Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ותרופות טיפול Published: January 1, 2017 doi: 10.3791/55025
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 2NUS Centre for Bioimaging Sciences (CBIS), National University of Singapore

Abstract

עצם יוצרי אוסטאובלסטים אינטראקציה עם osteoclasts-resorbing עצם לתאם את המחזור של מטריקס העצם לשלוט הומאוסטזיס שלד. Medaka וזחלי דג זברה נמצאים בשימוש נרחב כדי לנתח את ההתנהגות של תאי עצם במהלך היווצרות, ניוון עצם, ותיקון. הבהירות האופטית שלהם מאפשרת ההדמיה של תאי עצם צבעי ניאון שכותרתו fluorescently כבול מטריצת שלד mineralized. המעבדה שלנו יצרה דגי medaka המהונדס המבטאים את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של ​​מקדם הלם-מושרה חום. ביטוי אקטופי של תוצאות RANKL להיווצרות העודפת של osteoclasts מופעל, אשר ניתן דמיין בקווים הכתב עם ביטוי nlGFP תחת השליטה של אמרגן cathepsin K (ctsk). אינדוקצית RANKL והיווצרות osteoclast אקטופי מובילה פנוטיפים אוסטאופורוזיס דמוי חמורים. li medaka מהונדס מתחםנס מבטאי ctsk: nlGFP ב osteoclasts, כמו גם mCherry תחת השליטה של אמרגן osterix (OSX) ב אוסטאובלסטים מוקדמת, יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה של שני סוגי התאים. זה מקל על התצפית in vivo של התנהגות הסלולר בתנאים של ניוון העצם ואת החלמתה. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת זו כדי לבדוק תרופה המשמשת בדרך כלל בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם מתאר פרוטוקול הדמיה לחיות. מודל medaka מוסיף למחקרים בתרבות תא ועכברים, ומציע מערכת חדשה לניתוח vivo של פעולת תרופה במערכת השלד.

Introduction

שלד החוליות מספק תמיכה מבנית והגנה על איברים, מאפשר ניידות, ומשמש מקור לסידן. לכל אורך חייו, מטריצת העצם התאית מופעלת מעל רף כדי לשמור על יציבות עצם ונוקש. תהליך זה דורש פעילות מתואמת בחוזקה הגומלין של אוסטאובלסטים יוצרי העצם osteoclasts-resorbing העצם. Osteoblasts נגזרות אבות mesenchymal מולטיפוטנטיים ולייצר קולגן ליצירת דמוי עצם, החלק חלבוניים של מטריקס העצם 10. Osteoblasts אינטראקציה עם osteoclasts להשיג פעילות מאוזנת של שני סוגי התאים, אשר נדרש שליטת עצם הומאוסטזיס 7. בגלל אינטראקציות רגולציה המורכבות האלו, תגובות טיפול תרופתי הומאוסטזיס עצם לא ניתן לבדוק באופן מלא באמצעות במבחנה. לפיכך, קיימת דרישה חזקה במודלים של בעלי חיים. בהשוואה להגדרות תרבית תאים, במודלים vivo יכול לספקתובנה חשובה רשתות רבות-תאי בתוך סביבת העצם.

במודלים של עכברים רבים קיימים עבור מגוון רחב של הפרעות עצמות אדם כוללים אוסטאופורוזיס 16. עם זאת, הגודל והנגישות של עוברי עכברים מייצגים מגבלות משמעותיות עבור הדמית חיה של תהליכי שלד. דגים teleost קטנים, ומצד שני, לשמש חלופה אטרקטיבית הדמיה in vivo. דג זברה (Danio rerio) ו medaka (Oryzias latipes) הפכו במודלים של בעלי חיים פופולריים למחקר שלד במהלך שני העשורים האחרונים 17, 19, 22, 24. עצם חוליות דגים ביונקים דומה מאוד, הוא על מבני ברמה פיזיולוגית, ורבי גני רגולטוריים מפתח מסלולי איתות שמורים 3. כמו יונקים, דגים teleost בזהירות להסדיר את הפעילות של אוסטאובלסטים ו osteoclasts לאזן היווצרות העצם ספיגת 26. והחשוב מכל, הבהירות האופטית של fish זחלים מאפשרים שימוש כתבי ניאון לתייג תאי עצם ומטריצת השלד המסוידת 8, 9, 12, 21, 23, המאפשרת התצפית של תהליכים תאיים בתוך החי. בנוסף, שורה של כלים גנטיים נוצרה כדי להקל על מחקר biomedically רלוונטי בדגים. לקבלת medaka בפרט, שיטות מוטצית גן ממוקדת על ידי CrispR / Cas9 2, תא שושלת התחקות 6, ואתר ספציפי transgenesis 14 הוקם לאחרונה וכעת הם נרחב בשימוש 15.

זחלי חוליות קטנים שמשו בהצלחה עבור מסכים כימי, אשר הוביל לגילוי של מספר תרופות רלוונטיות פרמקולוגית 1, 18.

הזחלים דג סובלניים לריכוזים נמוכים של DMSO והם מסוגלים לספוג תרכובות מן הסביבה המימית שלהם, או דרך העור או דרך מערכת העיכול 1, 5. נציג המעבדה שלנו בעברקווי medaka מהונדסים orted מבטאי כתבי ניאון בתאי עצם בשליטת osteoblast- השונה ומקדמים ספציפיים osteoclast. אלה כוללים אוסטאובלסטים מוקדמים (קולגן 10a1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, אוסטאובלסטים בוגר (osteocalcin, OSC) 27, ו osteoclasts (cathepsin K, ctsk) 24. כמו כן, אנו שנוצרנו קו מהונדס המבטא את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של מקדם הלם-מושרה חום 24.

אינדוקציה של RANKL במערכת זו התוצאה היא ההיווצרות אקטופי של osteoclasts הפעיל. זה מוביל ספיגת עצם מוגברת פנוטיפ אוסטאופורוזיס דמוי חמור, עם מינרליזציה באופן דרסטי בגופים בחוליות. הראינו לאחרונה כי פעילות האוסטאוקלסטים במודל זה יכול להיחסם על ידי etidronate ביספוספונטים ו alendronate, TWתרופות o נפוצות בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם, ובכך אימות medaka כמערכת מודל מתאימה אוסטאופורוזיס 27.

בשל גדליו הגוזלים הגדולים שלהם, התפתחות מהירה, וגודל קטן של עוברים, זחלי medaka מהונדסים מתאימים בצורה ייחודית להקרנה בקנה המידה הגדולה של תרופות לאוסטאופורוזיס לניתוח vivo של התנהגות תא עצם. עיוני medaka ובכך יכולים להשלים ניסויים ביעילות בתרביות תאים והן בעכברים ומיועדים לגלות מטרות טיפוליות חדשות טיפולים חדשניים להפרעות עצמות אדם.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לטיפול זחלי medaka עצם כתב עם התרופה לאוסטאופורוזיס המשותפת, alendronate. כמו כן, אנו מתארים בפירוט כיצד מטופלים הזחלים הם רכובים והוכנו הדמיה חיה של מטריקס העצם תאי עצם. ניתן פרוטוקולים אלה להתאים בקלות תרכובות כימיות קטנות אחרות כי גם לעבוד אנבוליים עצם או תרופות תרופתיות. </ P>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים אישרה ועדת שימוש (IACUC) פרוטוקולים של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור (R14-293).

1. בעלי דגים ואת האוסף של עובר

  1. תרי WT, ctsk: 24 nlGFP, RANKL: HSE: CFP 24, ו OSX: mCherry 21 דגים יחידים או תרכובת מהונדסת medaka ב 26 מעלות צלזיוס מתחת מחזור אור מבוקר (14 שעות אור, 10 שעות חושכות) כדי לגרום השרצה.
  2. השרצה יומית מתקיימת במהלך 30 הדקות הראשונות אחרי האור דולק. הביצים נדבקות זה לזה באמצעות חוטים לצרף את הבטן של הנקבה במשך כמה שעות. השתמש נטו בסדר-מרושת לתפוס מבוגר נקבה נושאת אשכול ביצה. תנו דגים למנוחה קצרה ברשת ולאחר מכן לעסות בעדינות את הבטן של הדג להתפשט באשכול הביצית המופרית בזהירות מהבטן של הנקבה.
    הערה: נקבת medaka בריאהיכול לייצר 10 - 20 ביצים כל יום במשך כ 5 חודשים.
  3. מניחים את הביצים לתוך צלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ. השתמש פיפטה פלסטיק לשטוף את העוברים עם 5 - 10 הפתרון של מ"ל של 0.3x Danieau (בינוני דגים; 19.3 מ"מ NaCl, 0.23 KCl מ"מ, 0.13 מ"מ MgSO 4, 0.2 מ"מ Ca (NO 3) 2, ו -1.7 מ"מ HEPES, pH 7.0). הוסף 1 מ"ל של% 0.25 (w / v) פתרון המניות מתילן כחול ל -2.5 ליטר של המדיום דגים כדי למנוע את צמיחת הפטריות.
  4. בעדינות לגלגל אשכול ביצה כדי ליצור קשר של חוטים מצורפים. שימוש במלקחיים כדי להסיר החוטים המצורפים בקפידה מתוך אשכולות ביצית המופרים להשיג עובר בודד (איור 1 א).
  5. לביים את העוברים על פי Iwamatsu 2004 13.
  6. תרבות 20 - 30 עובר לכל 60 מ"מ פלסטיק צלחת פטרי C חממת 28 °. שינוי המדיום יומי על מנת להבטיח התפתחות תקינה של העוברים.
    הערה: בפעם סביב הבמה הבקיעה (8 - 9 D postfertilization,DPF) הוא קריטי במיוחד עבור הישרדות. הסר chorions "פנויות" לשמור המדיום נקי כדי להבטיח שיעורי הישרדות זחל טובים.

2. הקרנת עובר טרנסגניים

  1. השתמש סטראו מצויד מנורה כספית עבור דימות פלואורסצנטי ו- GFP, RFP, ומסנני CFP להקרין עוברים מהונדסים לביטוי כתב ניאון באמצעות גדלת 40X.
  2. ראייה לזהות OSX: עוברים mCherry על ידי ביטוי הכתב mCherry בתחילת שנות יוצרי עצמות הגולגולת, כגון cleithrum, משני צידי הראש האחורי (איור 1 ב ', חץ), ואת parasphenoid, במיקום מרכזי הגולגולת הגחון ( איור 1 ב ', ראש חץ).
    הערה: הביטוי Reporter מתחיל מ 5 DPF ואילך 21.
  3. זהה ctsk: עוברים nlGFP ידי ביטוי nlGFP חזק בראש (איור 1 ג, חץ) וזנב (איור 1 ג, ראש חץ), החל6 DPF.
    הערה: osteoclasts אנדוגני מהווה רק לאחר 21 DPF. nlGFP להביע תאים בשלב מוקדם זה (6 DPF) אינם osteoclasts אבל אחרים, עד כה uncharacterized, ctsk תאים -positive 24.
  4. זהה RANKL: HSE: עוברים מהונדס CFP ידי ביטוי CFP בכל מקום אחרי טיפול הלם חום קצר במשך 20 דקות ב 39 מעלות צלזיוס, שנערך ב -2 DPF או במאוחר למטרות ההקרנה.
    הערה: transgenes RANKL ו CFP נמצא בשליטתו של אותו יסוד הלם החום דו-כיוונית (HSE). ביטוי CFP מציין 24 אינדוקציה RANKL מוצלח.
  5. בצע 1.5 - טיפול בהלם חום 2 שעות ב 9 DPF או במאוחר לגרום למספר גדול של osteoclasts חוץ רחמי באזור תא המטען, אשר כתוצאה מכך גורמת פנוטיפ אוסטאופורוזיס דמוי 24.
    הערה: הביטוי RANKL טרנסגניים מושרה 9 תוצאות DPF ב מהפעלה אקטופי של ובתאים osteoclast רדומים, אשר באופן אנדוגני אינה מופעלתלפני 21 DPF. השתמש באמבט מים כדי להשיג תנאי 39 ° C יציבים. תנו עוברים Medaka צלחת פטרי המכילה לצוף על פני המים. ודאו המכסה של צלחת פטרי יבש כדי למנוע טביעתה של המנה.
  6. עוברים מסך מקווי המתחם, כגון RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP פעמיים מהונדס ו OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP משולשת מהונדס, על פי דפוס הביטוי של כל transgene הפרט.
    הערה: Hemizygous ו הומוזיגוטים עובר מהונדס התאפיינו רמות קרינה שונות של transgene הכתב. עובר הומוזיגוטים הייתה עוצמת קרינה כי הייתה כ הוכפלה בהשוואה לזו של transgenics hemizygous. קווי מתחם שהיו הומוזיגוטים הן RANKL: HSE: CFP ו ctsk: nlGFP התקבלו על ידי incrossing חזר במשך כמה דורות. עבור OSX משולשת מהונדס: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: דגים nlGFP, RANKL הומוזיגוטים: HSE: CFP / ctsk: דגי nlGFP היו שלובים עם OSX הומוזיגוטים: ספקי mCherry. הצאצאים הטרוזיגוטיים משולש המהונדס וכתוצאה מכך הועלו incrossed להשיג עוברי הומוזיגוטים RANKL: HSE: CFP. RANKL: HSE: transgene CFP חייב להיות הומוזיגוטים על מנת לקבל האינדוקציה היעילה של osteoclasts חוץ הרחמים.

איור 1

איור 1: WT ו מהונדס Medaka עוברים ב -7 D Postfertilization (DPF). א. עובר WT ציין עם תאורת brightfield. B. עוברים מהונדס מראה OSX: ביטוי mCherry ברחבי cleithrum (חץ) parasphenoid (ראש חץ). ג. עוברים מהונדס מראה ctsk: ביטוי nlGFP בראש (חץ) והזנב (ראש חץ). ברי סולם: 500 מיקרומטר.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. טיפול Bisphosphonate של Medaka הזחלים

  1. הכן פתרונות המכילים ריכוזים שונים של ביספוספונטים (BPS) ללימודי מנה-תגובה.
    הערה: BP למופת להשתמש בפרוטוקול זה הוא alendronate.
    1. ממיסים alendronate במדיום דגים בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​להכין פתרון המניות.
    2. במיקסר מערבולת כדי להבטיח פירוק מוחלט. אחסן את הפתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. הכן פתרונות עבודה שונים על ידי דילול פתרון המניות עם מדיום דגים לסדרה של ריכוזים (כלומר, 25, 37.5, 50, 62.5, ו -75 מיקרוגרם / מיליליטר).
      הערה: סמים שונים עשויים להיות קליטים שונים, הפצה, מטבוליזם, והפרשה (ADME) פרמטרים, אשר יש לקחת בחשבון בעת ​​בדיקת שימוש זה medaka זחלי מערכת. כמו כן, מסיסות ויציבות תרופה עשויות להשתנות כאשרמיושם כמו בתמיסה מימית. פחות תרכובות מסיסים במים ייתכן שיהיה צורך מומס הראשון בממסים אורגניים, כגון DMSO. במקרה זה, פתרון המניות מוכן ב DMSO, אשר לאחר מכן הוא מדולל יותר במדיום דגים. ראוי לציין, כי פתרונות קידוח במים (בינוני דגים) ניתן לאחסן במקרר למשך כמה wk. עם זאת, פתרונות המכיל DMSO חייב להיות מאוחסן על RT כדי למנוע התגבשות.
  2. העברת זחלים medaka לתוך צלחות שש היטב (שישה הזחלים / טוב) עבור עוקבות BP (alendronate) טיפול.
  3. הסר בינוני הדג בזהירות בעזרת פיפטה פלסטיק נקי להוסיף נפח קטן (כ. 0.5 מ"ל) של פתרון alendronate היטב כל אחד.
  4. הימנע בינוני דגים שאריות, כפתרון הוסיף BP יכול להיות מדולל, אשר היא קריטית במיוחד עבור פתרונות alendronate פחות מרוכז.
  5. הסר נפח קטן של פתרון alendronate (עד 0.5 מ"ל) מבאר כל עם טפטפת פלסטיק נקי ולהחליפה volu גדוללי (4 מ"ל) של פתרון alendronate.
  6. שנה בינונית מדי יום כדי להבטיח התפתחות עוברים נורמלית.

4. מכתים חיה של מטריקס עצם Mineralized

  1. ממיסים 0.5 גרם של Alizarin complexone (ALC; Alizarin-3-methyliminodiacetic חומצה) או 0.05 גרם של calcein ב 50 מ"ל של מדיום דגים להכין 1% ו -0.1% פתרונות המניות, בהתאמה. במיקסר מערבולת כדי להבטיח פירוק מוחלט.
    הערה: בינוני דגים ללא תוספת של מתילן כחול משמשת זה ואת הצעדים הבאים כדי להפחית autofluorescence ב הזחלים.
  2. שימוש במסנן מזרק לשימוש חד-פעמי (0.2 מיקרומטר) כדי לסנן את הפתרון מכתים. אחסן את הפתרון המסונן בחושך ב RT.
    הערה: הצבע של מסונן, ברור הפתרון מכתים ALC הוא צהוב כהה לכתום. הצבע של פתרון calcein המסונן, הברור הוא צהוב בהיר. פתרונות ניתן להשתמש במשך מספר חודשים.
  3. לדלל את מניות ALC או calcein מסונן פתרון 1:10 ב בינוני דגיםדגירת זחלי medaka עבור 1.5 - 2 h (0.1% פתרון ALC) או 2 - 2.5 שעות (פתרון 0.01% calcein) באינקובטור 28 ° C אם זחלים בין 9 ו -17 DPF משמשים. שמור את הדגימות בחושך.
  4. מעבירים את הזחלים עד בינוני דגים טריים בעזרת פיפטה פלסטיק נקי.
  5. הסר בינוני דגים עם טפטפת פלסטיק נקי ולהוסיף בינוני דגים טריים. חזור על פעולה זו במשך 3 - 4 פעמים עד אין פתרון אדום או צהוב מוכתם (ALC או calcein, בהתאמה) שנשאר. השאירו את הזחלים במדיום דגים עבור 30 - 60 דקות לפני מקבע אותם הדמיה להימנע epifluorescence מהמדיום.
    הערה: 0.1% פתרון מכתים ALC מזיק הזחלים medaka לזמנים בחשיפה ממושכת. פעמים הדגירה של יותר מ -2 h להשפיע על ההישרדות של הזחלים. ריכוז וזמן מכתים ולכן צריכים להיות מותאם במיוחד בשלבים שונים על מנת להשיג תוצאות הישרדות מכתים עובר אופטימליות.

5. דימות פלואורסצנטי חי p>

  1. להרדים את הזחלים medaka עם 0.01% Tricaine (אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate) במדיום דגים.
    הערה: מורדמים הזחלים להיות משותק לאחר 5 - 10 דקות בתמיסה Tricaine ובדרך כלל משקרים או על צדם או גבם.
  2. השתמש microloader פלסטיק להתמצא הזחלים בהתאם לאזור של עניין. האוריינטציה של הזחלים להשתמש בפרוטוקול זה הוא לרוחב.
  3. השתמש stereomicroscope עם תאורה פלואורסצנטי הדמיה. השתמש בהגדלה גדולה כאשר לוקח תמונות, התמקדות בחלקים שונים של הזחלים (הראש, גזע קדמי, מטען אחורי, וזנב). וסטיץ 'תמונות בודדות יחד אזורים חופפים באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה (ריבועים באיור 3G).
    הערה: פעולה זו מסייעת לשפר את איכות התמונה של כל חלקי הגוף הרלוונטיים במישור הנכון המוקדים.
  4. החזר את הזחלים למדיום הדגים להתאוששות לאחר ההדמיה.
tle "> 6. חיים הדמיה Confocal

  1. להרדים את הזחלים עם 0.01% Tricaine במדיום דגים עבור 5 - 10 דקות עד שהם נעשים משותקים.
  2. ממיסים נמוכה ההיתוך agarose 1.5% בטווח הבינוני דגים על ידי חימום במיקרוגל. מגניב פתרון זה כ -30 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 0.5 - 1 מ"ל של-התכה נמוכה נוזלי 1.5% agarose במדיום דגים בצלחת פטרי עם רצפת זכוכית. מעביר את הזחלים הרדימו לתוך התמיסה בעזרת פיפטה פלסטיק נקיה.
    הערה: קח זהירות מיוחדת כי הטמפרטורה של agarose ההתכה נמוכה הנוזלי היא נמוכה מספיק כדי לא לפגוע הזחלים.
  4. לפני agarose מתמצק, להשתמש microloader פלסטיק לדחוף את הזחלים אל החלק התחתון של צלחת פטרי להתמצא הזחלים בהתאם לאזור של עניין. האוריינטציה של הזחלים להשתמש בפרוטוקול זה הוא לרוחב.
    הערה: הדגימות מוכנות הדמית confocal לחיות לאחר agarose לחלוטין מבצרת.
  5. שימוש במיקרוסקופ confocal כדי ACQתמונות uire.
  6. השתמש בקו לייזר 543 ננומטר עבור מכתים mCherry ו ALC מנתח. השתמש בקו לייזר 488 ננומטר עבור nlGFP והכתים calcein מנתח.
  7. לאחר הדמיה, להוסיף בינוני דגים כדי בצלחת פטרי ולהשתמש זוג מחטים מזרק בסדר (27 x G ½ 1 ") כדי להסיר את הזחלים בזהירות מן agarose. מעבירים את הזחלים עם המצורפת residually agarose בצלחת פטרי עם המדיום דגים להתאושש .
  8. לעבד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מספרי ביצה שופעים, כמו גם את הגודל הקטן של הזחלים, להפוך medaka מודל מצוין הקרנת סמים. צלחת אחת שש גם שמשה לתרבות עד 36 זחלים, אשר היו מספיק כדי לספק נתונים בעלי משמעות סטטיסטית. יתרון גדול נוסף של שימוש דג לניתוח שלד הוא האפשרות לעשות הדמיה לחיות. השקיפות של זחלים דגים מאפשרת שימוש חלבוני ניאון לתייג תאי עצם, כמו גם שימוש בצבעים אשר נקלטים על ידי מטריקס עצם כדי להמחיש מינרליזציה. זחלי דג קלים לטפל, והכנת מדגם הדמיה היא פשוטה (איור 2).

RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP קו פעמיים מהונדס שימש כדי להמחיש את היווצרות אקטופי של osteoclasts הנגרמת RANKL. בנוסף, OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP זחלים משולשים מהונדסים שמשו בו זמנית לאתריון של אוסטאובלסטים מוקדמת osteoclasts בדיל (איור 3). התמונות סקירה צולמו עם סטראו (איור 3 א - C ו- F - H), בעוד מיקרוסקופיה confocal שימש לדמיין תהליכים ברמה התאית (איור 3D, E, I, ראשי חץ J). ALC מוכתם העצם מטריקס לאורך קשתות עצביים (נה) ו CENTRA (ג) (איור 3D) שימש כנקודת התייחסות כדי לקבוע את המיקום של תאי עצם שכותרתו fluorescently (איור 3D ואני).

יתרון של ביטוי חזותי osteoclasts ו אוסטאובלסטים זמנית באותו הזחלים שלמים הוא כי תרופתי לעומת פעילויות אנבוליים העצם של תרכובת נבדק ניתן להבחין. לשם כך, חלוקת osteoclasts ו אוסטאובלסטים נקבעה יחד קיימים ו שהוקם זה עתה מטריקס עצם mineralized. sucמכתים cessive של מטריקס העצם עם ALC (אדום) (איור 4 א, ב) ואחריו calcein (ירוק) (איור 4 ג ', ד') מגלה דה נובו מטריקס העצם mineralized (ירוק) (איור 4E, ראשי חץ F). assay זה מאפשר כימות של קצב היווצרות עצם. שיעורים גדלים דה נובו לאחר טיפול תרופתי מצביעים על אפקט anabolic-עצם של המתחם הנבדק. לעומת זאת, התמדה של נקודות מטריקס עצם קיימות לפעילות תרופתית של התרופה 27. שני תוויות ALC ו calcein ב הזחלים יציבות במשך שבועות לפחות, המאפשרות תצפית רציפה של היווצרות עצם החדשה זחלי medaka in vivo.

איור 2
איור 2: סכמטי תרשים של טיפול תרופתי, מכתים ALC Live ולאחר הרכבה הדמיה חיה Confocal. א. צלחת שש היטבמשמש טיפול תרופתי על מנת להבטיח מספיק מקום הזחלים. מטריצת עצם mineralized מוכתמת על ידי דוגרי זחלי medaka ב ALC 0.1% עבור 1.5 - 2 h בחושך. זחלים ויטראז הם שטופים כמה פעמים עם מדיום דגים. 0.01% Tricaine משמש להרדים זחלים. B. לאחר העברת זחלים מורדמים כדי פושר ונוזל 1.5% נמוכים היתוך agarose, עמד מותאמים עם microloader פלסטיק. הזחלים הם מכן עלו בהתאם לאזור של עניין (למשל, בעמודת החוליות היא הדמיה הטובה ביותר בתצוגה לרוחב). לאחר agarose יש הקרושה, מדגם רכוב הוא מוכן הדמיה confocal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ctsk: nlGFP ו OSX: ביטוי mCherry ב מהונדסים Medaka זחלים ב -10 DPF, ללא ואחרי ביטוי RANKL נגרמת הלם החום. AC. זחלים שליטים ללא אינדוקצית RANKL. ALC מוכתם מטריקס השלד (א); לציין את אותות הקרינה אוטומטית נוקב בשורה הממוקמת dorsally של תאי פיגמנט. ctsk: ביטוי nlGFP ב הראש והזנב (B) וחלוקת OSX: mCherry חיובי אוסטאובלסטים מוקדמת הגולגולת, עמודות בחוליות, סנפיר הזנב (C). D. מחסנית Confocal של האזור התאגרף ב A ו- B מראה בהעדר osteoclasts אקטופי ברחבי הקשתות העצביות (נה) ו CENTRA (ג) בשלב ההתפתחותי הזה. E. מחסנית Confocal של האזור התאגרף OSX מראה C: mCherry לבטא אוסטאובלסטים מוקדמת לאורך neuraקשתות l ו בקצוות של מלון סנטרה. Osteoclasts נעדר מתא המטען ללא אינדוקצית RANKL. FJ. הזחלים לאחר אינדוקציה RANKL ידי הלם חום בשעה 9 DPF. F. ALC מוכתם מטריקס השלד. G. ctsk: nlGFP -expressing osteoclasts להרכיב עמוד השדרה. ריבועים בסול להראות תמונות בודדות שצולמו בהגדלה גבוהה יותר כי מאוחות כדי לגרום התמונה המתחמת G. H. חלוקת OSX: mCherry לבטא בתאי אינה משתנה 1 ד לאחר אינדוקציה RANKL. אני. מחסנית Confocal של האזור התאגרף F ו- G מראה osteoclasts נגרם RANKL להרכיב סביב הקשתות העצביות, כמו גם מלון סנטרה (ראשי החץ). J. מחסנית Confocal של האזור התאגרף ctsk מראה H: nlGFP להביע osteoclasts ליד OSX: mCherry שכותרתו אוסטאובלסטים מוקדמת יחדהקשתות העצביות מלון סנטרה. ברים בקנה מידה A, B, C, F, G ו- H: 100 מיקרומטר. ברים בקנה מידה D, E, I ו- J: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ניתוח של דה נובו מינרליזציה של מטריקס העצם על ידי המכתים הרצוף של זחלים עם ALC ו Calcein ב -12 ו -15 DPF, בהתאמה. A, B. ALC מוכתם מטריקס השלד ב 12 DPF. C, D. Calcein מוכתם מטריקס השלד ב 15 DPF באותו הזחלים. E, F. תמונה ממוזגת מראה את החדש Mineralized מטריקס עצם בקץ הקשתות העצביות (הירוקה, חיצים). B, D, ו- F. מחסנית Confocal של האזור התאגרף A, C, ו- E, בהתאמה. ברים בקנה מידה A, C, ו- E: 100 מיקרומטר. ברים בקנה מידה B, D, ו- F: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: תמונות נציג מראות כושלות וכן מוצלח הרכבת הדמית Confocal. AC. לא מוצלח גובר בתוצאות agarose התכה נמוכה חלקי של המדגם (משמאל) שוכב מחוץ במישור המוקד. DF. הרכבה מוצלחת מראה כל Regiתוספות של עניין מטוס המוקד הזהה. ברי סולם: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: Alendronate טיפול מונעים עצם ספיג. ALC מוכתם מטריקס השלד ctsk: nlGFP להביע osteoclasts הזחלים medaka מהונדס ללא אינדוקציה RANKL (AC), עם ביטוי RANKL חום הנגרמת הלם (DF), ובתוספת של alendronate באותו יום כמו אינדוקציה RANKL (GI) . C, F, ואני. ערימות Confocal האזורים התאגרף ב A ו- B, D ו- E, G ו- H, בהתאמה.ג. ALC מוכתם עמודות בחוליות שלמות בלי אינדוקצית RANKL. F. RANKL מושרה, טופס osteoclasts -expressing ctsk ברחבי הקשתות העצביות מלון סנטרה, וכתוצאה מכך ספיגה המלא של מטריקס mineralized הקשתות העצביות (חיצים) והן פגמים כדי מלון סנטרה (ראשי החץ). G. התוספת של alendronate אין כל השפעה על ההיווצרות של ctsk: osteoclasts nlGFP להביע, אבל זה ספיג עצם חוסם ויוצא הקשתות העצביות מלון סנטרה ללא פגע. ברים בקנה מידה A, B, D, E, G ו- H: 100 מיקרומטר. ברים בקנה מידה C, F, ואני: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

זה חיוני כי התנאים לטיפול הלם חום הם עקביים ויציבים כאשר משווים מדגמים שונים. בתנאי טמפרטורה יציבים להבטיח רמות דומות של אינדוקצית RANKL ב הזחלים המהונדסים, וכתוצאה מכך, היווצרות osteoclast דומה, אשר יכול להיות מאושרת על ידי בדיקות סקר לאיתור ctsk: ביטוי nlGFP. בסופו של דבר, זה מוביל מידה דומה של ספיגת עצם אקטופי מושרה ונגעים דמוי אוסטאופורוזיס, כמו אומת על ידי מכתים ALC. כזה עיצוב ניסיוני אז מאפשר קביעת והשוואה של השפעות הסמים השונים אנטי resorptive או תרופה זהה מיושם בריכוזים שונים.

שינויים ופתרון בעיות

זחלי דגים הם מאוד שבירים וצריכים להיות מטופל בזהירות במהלך תהליך הרכבת הדמיה. עבור הדמיה confocal לחיות אופטימלי, הזחלים הם בקפידה positioned עם microloader פלסטיק, ולא מלקחיים, כדי למנוע פציעות (איור 2 ב). הארכת החלמון היא פחות רגישה למגע גירויים ניתן להשתמש כדי להתמצא הזחלים עם microloader, ובכך למנוע תנועת זחל במהלך גובר. האזור של עניין צריך להיות מותקן שטוח כדי להבטיח כי המדגם יכול להיות ממוקד במישור אחד מוקדים במהלך ההדמיה (איור 5). התנהגות תא עצם היא מאוד דינמית ומחייבת ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה במהלך ההדמיה לחיות. באופן אופטימלי, הזמן לשגות הדמיה על ידי ניתוח confocal היא רצוי לעקוב אינטראקציות osteoclast-אוסטאובלסטים במשך כמה שעות זחלי החיים. עם זאת, זה דורש תנאים מיוחדים כדי לשמור על הזחלים חיים בתנוחה קבועה. עבור הרדמה ממושכת, פתרון של Tricaine 0.001% בטווח הבינוני דגים מתווסף לכסות את הקרושה agarose במהלך ההדמיה. הדבר מונע את agarose מהתייבשות ומונע מתעוות פתאומי של הזחלים במהלך מתאר לעצמיהמתקיים במשך כמה שעות.

מגבלות של הטכניקה

אוסטאופורוזיס היא מחלה אשר משפיעה בעיקר לאדם זקן. לכן, אידאל במודל vivo להקרנת תרופה לאוסטאופורוזיס צריך לערב דגים בוגרים. עד כה, עם זאת, הטכניקה של הדמיה לחיות שתוארה בדו"ח זה מוגבל לשלבים העובריים זחל. נכון לעכשיו הדמיה confocal זמין אינו מאפשר הדמיה חיה של תאי עצם שכותרתו גנטית דגים בוגרים בשל מגבלות עומק החדירה. ההתפתחות האחרונה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון האור (LSFM), אשר מאפשר הדמיה עמוקה לתוך רקמת חיה, יחד עם הזמינות של "שקוף" זני medaka פיגמנט פחות, עושה את זה מתקבל על דעת כי מגבלה זו תהיה להתגבר בקרוב, הדמית חיה של תאי עצם בדגי medaka מבוגרים לאחר הקרנת סמים יהיו אפשריים.

משמעות של הטכניקה ביחס קיים / האלטרנטיבי Methods

שילוב ייחודי של הדמית חית כלים גנטיים מתקדמים הפך דגי teleost קטנים פופולריים למחקר ביו - מחקר עצם בפרט - וכפי במודלי vivo להקרנת סמים. עם האפשרות לנתח אינטראקציות בין תאים בתוך אורגניזם שלם, קווי medaka מהונדסים הם מתאימים באופן ייחודי עבור הדמית החיה של תהליכים תאיים דינמיים במהלך דוגמנות ושיפור עצם. כי הם חולקים רשתות גנים-ורגולטוריים לשליטת הומאוסטזיס עצם עם יונקים, במחקרי vivo ב medaka יכול להשלים ואף תעלה במבחנה באמצעות אוסטאובלסטים יונקים מבחנים-תרבית תאי osteoclast.

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו

מלבד בדיקת תרכובות יחידות רקע מהונדס, כמתואר בפרוטוקול זה, דגים מציעים גם גישות פשוטות לבחון שילובים של vaתרופות rious לסינרגיה או הפרעה אפשרית של תרכובות. יתר על כן, שימוש שילוב של קווי כתב שונים, למשל, בהקשר של רקע מוטציה מסוים, מספק הזדמנויות רבות ללמוד את ההתנהגות של תאי עצם בשלבים שונים של ניוון עצם ותיקון, או בנוכחות של עצם תרופת -modulating. עם התכונות הייחודיות שלה המשלימים מבחני עכבר, מודל אוסטאופורוזיס medaka מספק מעולה בגישת vivo לבחון ולכמת את אנבוליים ואפקטים תרופתיים של תרכובות עצם-ויסות רומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או פיננסיים.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי תרומות של סינגפור משרד החינוך (משרד החינוך, מספר מענק 2013-T2-2-126) והמכון הלאומי לבריאות, ארה"ב (NIH, להעניק מספר 1R21AT008452-01A1). TY קיבל מלגה לתואר שני מהמחלקה NUS של מדעי הביולוגיה. אנו מודים יחידת confocal של מרכז NUS למדעי bioimaging (CBIS) בתמיכה המתמשכת שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alendronate  Sigma A4978
alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone Sigma A3882
Calcein Sigma C0875
ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) Sigma A5040
ImageJ (1.4.3.67) National Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
LSM 510 Meta confocal  Zeiss
LSM Image Browser (4.2.0.121) Zeiss http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html
Micro-loader Eppendorf 5242956003 Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL
NIS-Elements BR 3.0 software Nikon
Photoshop CS6 (13.0.0.0) Adobe
SMZ1000 stereomicroscope  Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
  2. Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
  3. Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
  4. Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
  5. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
  6. Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
  7. Charles, J. F., Aliprantis, A. O. Osteoclasts: more than 'bone eaters. Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).
  8. DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
  9. Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
  10. Eriksen, E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).
  11. Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
  12. Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
  13. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
  14. Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
  15. Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
  16. Komori, T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).
  17. Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
  18. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  19. Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  20. Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
  21. Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
  22. Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
  23. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  24. To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
  25. Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
  26. Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
  27. Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 119 הדמיה לחיות אוסטאובלסטים osteoclast מכתים עצם חי שיפוץ העצם אוסטאופורוזיס Medaka ביספוספונטים תרופות אנטי-resorptive
ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, T., Winkler, C. Drug Treatment… More

Yu, T., Winkler, C. Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model. J. Vis. Exp. (119), e55025, doi:10.3791/55025 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter