larver i længere eksponeringstider. Inkubationstider på længere end 2 timer påvirke overlevelsen af larverne. Koncentration og farvning tid skal derfor optimeret til forskellige faser for at opnå optimale embryo overlevelse og farvningsresultaterne.
5. Levende Fluorescens Imaging p>
- Bedøver den Medaka larver med 0,01% tricaine (ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat) i fisk medium.
BEMÆRK: bedøvet larver bliver immobiliseret efter 5 - 10 minutter i tricaine opløsning, og normalt ligger enten på deres sider eller ryggen. - Bruge en plastic microloader at orientere larverne ifølge regionen af interesse. Orienteringen af larver anvendes i denne protokol er lateral.
- Brug et stereomikroskop med fluorescensbelysning til billeddannelse. Brug stor forstørrelse, når du tager billeder, der fokuserer på forskellige dele af larver (hoved, forreste kuffert, posterior kuffert, og hale). Stitch individuelle billeder sammen på overlappende områder ved hjælp af en passende billede-behandling software (mellemværker i figur 3G).
BEMÆRK: Dette hjælper til at forbedre kvaliteten af alle relevante kropsdele billede i den korrekte brændplan. - Retur larverne til fiskene medium for genopretning efter billeddannelse.
- Anesthetize larverne med 0,01% tricaine i fisk medium i 5 - 10 min, indtil de bliver immobiliseret.
- Opløs lavtsmeltende agarose til 1,5% i fisk medium ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Cool denne opløsning til ca. 30 ° C.
- Tilsæt 0,5 - 1 ml af væske 1,5% lavtsmeltende agarose i fisk medium til en glas-bund petriskål. Overfør bedøvet larver i opløsningen under anvendelse af en ren plast pipette.
BEMÆRK: Vær særlig forholdsregel, at temperaturen af den flydende lavtsmeltende agarose er lav nok til ikke skade larver. - Før agarose størkner, bruge en plastic microloader at skubbe larverne til bunden af petriskålen og orientere larverne ifølge regionen af interesse. Orienteringen af larver anvendes i denne protokol er lateral.
BEMÆRK: Prøverne er klar til konfokal levende billeddannelse efter agarose helt størkner. - Brug et konfokalt mikroskop til ACQuire billeder.
- Brug en 543 nm laser linje for mCherry og ALC farvning analyser. Brug en 488 nm laser linje for nlGFP og calcein farvning analyser.
- Efter billedbehandling, tilføje fisk medium til petriskålen og bruge et par fine sprøjte nåle (27 G x 1½ ") til forsigtigt at fjerne larverne fra agarose. Overfør larverne med residualt fastgjort agarose til en petriskål med fisk medium til at inddrive .
- Behandle billeder ved hjælp af et billede analyse software 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rigelige æg numre, samt den lille størrelse af larverne, gør Medaka en fremragende model til lægemiddelscreening. En enkelt plade med seks brønde blev anvendt til dyrkning op til 36 larver, som var tilstrækkelig til at tilvejebringe statistisk signifikante data. En anden stor fordel ved at bruge fisk til skelet analyse er muligheden for at gøre direkte billedvisning. Gennemsigtigheden af fiskelarver tillader brugen af fluorescerende proteiner til at mærke knogleceller samt anvendelsen af farvestoffer, som binder til knoglematrix for at visualisere mineralisering. Fiskelarver er lette at håndtere, og prøveforberedelse til billeddannelse er enkel (figur 2).
En RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP dobbelt transgene linje blev anvendt til at visualisere ektopisk dannelse af RANKL-induceret osteoklaster. Derudover OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triple-transgen larver blev anvendt til samtidig påvisningion af præmature osteoblaster og differentierede osteoklaster (Figur 3). Oversigt billeder blev taget med et stereomikroskop (figur 3A - C og F - H), mens konfokal mikroskopi blev anvendt til at visualisere processer på celleniveau (figur 3D, E, I, J pilespidser). ALC-farvede knoglematrix langs de neurale buer (na) og centra (c) (figur 3D), blev anvendt som reference til at bestemme positionen af fluorescensmærkede knogleceller (figur 3D og I).
En fordel ved samtidigt at visualisere osteoklaster og osteoblaster i samme intakt larver er, at antiresorptive vs. knogle-anabolske aktiviteter af en testet forbindelse kan skelnes. Til dette, er fordelingen af osteoklaster og osteoblaster bestemmes sammen allerede eksisterende og nydannede mineraliseret knogle matrix. SucFor store farvning af knoglematrix med ALC (rød) (figur 4A, B) efterfulgt af calcein (grøn) (figur 4C, D) afslører de novo mineraliseret knoglematrix (grøn) (figur 4E, F pilespidser). Denne analyse giver mulighed for kvantificering af satsen for knogledannelse. Øget de novo satser efter narkotikabehandling indikerer en knogle-anabolske virkning af den testede forbindelse. I modsætning hertil persistens af allerede eksisterende knogle matrix peger på en antiresorptive aktivitet af lægemidlet 27. Både ALC og calceinmærkninger i larverne er stabile i mindst to uger, så en kontinuerlig observation af ny knogledannelse i Medaka larver in vivo.
Figur 2: Skematisk diagram af Drug Treatment, Levende ALC Farvning og montering for konfokal Live-Imaging. A. En seks-brønds pladeanvendes til lægemiddelbehandling for at sikre tilstrækkelig plads til larverne. Den mineraliserede-bone matrix farves ved inkubation Medaka larver i 0,1% ALC i 1,5 - 2 timer i mørke. Stained larver skylles flere gange med fisk medium. 0,01% tricaine anvendes til at bedøve larver. B. Efter overførsel af bedøvet larver til lunken og flydende 1,5% lavtsmeltende agarose, er deres position justeret med en plast microloader. Larverne derefter monteres i henhold til regionen af interesse (f.eks er hvirveldyret kolonne bedst afbildet i sidebillede). Efter at agarosen er størknet, monteret Prøven er klar til konfokal billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:
Figur 4: Analyse af De Novo Mineralisering af Bone Matrix af Successiv Farvning af larver med ALC og Calcein ved 12 og 15 DPF, Henholdsvis. A, B. ALC-farvede skelet matrix ved 12 DPF. C, D. Calcein-farvede skelet matrix ved 15 DPF i samme larver. E, F. Sammenflettede billede viser den nyligt Mineralized knogle matrix ved spidserne af de neurale buer (grøn, pile). B, D og F. Konfokal stak af området boxed i A, C og E, hhv. Scale barer i A, C og E: 100 um. Scale barer i B, D og F: 50 uM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative billeder Viser en Mislykket og en vellykket Montering for Konfokal Imaging. AC. Mislykket montering i lav-smeltende agarose resulterer i en del af prøven (venstre) ligger uden for fokusplanet. DF. Vellykket montering viser alle regions af interesse i samme fokale plan. Scale barer: 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Alendronat behandling forebygger knogleresorption. ALC-farvede skelet matrix og ctsk: nlGFP-udtrykkende osteoklaster i transgene Medaka larver uden RANKL induktion (AC), med varmechok-induceret RANKL ekspression (DF), og med tilføjelsen af alendronat på samme dag som RANKL induktion (GI) . C, F og I. Konfokale stakke af de områder, boxed i A og B, D og E, G og H, hhv.C. ALC-farvede intakte rygsøjle uden RANKL induktion. F. RANKL-induceret, ctsk udtrykkende osteoklaster formular omkring de neurale buer og den centra, hvilket resulterer i en fuldstændig resorption af mineraliseret matrix af de neurale buer (pile) og i mangler i det centra (pilespidser). G. Tilføjelsen af alendronat har ingen effekt på dannelsen af ctsk: nlGFP-udtrykkende osteoklaster, men det blokerer knogleresorption og efterlader de neurale buer og centra intakt. Scale barer i A, B, D, E, G og H: 100 uM. Scale barer i C, F og jeg: 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Det er væsentligt, at betingelserne for varmechok behandling er konsistente og stabile, når man sammenligner forskellige prøver. Stabile temperaturforhold garanterer tilsvarende niveauer af RANKL induktion i transgene larver og dermed sammenlignelig osteoklastdannelse, hvilket kan bekræftes ved screening for ctsk: nlGFP ekspression. I sidste ende fører dette til en tilsvarende grad af induceret ektopisk knogleresorption og osteoporose-lignende læsioner, som valideres af ALC farvning. En sådan eksperimentel design tillader derefter til bestemmelse og sammenligning af virkningerne af forskellige antiresorptive lægemidler eller det samme stof anvendt i forskellige koncentrationer.
Ændringer og fejlfinding
Fiskelarver er meget skrøbelige og skal omhyggeligt håndteres under monteringen proces til billeddannelse. For optimal levende konfokal billedbehandling, larver er omhyggeligt positioned med en plastik microloader, snarere end pincet, for at undgå skader (figur 2B). Blommen forlængelse er mindre følsom over for berøring stimuli og kan bruges til at orientere larverne med en microloader og derved undgå larvernes bevægelighed under montering. Regionen af interesse skal monteres fladt for at sikre, at prøven kan være fokuseret på et kontaktpunkt fly under billeddannelse (figur 5). Bone celle adfærd er meget dynamisk og kræver stor tidsmæssig og rumlig opløsning under direkte billedvisning. Optimalt er time-lapse billeddannelse ved konfokal analyse ønskes at følge osteoblast-osteoklast interaktioner i løbet af flere timer i den levende larver. Men det kræver, særlige betingelser for at holde larverne live og i en fast position. Ved langvarig anæstesi, tilsættes en opløsning af 0,001% tricaine i fisk medium til at dække størknede agarose under billedbehandling. Dette forhindrer agarosen udtørrer og forhindrer pludseligt trækninger af larver under imaging over flere timer.
Begrænsninger af teknikken
Osteoporose er en sygdom, der oftest rammer ældre mennesker. Derfor bør en ideel in vivo model for osteoporose screening stof involverer voksne fisk. Indtil videre dog teknikken med direkte billedvisning beskrevet i denne rapport er begrænset til de embryonale og larvestadier. I øjeblikket tilgængelig konfokal imaging tillader ikke levende billeder af genetisk mærkede knogleceller i voksne fisk på grund af begrænsninger i indtrængningsdybde. Den seneste udvikling i Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), som giver mulighed for imaging dybt ind levende væv, sammen med tilgængeligheden af mindre pigmenterede "gennemsigtige" Medaka stammer, gør det tænkeligt, at denne begrænsning snart vil blive overvundet, og live billeder af knogleceller hos voksne Medaka fisk efter lægemiddelscreening vil være muligt.
Betydningen af Teknik med Respekt til eksisterende / Alternative Metoder
En unik kombination af direkte billedvisning og avancerede genetiske værktøjer har gjort små benfisk populært for biomedicinsk forskning - bone forskning i særdeleshed - og som in vivo modeller for screening stof. Med mulighed for at analysere celle-celle interaktioner i en intakt organisme, transgene Medaka linjer er unikt egnet for den levende billeddannelse af dynamiske cellulære processer under knogle modellering og remodellering. Fordi de deler mange gen-regulatoriske netværk til styring af knogle homeostase med pattedyr, in vivo-undersøgelser i Medaka kan supplere og endda overgå i vitro undersøgelser med pattedyr osteoblast og osteoklast celle-kultur assays.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Denne teknik
Andre end at teste enkelte forbindelser i en transgen baggrund, som beskrevet i denne protokol, fisk tilbyder også enkle metoder til at undersøge kombinationer af various lægemidler til mulig synergi eller indgreb af forbindelser. Endvidere er anvendelsen af en kombination af forskellige reporter linjer, for eksempel i forbindelse med en bestemt mutant baggrund, giver rige muligheder for at studere opførslen af knogleceller under forskellige stadier af knogle degeneration og reparation, eller i nærværelse af en knogle -modulating lægemiddel. Med sine unikke funktioner, der supplerer mus analyser, den Medaka osteoporose model giver en fremragende in vivo metode til at teste og kvantificere anabolske og antiresorptive virkninger af nye knogle-modulerende forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af tilskud fra Singapore Undervisningsministeriet (MOE, tilskud nummer 2013-T2-2-126) og National Institute of Health, USA (NIH, tildele nummer 1R21AT008452-01A1). TY modtog en kandidat stipendium fra NUS Biologisk Institut. Vi takker konfokale enhed af NUS Center for Bioimaging Sciences (CBIS) for deres konstante støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O.
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F.
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T.
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
