Abstract
Osso formando osteoblastos interagir com osteoclastos de reabsorção óssea para coordenar o volume de negócios da matriz óssea e para controlar a homeostase esquelética. Medaka e larvas de peixe-zebra são amplamente usadas para analisar o comportamento de células de osso durante a formação óssea, a degeneração, e reparação. A sua clareza óptica permite a visualização das células ósseas marcado fluorescentemente e corantes fluorescentes ligados à matriz óssea mineralizada. O nosso laboratório tem gerado Medaka peixes transgénicos que expressam o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível de choque de calor. A expressão ectópica de RANKL resulta na formação de excesso de osteoclastos activados, que podem ser visualizados em linhas com expressão repórter nlGFP sob o controlo do promotor K (CTSK) catepsina. indução RANKL e formação de osteoclastos ectópica leva a fenótipos osteoporose-like graves. Composto li medaka transgênicones que expressam CTSK: nlGFP em osteoclastos, assim como mCherry sob o controlo do osterix (OSX) promotor em osteoblastos prematuros, pode ser utilizado para estudar a interacção de ambos os tipos de células. Isto facilita a observação in vivo do comportamento celular sob condições de degeneração óssea e de reparação. Aqui, nós descrevemos a utilização deste sistema para testar um fármaco utilizada em terapia de osteoporose humana e descrever um protocolo de imagens ao vivo. O modelo Medaka complementa os estudos em cultura de células e ratinhos, e oferece um novo sistema para a análise in vivo da acção do fármaco no sistema esquelético.
Introduction
O esqueleto dos vertebrados proporciona um suporte estrutural e a protecção de órgãos, permite a mobilidade, e serve como uma fonte de cálcio. Ao longo da vida, a matriz óssea extracelular é continuamente virado para manter a estabilidade óssea e rigidez. Este processo requer a actividade fortemente coordenada e interacção de osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Os osteoblastos são derivados de células progenitoras mesenquimais multipotentes e produzir colagénio para formar o osteóide, a parte proteica da matriz óssea 10. Os osteoblastos interagir com osteoclastos para alcançar uma actividade equilibrada de ambos os tipos de células, que é necessária para controlar a homeostase óssea 7. Devido a essas interações reguladoras complexas, as respostas ao tratamento medicamentoso e homeostase óssea não pode ser plenamente examinadas usando estudos in vitro. Deste modo, existe uma forte procura de modelos animais. Em comparação com as configurações de cultura de células, em modelos in vivo pode fornecerinsights valiosos sobre as redes multicelulares dentro do ambiente de osso.
Numerosos modelos de ratinho para existir uma variedade de perturbações ósseas, incluindo osteoporose humanos 16. No entanto, o tamanho ea acessibilidade de embriões de camundongos representam limitações significativas para geração de imagens ao vivo de processos esqueléticos. Peixes teleósteos pequeno, por outro lado, servir como uma alternativa atraente para imagiologia in vivo. Peixe-zebra (Danio rerio) e medaka (Oryzias latipes) tornaram-se modelos animais populares para pesquisa esquelética durante as últimas duas décadas 17, 19, 22, 24. Osso em peixes teleósteos e em mamíferos é muito semelhante, tanto em um estrutural como a nível fisiológico, e muitos dos genes reguladores-chave e as vias de sinalização são conservados 3. Como em mamíferos, peixes teleósteos regular cuidadosamente a actividade dos osteoblastos e osteoclastos para equilibrar a formação óssea e reabsorção 26. Mais importante ainda, a clareza óptica de fiSH larvas permite o uso de repórteres fluorescentes para marcar células ósseas e a matriz calcificada esquelético 8, 9, 12, 21, 23, o que facilita a observação de processos celulares em animais vivos. Além disso, uma série de ferramentas genéticas foi gerado para facilitar a pesquisa biomedicamente relevante em peixes. Para medaka em particular, métodos para mutação do gene alvo de CRISPR / Cas9 2, rastreamento de 6 células de linhagem, e site-specific transgênese 14 foram recentemente estabelecidas e são agora amplamente em uso 15.
Larvas teleósteos pequena têm sido usadas com sucesso para as telas de químicos, o que levou à descoberta de várias drogas farmacologicamente relevantes 1, 18.
Larvas de peixes são tolerantes a baixas concentrações de DMSO e são capazes de absorver compostos de seu ambiente aquático, através da pele ou através do tracto gastrointestinal de 1, 5. Nosso laboratório anteriormente reported medaka linhas transgénicas que expressam repórteres fluorescentes em células ósseas, sob o controlo de vários osteoblast- e promotores específicos de osteoclastos. Estes incluem osteoblastos prematuros (colágeno 10A1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclastos (catepsina K, CTSK) 24. Nós também gerou uma linha transgénica que expressa o factor de indução de osteoclastos Activador do Receptor de factor nuclear kB-ligando (RANKL), sob o controlo de um promotor induzível por choque térmico-24.
Indução de RANKL neste sistema resulta na formação ectópica de osteoclastos activos. Isto leva a um aumento da reabsorção óssea e um fenótipo semelhante a osteoporose grave, com mineralização drasticamente reduzida nos corpos vertebrais. Recentemente, mostrou que a actividade dos osteoclastos neste modelo pode ser bloqueada pelo etidronato bisfosfonatos e alendronato, TWO drogas comumente usadas no tratamento da osteoporose humana, validando assim medaka como um sistema modelo adequado para a osteoporose 27.
Devido ao seu grande tamanho de ninhada, o rápido desenvolvimento, e pequeno tamanho de embriões, larvas Medaka transgénicos são exclusivamente adequados para o rastreio em larga escala de drogas da osteoporose e para a análise in vivo de comportamento de células ósseas. Estudos em medaka, portanto, pode eficientemente complementar experiências em culturas de células e em camundongos que visam a descoberta de novos alvos terapêuticos e novas terapias para doenças ósseas humanas.
No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para tratar larvas osso repórter medaka com a droga osteoporose comum, o alendronato. Nós também descrevem em detalhes como larvas tratadas estão montados e preparados para a imagens ao vivo da matriz óssea e células ósseas. Estes protocolos podem ser facilmente adaptada a outros compostos químicos pequenos, que tanto trabalho como anabolizante do tecido ósseo ou drogas anti-reabsorção. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura (R14-293).
1. Os peixes Pecuária e à colheita de embriões
- Levante WT, CTSK: nlGFP 24, RANKL: HSE: PCP 24, e OSX: mCherry 21 simples ou peixe medaka composto transgénico a 26 ° C sob um ciclo de luz controlada (14 h de luz, 10 h escuro) para induzir a desova.
- desova diária ocorre durante os primeiros 30 minutos após a luz é ligado. Os ovos ficar juntos através de filamentos e anexar ao abdômen da fêmea por várias horas. Use uma rede de malha fina para pegar uma fêmea adulta que transporta um conjunto de ovo. Deixe o peixe descansar brevemente na rede e, em seguida, massageie suavemente o abdômen do peixe para retirar cuidadosamente o cluster óvulo fertilizado do abdome da fêmea.
NOTA: Uma fêmea medaka saudávelpode produzir 10 - 20 ovos por dia durante cerca de 5 meses. - Coloque os ovos em uma 60 mm plástico placa de Petri. Usar uma pipeta de plástico para lavar os embriões com 5-10 ml de de 0,3x Danieau forma de solução (peixe; NaCl 19,3 mM, KCl 0,23 mM, MgSO4 0,13 mM, Ca 0,2 mM (NO 3) 2, e 1,7 mM de HEPES, pH 7.0). Adicionar 1 ml de uma 0,25% (w / v) de solução azul de metileno estoque para 2,5 L de meio de peixes para prevenir o crescimento de fungos.
- Rode ligeiramente aglomerado de ovo para formar um nó de filamentos de fixação. Use uma pinça para remover cuidadosamente os filamentos de fixação dos aglomerados de ovos fertilizados para obter embriões individuais (Figura 1A).
- Estágio os embriões de acordo com Iwamatsu 2004 13.
- Cultura 20 - 30 embriões por 60 milímetros de plástico em placas de Petri de 28 ° C incubadora. Alterar a média diária para assegurar o desenvolvimento normal dos embriões.
NOTA: O tempo em volta do palco para incubação (8-9 d pós-fertilização,DPF) é especialmente crítica para a sobrevivência. Remover córions de livre flutuação para manter o meio limpo e para garantir boas taxas de sobrevivência das larvas.
2. Rastreio Embryo Transgenic
- Use um estereomicroscópio equipado com uma lâmpada de mercúrio para imagens de fluorescência e GFP, RFP, e os filtros da PCP para a tela embriões transgênicos para a expressão repórter fluorescente utilizando 40X.
- Identificar visualmente OSX: embriões mCherry por expressão repórter mCherry no início de formação de ossos cranianos, tais como o cleitro, em ambos os lados da cabeça posterior (Figura 1B, seta), e o parasphenoide, numa posição central no crânio ventral ( Figura 1B, cabeça de seta).
NOTA: expressão Reporter começa a partir de 5 DPF em diante 21. - Identificar CTSK: embriões nlGFP por expressão nlGFP forte na cabeça (Figura 1C, seta) e uma cauda (Figura 1C, seta), a partir de6 DPF.
NOTA: osteoclastos endógenos formam apenas depois de 21 DPF. células neste estágio inicial (6 DPF) nlGFP expressando não são osteoclastos, mas outra, até agora não caracterizada, CTSK células -positivas 24. - Identificar RANKL: HSE: PCP embriões transgénicos por expressão ubíqua PCP depois de um tratamento a curto choque térmico durante 20 min a 39 ° C, conduzida em duas DPF ou posterior para fins de rastreio.
NOTA: A RANKL e PCP transgenes estão sob o controle do mesmo bidirecional Choque elemento térmico (HSE). Expressão PCP indica indução bem-sucedida RANKL 24. - Executar uma 1,5-2 h tratamento de choque térmico a 9 DPF ou mais tarde, para induzir um grande número de osteoclastos ectópica na região do tronco, o que consequentemente resulta em um fenótipo osteoporose-like 24.
NOTA: expressão RANKL Transgenic induzida em 9 resultados da DPF em uma ativação ectópica de células progenitoras osteoclastos dormentes, que endogenamente não é acionadoantes de 21 de DPF. Usar um banho de água para se obter condições estáveis a 39 ° C. Deixe as placas de Petri contendo embriões medaka flutuar na superfície da água. Certifique-se a tampa da placa de petri é seco, para impedir o afundamento do prato. - Embriões de tela de linhas compostas, tais como RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP double-transgênica e OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP triple-transgênica, de acordo com o padrão de cada transgene indivíduo expressão.
NOTA: embriões transgênicos hemizygous e homozigotos foram distinguidos por diferentes níveis de fluorescência do transgene repórter. embriões homozigóticos tinham uma intensidade de fluorescência que aproximadamente duplicou em comparação com a de transgênicos hemizigóticas. Linhas de compostos que eram homozigotos para ambos RANKL: HSE: PCP e CTSK: nlGFP foram obtidos por incrossing repetido ao longo de várias gerações. Para triple-transgênica OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP, RANKL homozigoto: HSE: PCP / CTSK: peixes nlGFP foram cruzados com OSX homozigoto: portadores mCherry. A progênie triple-transgênico heterozigoto resultante foram levantadas e incrossed obter embriões homozigotos para RANKL: HSE: PCP. O RANKL: HSE: PCP transgene deve ser homozigótica, a fim de obter a indução eficiente de osteoclastos ectópicas.
Figura 1: WT e Transgenic Medaka embriões em 7 D pós-fertilização (DPF). Uma. embriões WT observado com iluminação de campo claro. B. Embriões transgênicos mostrando OSX: Expressão mCherry em torno do cleithrum (seta) e paresfenóide (ponta de seta). C. Embriões transgênicos mostrando CTSK: Expressão nlGFP na cabeça (seta) ea cauda (ponta de seta). Barras de escala: 500 mm.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Tratamento com bisfosfonatos de Medaka Larvas
- Prepare soluções contendo concentrações diferentes de bisfosfonatos (BPS) para os estudos de dose-resposta.
NOTA: A BP exemplar utilizado neste protocolo é alendronato.- Dissolve-se o alendronato em forma de peixe a uma concentração de 100 ug / mL para preparar uma solução de reserva.
- Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Guardar a solução estoque a 4 ° C.
- Preparar soluções de trabalho diferentes por diluição da solução de estoque com meio peixes a uma série de concentrações (isto é, 25, 37,5, 50, 62,5, e 75 ug / mL).
NOTA: Diferentes drogas podem ter diferentes absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) parâmetros, que devem ser considerados durante o teste usando este sistema larvas medaka. Além disso, a solubilidade do fármaco e a estabilidade pode variar quandoaplicado como uma solução aquosa. compostos menos solúveis em água pode ser necessário primeiro ser dissolvido em solventes orgânicos, tais como DMSO. Neste caso, uma solução de reserva é preparada em DMSO, que é, em seguida, diluídas em meio de peixe. Note-se que as soluções de trabalho em água (meio de peixe) podem ser armazenadas no frigorífico durante várias semanas. No entanto, as soluções contendo DMSO deve ser armazenado à temperatura ambiente para evitar a cristalização.
- Transferência larvas Medaka em placas de seis poços (seis larvas / poço) para o tratamento subsequente BP (alendronato).
- Remover cuidadosamente a forma de peixe, usando uma pipeta de plástico limpo e adicionar um pequeno volume (aprox. 0,5 mL) de uma solução de alendronato a cada poço.
- Evite médio de peixe de sobra, como a solução BP acrescentou pode ser diluído, o que é especialmente crítico para soluções de alendronato menos concentradas.
- Retirar uma pequena quantidade da solução de alendronato (até 0,5 ml) de cada poço com uma pipeta de plástico limpo e substituí-la com um volu maior-me (4 mL) de uma solução de alendronato.
- Alterar média diária para assegurar o desenvolvimento normal embriões.
4. Coloração ao vivo de matriz mineralizada-bone
- Dissolve-se 0,5 g de Alizarina complexona (ALC; ácido alizarina-3-metiliminodiacético) ou 0,05 g de calceína em 50 mL de meio de peixe para preparar 1% e 0,1% de soluções de reserva, respectivamente. Usar um misturador de vórtice para garantir a dissolução completa.
NOTA: médio dos peixes sem a adição de azul de metileno é utilizado neste e nos passos subsequentes para reduzir autofluorescência nas larvas. - Usar um filtro de seringa e de utilização única (0,2 uM) para filtrar a solução de coloração. Guardar a solução filtrada no escuro à temperatura ambiente.
NOTA: A cor da solução de coloração filtrada, claro ALC é amarelo escuro ao laranja. A cor da solução filtrada calceína, é claro amarelo brilhante. As soluções podem ser utilizadas para vários meses. - Diluir a ALC ou estoque calceína solução filtrada 1:10 em meio peixese incubar as larvas Medaka durante 1,5 - 2 h (0,1% de solução de ALC) ou 2 - 2,5 h (solução calceína 0,01%) numa incubadora de 28 ° C se larvas entre 9 e 17 são utilizados DPF. Manter as amostras no escuro.
- Transferir as larvas e médio peixe fresco com uma pipeta de plástico limpo.
- Remover o meio peixe com uma pipeta de plástico limpo e adicionar meio de peixe fresco. Repita este passo para 3 - 4 vezes até que nenhuma solução vermelhos ou amarelo-manchado (ALC ou calceína, respectivamente) é mais de esquerda. Deixar as larvas de peixe no meio durante 30 - 60 minutos antes da sua montagem para evitar a imagiologia de epifluorescência a partir do meio.
NOTA: 0,1% de solução de coloração ALC é prejudicial para as larvas medaka para tempos de exposição prolongados. Os tempos de incubação de 2 h mais longo do que afectam a sobrevivência das larvas. A concentração e o tempo de coloração, por conseguinte, precisa de ser optimizada para diferentes fases de modo a atingir óptimos de sobrevivência de embriões de coloração e resultados.
5. Ao vivo Fluorescência de imagem p>
- Anestesiar as larvas Medaka com 0,01% tricaina (acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo) em forma de peixe.
NOTA: Anestesiados larvas ficam imobilizados após 5 - 10 min em solução tricaina e, geralmente, estão encontrando-se tanto em seus lados ou as costas. - Usar um microloader plástico para orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral.
- Use uma lupa com iluminação de fluorescência para imagiologia. Use ampliação alta quando tirar fotografias, com foco em diferentes partes do larvas (cabeça, tronco anterior, posterior do tronco e cauda). Costure imagens individuais juntos em regiões de sobreposição usando um software de processamento de imagem adequado (inserções na Figura 3G).
NOTA: Isso ajuda a melhorar a qualidade de imagem de todas as partes do corpo relevantes no plano focal correto. - Retornar as larvas para o meio dos peixes para a recuperação após Imaging.
- Anestesiar as larvas com 0,01% tricaina em meio peixe para 5 - 10 min até que eles ficam imobilizados.
- Dissolver baixo ponto de fusão de agarose a 1,5% em meio de peixe por aquecimento num forno de microondas. Arrefecer esta solução a aproximadamente 30 ° C.
- Adicionar 0,5-1 mL de líquido de 1,5% baixo ponto de fusão de agarose em meio peixe para uma placa de Petri com fundo de vidro. Transferir as larvas anestesiados para dentro da solução, utilizando uma pipeta de plástico limpo.
NOTA: Tome precaução especial que a temperatura da agarose de baixo ponto de fusão líquida é suficientemente baixa para não prejudicar as larvas. - Antes de os solidifica agarose, usar um microloader plástico para empurrar as larvas para o fundo da placa de Petri e orientar as larvas de acordo com a região de interesse. A orientação das larvas utilizadas no presente protocolo é lateral.
NOTA: As amostras estão prontas para geração de imagens ao vivo confocal após a agarose solidifica completamente. - Use um microscópio confocal para ACQimagens ùire.
- Use uma linha de laser 543 nm para análises mCherry e ALC coloração. Use uma linha de laser 488 nm para nlGFP e analisa coloração calceína.
- Após a imagiologia, adicionar meio de peixe para a placa de Petri e usar um par de agulhas finas de seringa (27 G x 1½ "), para remover cuidadosamente as larvas da agarose. Transferência das larvas com residualmente ligado agarose para uma placa de Petri com meio de peixe para recuperar .
- Processar as imagens usando uma imagem de software de análise 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abundante número de ovos, bem como o pequeno tamanho das larvas, fazer Medaka um excelente modelo para o rastreio de drogas. Uma placa de seis poços único foi utilizada para a cultura até 36 larvas, o que foi suficiente para proporcionar dados estatisticamente significativos. Outra grande vantagem do uso de peixes para análise esquelético é a possibilidade de fazer imagens ao vivo. A transparência das larvas de peixes permite a utilização de proteínas fluorescentes para marcar as células ósseas, bem como a utilização de corantes que se ligam a matriz de osso, a fim de visualizar a mineralização. Larvas de peixes são fáceis de manusear, e a preparação da amostra para a imagem latente é simples (Figura 2).
A RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP linha dupla-transgênica foi usado para visualizar a formação ectópica de osteoclastos induzida por RANKL. Além disso, OSX: mCherry / RANKL: HSE: PCP / CTSK: nlGFP larvas triplo-transgénicos foram usadas para detectar a simultâneaion de osteoblastos e osteoclastos prematuros diferenciadas (Figura 3). Visão geral imagens foram tiradas com um estereomicroscópio (Figura 3A - C e F - H), ao passo que a microscopia confocal foi utilizada para visualizar os processos a nível celular (Figura 3D, E, I, J) setas. Matriz óssea ALC-coradas ao longo dos arcos neurais (Na) e Centra (C) (Figura 3D) foi utilizado como referência para determinar a posição das células ósseas marcadas por fluorescência (Figura 3D e I).
Uma vantagem de se visualizar simultaneamente os osteoclastos e osteoblastos no mesmo larvas intacta é de que o anti-reabsorção do osso actividades contra-anabólico de um composto de teste pode ser distinguido. Por isso, a distribuição de osteoclastos e osteoblastos é determinada ao longo de matriz óssea mineralizada pré-existente e recentemente formado. Succoloração sucessivas da matriz óssea com ALC (vermelho) (Figura 4A, B), seguido de calceína (verde) (Figura 4C, D) revela de matriz novo mineralizada óssea (verde) (setas Figura 4E, F). Este ensaio permite a quantificação da velocidade de formação óssea. O aumento das taxas de novo após o tratamento medicamentoso indicam um efeito anabólico ósseo-do composto testado. Em contraste, a persistência de pontos de matriz óssea pré-existentes para uma actividade anti-reabsorção do fármaco 27. Ambos os marcadores de calceína em ALC e as larvas são estáveis durante pelo menos duas semanas, permitindo uma observação contínua da nova formação de osso em larvas Medaka in vivo.
Figura 2: Diagrama esquemático de tratamento da toxicodependência, ao vivo ALC Coloração e montagem para Confocal imagens ao vivo. Uma. Uma placa de seis poçosé utilizado para o tratamento químico para assegurar espaço suficiente para as larvas. A matriz mineralizada-osso é corado por incubação de larvas Medaka em 0,1% ALC, durante 1,5 - 2 h, no escuro. larvas manchado são lavadas várias vezes com meio peixe. 0,01% tricaina é utilizada para anestesiar larvas. B. Após a transferência das larvas anestesiados a morno e líquido de 1,5% de agarose de baixo ponto de fusão, a sua posição é ajustada com um microloader plástico. As larvas são então montados de acordo com a região de interesse (por exemplo, a coluna de vertebrado é fotografada melhor na vista lateral). Após a agarose foi solidificada, a amostra montada está pronto para imagiologia confocal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:
Figura 4: Análise de De Novo mineralização da matriz óssea pela coloração sucessiva de larvas com ALC e Calce�a aos 12 e 15 DPF, respectivamente. A, B. ALC-manchado matriz esquelética às 12 DPF. C, D. Calceina-coradas matriz esquelética de 15 DPF no mesmo larvas. E, F. imagem mesclada mostrando o recém-mineralized matriz óssea nas pontas dos arcos neurais (verde, setas). B, D, e F. Pilha confocal da área de caixa em A, C, e E, respectivamente. As barras de escala em A, C e E: 100 uM. As barras de escala em B, D, e F: 50 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens representativas Mostrando um sem êxito e uma bem sucedida montagem para confocal Imaging. AC. Vencida de montagem no resultado de agarose de baixo ponto de fusão, em parte da amostra (à esquerda) que se encontram fora do plano focal. DF. montagem bem sucedida que mostra toda a regiComplementos de interesse no mesmo plano focal. Barras de escala: 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O alendronato tratamento evita reabsorção óssea. ALC-coradas matriz esquelética e CTSK: nlGFP-expressando osteoclastos em larvas Medaka transgénico sem indução de RANKL (CA), com a expressão de calor RANKL induzida por choque (DF), e com a adição do alendronato no mesmo dia que a indução de RANKL (GI) . C, F e I. Pilhas confocal do áreas encaixotados em A e B, D e E, G e H, respectivamente.C. ALC-manchado colunas vertebrais intactos sem indução RANKL. F. , A forma induzida por RANKL CTSK -expressing osteoclastos em torno dos arcos neurais e o Centra, resultando na reabsorção completa da matriz mineralizada dos arcos neurais (setas) e em defeitos ao Centra (pontas de seta). G. A adição de alendronato não tem qualquer efeito sobre a formação de CTSK: osteoclastos nlGFP-expressam, mas bloqueia a reabsorção óssea e deixa os arcos neurais e o Centra intacta. As barras de escala em A, B, D, E, G, e H: 100? M. As barras de escala em C, F e I: 50? M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo
É essencial que as condições para o tratamento de choque térmico são consistentes e estável quando se comparam amostras diferentes. Condições de temperatura estáveis garantir níveis semelhantes de indução RANKL nas larvas transgénicos e, consequentemente, a formação de osteoclastos comparável, que pode ser confirmada por rastreio para CTSK: nlGFP expressão. Em última análise, isso leva a um grau semelhante de reabsorção óssea induzida ectópica e lesões osteoporose semelhante, como validada por coloração com ALC. Tal desenho experimental, em seguida, permite a determinação e a comparação dos efeitos de várias drogas anti-reabsorção ou o mesmo fármaco aplicado em diferentes concentrações.
Modificações e resolução de problemas
larvas de peixes são muito frágeis e devem ser manuseados com cuidado durante o processo de montagem para a imagem latente. Para imagiologia confocal vivo óptima, larvas são cuidadosamente positioned com um microloader de plástico, em vez de uma pinça, a fim de evitar lesões (Figura 2B). A extensão da gema é menos sensível ao toque estímulos e pode ser utilizado para orientar as larvas com um microloader, evitando desse modo o movimento das larvas durante a montagem. A região de interesse deve ser montada plana para garantir que a amostra pode ser focada num plano focal durante imagiologia (Figura 5). o comportamento das células do osso é muito dinâmico e requer alta resolução temporal e espacial durante a imagem ao vivo. Optimamente, a imagiologia de lapso de tempo por meio de análise confocal é desejada a seguir interacções osteoblastos-osteoclasto ao longo de várias horas, em que as larvas de estar. No entanto, isto exige condições especiais para manter as larvas vivas e numa posição fixa. Para anestesia prolongada, uma solução de 0,001% tricaina em forma de peixe é adicionado para cobrir o solidificado de agarose durante o exame. Isso impede que a agarose de secar e impede súbita contração das larvas durante imagção ao longo de várias horas.
Limitações da técnica
A osteoporose é uma doença que afeta principalmente os seres humanos idosos. Portanto, um ideal em modelo vivo para a seleção da droga da osteoporose deve envolver peixes adultos. Até agora, no entanto, a técnica de imagens ao vivo descritos no presente relatório se limita aos estágios embrionários e larval. Actualmente imagens disponíveis confocal não permite imagens ao vivo de células ósseas geneticamente marcadas em peixes adultos devido às limitações na profundidade de penetração. O desenvolvimento recente da folha de luz microscopia de fluorescência (LSFM), que permite imagens profundamente em tecidos vivos, juntamente com a disponibilidade de menos "see-through" cepas medaka pigmentadas, faz com que seja possível que esta limitação em breve ser superada, e imagens ao vivo de células ósseas em peixes medaka adulto após a seleção da droga será possível.
Importância da Técnica em Matéria de Existente / Alternative Métodos
Uma combinação única de imagens ao vivo e ferramentas genéticas avançadas fez pequenos peixes teleósteos popular para a investigação biomédica - a investigação óssea em particular - e, como em modelos in vivo para o rastreio de drogas. Com a possibilidade de analisar as interacções célula-célula dentro de um organismo intacto, linhas medaka transgénicos são particularmente adequada para a imagiologia vivo de processos celulares dinâmicos durante a modelagem e remodelação óssea. Porque eles compartilham muitas redes de genes-regulação para controlar a homeostase óssea com mamíferos, estudos in vivo em medaka pode complementar e até superar os estudos in vitro utilizando osteoblastos mamíferos e ensaios de cultura de células de osteoclastos.
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
Diferente de testar compostos isolados em um fundo transgênica, conforme descrito neste protocolo, o peixe também oferecem abordagens simples para examinar combinações de vadrogas rious para eventuais sinergias ou interferência de compostos. Além disso, a utilização de uma combinação de diferentes linhas repórter, por exemplo, no contexto de um fundo mutante particular, proporciona muitas oportunidades para estudar o comportamento de células de osso, durante diferentes fases da degeneração óssea e de reparação, ou na presença de um osso drogas -modulating. Com suas características únicas que complementam ensaios de rato, o modelo medaka osteoporose proporciona um excelente na abordagem vivo para testar e quantificar o efeitos anabólicos e anti-reabsorção de novos compostos moduladores ósseas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou financeiras.
Acknowledgments
Este projecto foi financiado por doações do Ministério Singapore da Educação (MOE, número de concessão 2013-T2-2-126) e do Instituto Nacional de Saúde, EUA (NIH, conceda número 1R21AT008452-01A1). TY recebeu uma bolsa de pós-graduação do Departamento de Ciências Biológicas NUS. Agradecemos a unidade confocal do Centro de Ciências NUS bioimaging (CBIS) pelo seu apoio constante.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O.
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F.
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T.
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
