Abstract
Кость формирования остеобласты взаимодействуют с костными резорбции остеокластов координировать оборот костной матрицы и для управления скелетной гомеостаза. Оризии и данио личинки широко используются для анализа поведения костных клеток в процессе формирования костной ткани, дегенерации и ремонта. Их оптическая прозрачность позволяет визуализацию флуоресцентно меченый костных клеток и флуоресцентных красителей, связанных с минерализованной костной матрицы. Наша лаборатория сформировала трансгенная Оризии рыбы, которые выражают остеокластов индуцирующего рецептора фактора активатором ядерного фактора (Лиганда кВ RANKL) под контролем теплового шока, индуцируемого промотора. Внематочная выражение результатов RANKL в избыточном образовании активированных остеокластов, которые могут быть визуализированы в репортерных линий с выражением nlGFP под контролем катепсина К (ctsk) промотора. RANKL индукция и образование внематочной остеокластов приводит к тяжелым остеопорозом, как фенотипов. Соединение трансгенная оризия Liуказанные в другом месте , которые выражают ctsk: nlGFP в остеокластов, а также mCherry под контролем Osterix (OSX) промотора в преждевременной остеобластов, может быть использован для изучения взаимодействия обоих типов клеток. Это облегчает наблюдение в естественных условиях клеточного поведения в условиях костной дегенерации и ремонта. Здесь мы опишем использование этой системы, чтобы проверить препарат обычно используемый в терапии остеопороза человека и описывают протокол для живого изображения. Модель оризия дополняет исследования в области культуры и мышей клетки, а также предлагает новую систему для анализа в естественных условиях действия препарата в костной системе.
Introduction
Позвоночный каркас обеспечивает структурную поддержку и защиту органов, обеспечивающие мобильность, и служит в качестве источника кальция. На протяжении всей жизни, внеклеточный матрикс кости непрерывно перевернулась, чтобы поддерживать стабильность костной ткани и жесткость. Этот процесс требует сильно скоординированную деятельность и взаимодействие формирования костной остеобластов и костной резорбции остеокластов. Остеобласты получены из мезенхимальных стволовых клеток - предшественников и производят коллаген , чтобы сформировать остеоид белковый часть костной матрицы 10. Остеобласты взаимодействуют с остеокластов для обеспечения сбалансированного активность обоих типов клеток, который необходим для контроля гомеостаза кости 7. Из - за этих запутанных регуляторных взаимодействий, реакция на медикаментозное лечение и поддержании гомеостаза кости не может быть полностью изучены с помощью в пробирке исследования. Следовательно, существует большой спрос на животных моделях. По сравнению с установками для культивирования клеток, в естественных условиях модели могут обеспечитьценную информацию в многоклеточных сети в пределах окружающей среды кости.
Существует множество мышиные модели для различных заболеваний костей человека , включая остеопороз 16. Тем не менее, размер и доступность эмбрионов мыши представляют собой существенные ограничения для живого изображения скелетных процессов. Малый костистых рыб, с другой стороны, служит в качестве привлекательной альтернативы для визуализации в естественных условиях. Рерио (Danio rerio) и оризии (Oryzias latipes) стали популярными моделями на животных для исследования скелета в течение последних двух десятилетий 17, 19, 22, 24. Кости в костистых рыб и у млекопитающих очень похожи, как по структурным и на физиологическом уровне, и многие из ключевых регуляторных генов и сигнальных путей сохраняется 3. Как и у млекопитающих, костистых рыб тщательно регулируют активность остеобластов и остеокластов , чтобы сбалансировать образование костной ткани и резорбции 26. Самое главное, что оптическая прозрачность фиш Личинки позволяет использовать флуоресцентные репортеры маркировать костные клетки и кальцинированный скелетную матрицу 8, 9, 12, 21, 23, что облегчает наблюдение клеточных процессов в живом организме животного. Кроме того, ряд генетических инструментов сгенерирована для облегчения биомедицины соответствующих исследований в рыбе. Для оризии , в частности, методов направленной мутации генов с помощью CrispR / cas9 2, клеточной линии прослеживания 6 и сайт-специфической трансгенез 14 были недавно созданы и в настоящее время широко используется 15.
Малые личинки костистых были успешно использованы для химических экранов, которые привели к открытию нескольких фармакологически соответствующих препаратов 1, 18.
Личинки рыб терпимы к низкой концентрации ДМСО и способны поглощать соединений из их водной среды, либо через кожу или через желудочно - кишечный тракт 1, 5. Наша лаборатория ранее представительorted трансгенные линии оризии, которые выражают флуоресцентных репортерам в костных клеток под контролем различных osteoblast- и остеокластов конкретных промоутеров. К ним относятся преждевременные остеобласты (коллаген 10À1, col10a1; Osterix, OSX) 20, 21, зрелые остеобласты (остеокальцина, OSC) 27 и остеокластов (катепсина K, ctsk) 24. Мы также генерироваться трансгенной линии, выражающую остеокластов индуцирующие рецептор фактора активатором ядерного фактора кВ лиганд (RANKL) под контролем теплового шока-индуцируемого промотора 24.
Индукция RANKL в этой системе приводит к внематочной образованию активных остеокластов. Это приводит к увеличению костной резорбции и тяжелой остеопорозом, как фенотипа, с резко сниженной минерализацией в телах позвонков. Недавно мы показали, что активность остеокластов в этой модели может быть блокирован этидронатом и алендроната бисфосфонаты, ТВтO препараты , обычно используемые в терапии остеопороза человека, что подтверждает Оризии в качестве подходящей модельной системы для лечения остеопороза 27.
Из - за их большого размера выводка, быстрое развитие, и небольшого размера эмбрионов, трансгенная личинки оризия уникально подходят для крупномасштабного скрининга остеопороза препаратов и для анализа в естественных условиях поведения костных клеток. Исследования, проведенные в оризии, таким образом, могут эффективно дополнять эксперименты на клеточных культурах и у мышей, которые направлены на выявление новых терапевтических целей и новых методов лечения для костных заболеваний человека.
В настоящем исследовании мы опишем протокол для лечения Оризии личинок костного репортера с общим остеопорозом препарата, алендроната. Мы также подробно описывают, как личинки очищенная смонтированы и подготовлены для живого изображения костной матрицы и костных клеток. Эти протоколы могут быть легко адаптированы к другим небольших химических соединений, которые либо работают в качестве костного анаболического или антирезорбтивными препаратами. </ Р>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными Institutional по уходу за животными и использование комитета (IACUC) протоколов Национального университета Сингапура (R14-293).
1. Рыба Husbandry и Сборник Эмбрионы
- Поднимите WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: ГУ - ВШЭ: CFP 24, и OSX: mCherry 21 одно- или соединение с трансгенными оризия рыбы при температуре 26 ° С при контролируемом световом цикле (14 ч света, 10 ч темно) , чтобы вызвать нерест.
- Ежедневно нерест происходит в течение первых 30 мин после того, как включается свет. Яйца склеиваются через нитей и прикрепить к животу самки в течение нескольких часов. Используйте мелкоячеистой сети, чтобы поймать взрослых женщин, несущий кластер яйца. Пусть рыба ненадолго отдохнуть в сети, а затем нежно массировать живот рыбы тщательно обирать оплодотворенной яйцеклетки кластер из брюшной полости самки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровый оризия женскийможет производить 10 - 20 яиц каждый день в течение примерно 5 месяцев. - Поместите яйца в 60 мм пластиковой чашке Петри. Используйте пластиковую пипетку для полоскания эмбрионов с 5 - 10 мл 0.3x Danieau , решение которого (рыбьего среды, 19,3 мМ NaCl, 0,23 мМ KCl, 0,13 мМ MgSO 4, 0,2 мМ Са (NO 3) 2 и 1,7 мМ HEPES, рН 7,0). Добавить 1 мл 0,25% (вес / объем) метиленового синего маточного раствора до 2,5 л рыбьего среды, чтобы предотвратить рост грибка.
- Аккуратно покрутите яйцо кластера, чтобы сформировать узел крепления нитей. Используйте пинцет , чтобы аккуратно удалите нити крепления из оплодотворенных яиц кластеров для получения индивидуальных эмбрионов (Рис . 1А)
- Этап эмбрионов в соответствии с Iwamatsu 2004 13.
- Культура 20 - 30 эмбрионов на 60 мм пластиковой чашки Петри в 28 ° C инкубатора. Изменение среды ежедневно, чтобы обеспечить нормальное развитие эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время вокруг стадии инкубирования (8 - 9 d после оплодотворения,DPF), имеет особенно важное значение для выживания. Удалить свободно плавающие хорионов держать среду в чистоте и обеспечить хорошие показатели выживаемости личинок.
2. Трансгенные Эмбрион Скрининг
- Используйте стереомикроскопа оборудованный ртутной лампой для флуоресцентной визуализации и GFP, RFP и фильтров СФП для скрининга трансгенных эмбрионов для флуоресцентного экспрессии репортера с использованием 40-кратном увеличении.
- Визуально определить OSX: mCherry эмбрионов путем экспрессии репортерного mCherry в начале формирования костей черепа, такие как ключицы, по обе стороны от задней головки (рис 1B, стрелка), а также парасфеноидом, в центральном положении в вентральном черепе ( Рисунок 1B, стрелолист).
Примечание: Выражение Репортер начинается с 5 DPF года 21. - Определение ctsk: nlGFP эмбрионов сильными выражением nlGFP в головке (рис 1C, стрелка) и хвост (рис 1C, стрелолист), начиная с6 DPF.
Примечание: Эндогенные остеокласты образуют только после того, как 21 DPF. nlGFP-клеток , экспрессирующих на этой ранней стадии (6 DPF) не являются остеокласты , но и другие, до сих пор не охарактеризованных, ctsk -положительным клетки 24. - Определение RANKL: HSE: CFP трансгенные эмбрионы вездесущими экспрессии CFP после короткого теплового шока обработки в течение 20 мин при 39 ° С, проведенной в 2 DPF или позже для целей скрининга.
Примечание: The RANKL и CFP трансгенов находятся под контролем одного и того же двунаправленного теплового шока Element (HSE). Выражение CFP свидетельствует об успешном окончании RANKL индукции 24. - Выполните 1.5 - 2 ч тепловой обработки шока на 9 DPF или более поздняя версия, чтобы вызвать большое количество эктопических остеокластов в области туловища, что в свою очередь приводит к остеопорозу подобный фенотип 24.
Примечание: Трансгенные выражение RANKL индуцированной на 9 результатов DPF в внематочной активации покоящихся клеток-предшественников остеокластов, которые эндогенно не сработавшихдо 21 DPF. С помощью водяной бани, чтобы получить стабильные 39 ° C условий. Пусть чашки Петри, содержащие медака эмбрионы плавают на поверхности воды. Убедитесь, что крышка чашки Петри высохнет, чтобы предотвратить потопление блюдо. - Эмбрионы экран от составных линий, таких , как RANKL: HSE: КФП / ctsk: nlGFP дважды трансгенная и OSX: mCherry / RANKL: HSE: КФП / ctsk: nlGFP тройным трансгенными, в соответствии с паттерном экспрессии каждого отдельного трансгена.
Примечание: гемизиготной и гомозиготные трансгенные эмбрионы отличались различными уровнями флуоресценции репортера трансгена. Гомозиготных эмбрионы имели интенсивность флуоресценции, что примерно вдвое по сравнению с гемизиготных трансгенов. Составные линии , которые были гомозиготными для обоих RANKL: ГУ - ВШЭ: CFP и ctsk: nlGFP были получены при повторном incrossing в течение нескольких поколений. Для тройной трансгенными OSX: mCherry / RANKL: ГУ - ВШЭ: CFP / ctsk: nlGFP рыбы, гомозиготные RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP рыбы были скрещены с гомозиготной OSX: mCherry носителей. Полученный в результате гетерозиготной тройным трансгенного потомства были подняты и incrossed для получения эмбрионов , гомозиготных по RANKL: HSE: CFP. RANKL: HSE: КФП трансген , должна быть гомозиготной для того , чтобы получить эффективную индукцию эктопической остеокластов.
Рисунок 1: WT и Трансгенные Оризии Эмбрионы на 7 D после оплодотворения (DPF). A. WT эмбрионов наблюдается при светлопольному освещении. B. Трансгенные эмбрионы , показывающие OSX: mCherry экспрессию вокруг ключицы (стрелка) и РагазрпепоЫеит (стрелки). C. Трансгенные эмбрионы , показывающие ctsk: nlGFP выражение в голове (стрелка) и хвост (стрелолист). Шкала баров: 500 мкм.025 / 55025fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
3. Bisphosphonate Лечение оризии Личинка
- Готовят растворы, содержащие различные концентрации бисфосфонатов (БТС) для исследований доза-реакция.
Примечание: в качестве примера BP используется в данном протоколе является алендронат.- Растворите алендроната в рыбьем среде при концентрации 100 мкг / мл, чтобы приготовить раствор.
- С помощью вихревой мешалки, чтобы обеспечить полное растворение. Хранить исходный раствор при 4 ° С.
- Подготовьте различные рабочие растворы путем разбавления исходного раствора рыбьего среды к серии концентраций (т.е., 25, 37.5, 50, 62.5 и 75 мкг / мл).
Примечание: Различные препараты могут иметь различные Абсорбция, распределение, метаболизм и параметры (пиальных ADME) экскреции, которые необходимо учитывать при тестировании с использованием этой системы личинок Оризии. Кроме того, растворимость и стабильность лекарственного средства может изменяться приприменяется в виде водного раствора. Менее растворимые в воде соединения, возможно, должны быть сначала растворяют в органических растворителях, таких как ДМСО. В этом случае исходный раствор приготавливают в ДМСО, который затем разбавленным в рыбьем среде. Обратите внимание, что рабочие растворы в воде (рыбы среде) можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Тем не менее, растворы, содержащие DMSO должны храниться при комнатной температуре с целью предотвращения кристаллизации.
- Передача оризия личинок в шесть-луночные планшеты (шесть личинок / лунку) для последующего BP (алендронат) лечения.
- Удалите рыбу среду тщательно с помощью чистой пластиковой пипетки и добавить небольшой объем (прибл. 0,5 мл) алендроната раствора в каждую лунку.
- Избегайте рыбы остатки среды, поскольку добавленное решение ВР может разбавленный, что особенно важно для менее концентрированных растворов алендронат.
- Удалить небольшой объем раствора алендроната (до 0,5 мл) из каждой лунки с чистой пластиковой пипеткой и заменить его большей VOLUя (4 мл) раствора алендроната.
- Изменение среднего ежедневно, чтобы обеспечить нормальное развитие эмбрионов.
4. Живой Окрашивание Минерализированная-костной матрицы
- Растворить 0,5 г ализарин комплексона (ALC; ализарин-3-methyliminodiacetic кислоты) или 0,05 г кальцеина в 50 мл среды рыбы для приготовления 1% и 0,1% растворы, соответственно. С помощью вихревой мешалки, чтобы обеспечить полное растворение.
Примечание: Рыба среда без добавления метиленового синего используется в этом и последующие шаги, чтобы уменьшить аутофлуоресценцию у личинок. - С помощью шприца и одноразовым фильтр (0,2 мкм) для фильтрации окрашивание раствора. Храните отфильтрованный раствор в темноте при комнатной температуре.
Примечание: Цвет отфильтрованной, прозрачного ALC красящим раствором темно-желтого до оранжевого. Цвет Отфильтрованный прозрачный раствор кальцеиновой ярко-желтый. Решения могут быть использованы в течение нескольких месяцев. - Развести отфильтрованный ALC или кальцеин исходного раствора в соотношении 1:10 в среде рыби инкубировать личинок Оризии в течение 1,5 - 2 ч (0,1% раствор) ALC или 2 - 2,5 ч (0,01% раствор кальцеин) в 28 ° C инкубаторе, если используются личинки между 9 и 17 DPF. Храните образцы в темноте.
- Переносят личинки к свежей рыбы среде, используя чистую пластиковую пипетку.
- Удалите рыбу среду с чистой пластиковой пипетки и добавить свежую рыбу среду. Повторите этот шаг для 3 - 4 раза, пока не красно или желто-окрашивали раствором (ALC или кальцеина, соответственно), что осталось. Оставьте личинок в рыбе среде в течение 30 - 60 мин перед установкой их для работы с изображениями, чтобы избежать эпифлуоресцентной из среды.
Примечание: 0,1% раствор ALC окрашивание вредно для личинок Оризии в течение длительного времени воздействия. Инкубационный времена больше, чем 2 ч влияют на выживаемость личинок. Поэтому концентрация и окрашивание время, должны быть оптимизированы для различных этапов для достижения оптимальных результатов выживания эмбриона и окрашивания.
5. Живая флуоресцентной томографии р>
- Обезболить личинки Оризии с 0,01% Tricaine (этил-3-аминобензойной метансульфоната) в рыбе среде.
Примечание: наркотизированных личинки иммобилизации через 5 - 10 мин в растворе Tricaine и обычно лежат либо на боку или спине. - Используйте пластиковую microloader сориентировать личинок в соответствии с интересующей нас области. Ориентацию личинок, используемого в данном протоколе боковой.
- Используйте стереомикроскопа с флуоресцентной подсветкой для работы с изображениями. Используйте большое увеличение при съемке, фокусируясь на различных частях личинок (голова, передняя багажника, задняя багажника, и хвост). Вышивание отдельных изображений вместе в пересекающихся областях с использованием подходящего программного обеспечения для обработки изображений (Вставки на рис 3G).
Примечание: Это помогает улучшить качество изображения всех соответствующих частей тела в правильном фокальной плоскости. - Возвращение личинок рыбы среды для восстановления после визуализации.
- Обезболить личинок с 0,01% Tricaine в среде рыб в течение 5 - 10 мин, пока они не станут обездвижен.
- Растворите легкоплавкой агарозы до 1,5% в рыбе среде путем его нагрева в микроволновой печи. Холодный этот раствор до приблизительно 30 ° С.
- Добавить 0,5 - 1 мл жидкости 1,5% легкоплавких агарозы в среде рыб к стеклянным дном чашки Петри. Передача под наркозом личинок в раствор, используя чистую пластиковую пипетку.
Примечание: Примите особые меры, чтобы температура жидкости из агарозы с низкой плавления достаточно низкой, чтобы не повредить личинок. - Перед агарозном затвердевает, использовать пластмассовый microloader толкать личинок на дно чашки Петри и ориентируют личинок в соответствии с интересующей области. Ориентацию личинок, используемого в данном протоколе боковой.
Примечание: Образцы готовы к конфокальной живого изображения после того, как агароза полностью затвердевает. - С помощью конфокальной микроскопии для Acquire изображения.
- С помощью лазерной линии на 543 нм для mCherry и ALC окрашивания анализов. С помощью лазерной линии 488 нм для nlGFP и кальцеин окрашивания анализов.
- После того, как изображения, добавить рыбу среду в чашку Петри и использовать пару тонких игл шприцев (27 G х 1 ½ "), чтобы тщательно удалить личинок из агарозы. Переносят личинки с остаточно прикреплены агарозы в чашку Петри с рыбой среды для восстановления ,
- Обработки изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображения 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O.
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F.
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T.
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
